Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Karakterisering av en patogen Escherichia coli-stamme avledet fra Oreochromis spp. Gårder ved bruk av helgenomsekvensering

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

Gjennomførbarheten av helgenomsekvenseringsstrategier (WGS) ved hjelp av stasjonære instrumenter har forenklet genomundersøkelsen av hver mikrobe av folkehelserelevans i en laboratorieinnstilling. En metodologisk tilpasning av arbeidsflyten for bakteriell WGS er beskrevet og en bioinformatikk rørledning for analyse er også presentert.

Abstract

Akvakultur er en av de raskest voksende matproduserende sektorene over hele verden, og tilapia (Oreochromis spp.) oppdrett utgjør den store ferskvannsfisksorten som dyrkes. Fordi akvakulturpraksis er utsatt for mikrobiell forurensning avledet fra menneskeskapte kilder, er det nødvendig med omfattende antibiotikabruk, noe som fører til at akvakultursystemer blir en viktig kilde til antibiotikaresistente og patogene bakterier av klinisk relevans som Escherichia coli (E. coli). Her ble den antimikrobielle resistensen, virulensen og mobilomegenskapene til en patogen E. coli-stamme , gjenfunnet fra innlandsoppdrettet Oreochromis spp., belyst gjennom helgenomsekvensering (WGS) og i silico-analyse . Antimikrobiell følsomhetstesting (ASAT) og WGS ble utført. Videre ble fylogenetisk gruppe, serotype, multilokussekvenstyping (MLST), ervervet antimikrobiell resistens, virulens, plasmid og profaginnhold bestemt ved hjelp av forskjellige tilgjengelige webverktøy. E. coli-isolatet viste bare mellomliggende følsomhet for ampicillin og ble karakterisert som ONT: H21-B1-ST40-stamme ved WGS-basert skriving. Selv om bare et enkelt antimikrobielt resistensrelatert gen ble detektert [mdf (A)], ble flere virulensassosierte gener (VAGs) fra den atypiske enteropatogene E. coli (aEPEC) patotypen identifisert. I tillegg ble lasten av plasmidreplikoner fra store plasmidgrupper og 18 profagassosierte regioner oppdaget. Avslutningsvis gir WGS-karakteriseringen av et aEPEC-isolat, gjenvunnet fra et oppdrettsanlegg i Sinaloa, Mexico, innsikt i dets patogene potensial og den mulige helserisikoen ved å konsumere rå akvakulturprodukter. Det er nødvendig å utnytte neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS) for å studere miljømikroorganismer og å vedta et helseramme for å lære hvordan helseproblemer oppstår.

Introduction

Akvakultur er en av de raskest voksende matproduserende sektorene over hele verden, og produksjonspraksis er ment å tilfredsstille den økende etterspørselen etter mat til konsum. Den globale akvakulturproduksjonen er tredoblet fra 34 millioner tonn (Mt) i 1997 til 112 Mt i 20171. De viktigste artsgruppene, som bidro til nesten 75% av produksjonen, var tang, karpe, muslinger, steinbit og tilapia (Oreochromis spp.) 1. Utseendet til sykdommer forårsaket av mikrobielle enheter er imidlertid uunngåelig på grunn av intensivt oppdrett, noe som fører til potensielle økonomiske tap2.

Antibiotikabruk i oppdrettspraksis er kjent for å forebygge og behandle bakterielle infeksjoner, den viktigste begrensende faktoren i produktivitet 3,4. Ikke desto mindre akkumuleres resterende antibiotika i akvakultursedimenter og vann, utøver selektivt trykk og modifiserer de fiskeassosierte og de bosatte bakteriesamfunnene 5,6,7,8. Følgelig fungerer oppdrettsmiljøet som et reservoar for antimikrobielle resistensgener (ARGs), og videre fremvekst og spredning av antibiotikaresistente bakterier (ARB) i det omkringliggende miljøet9. I tillegg til de bakterielle patogenene som ofte observeres som påvirker oppdrettspraksis, oppstår ofte medlemmer av Enterobacteriaceae-familien, inkludert humane patogenstammer av Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., og Salmonella spp.10. E. coli er den vanligste mikroorganismen isolert fra fiskemel og vann i fiskeoppdrett 11,12,13,14,15.

E. coli er en allsidig gram-negativ bakterie som bor i mage-tarmkanalen hos pattedyr og fugler som et kommensalt medlem av deres tarmmikrobiota. Imidlertid har E. coli en svært adaptiv kapasitet til å kolonisere og vedvare i forskjellige miljønisjer, inkludert jord, sedimenter, mat og vann16. På grunn av gengevinst og tap gjennom fenomenet horisontal genoverføring (HGT), har E. coli raskt utviklet seg til et godt tilpasset antibiotikaresistent patogen, som kan forårsake et bredt spekter av sykdommer hos mennesker og dyr17,18. Basert på isolasjonsopprinnelsen defineres patogene varianter som tarmpatogen E. coli (InPEC) eller ekstra-intestinal patogen E. coli (ExPEC). Videre er InPEC og ExPEC subklassifisert i veldefinerte patotyper i henhold til sykdomsmanifestasjon, genetisk bakgrunn, fenotypiske egenskaper og virulensfaktorer (VF)16,17,19.

Tradisjonell kultur og molekylære teknikker for patogene E. coli-stammer har gjort det mulig å raskt oppdage og identifisere forskjellige patotyper. Imidlertid kan de være tidkrevende, arbeidskrevende og krever ofte høy teknisk opplæring19. Videre kan ingen enkelt metode brukes til å studere alle patogene varianter av E. coli på en pålitelig måte på grunn av kompleksiteten i deres genetiske bakgrunn. For tiden har disse ulempene blitt overvunnet med fremkomsten av HTS-teknologier (High Throughput Sequencing). Helgenomsekvensering (WGS) tilnærminger og bioinformatiske verktøy har forbedret utforskningen av mikrobielt DNA rimelig og i stor skala, noe som letter den grundige karakteriseringen av mikrober i en enkelt kjøring, inkludert nært beslektede patogene varianter20,21,22. Avhengig av de biologiske spørsmålene, kan flere bioinformatikkverktøy, algoritmer og databaser brukes til å utføre dataanalyse. For eksempel, hvis hovedmålet er å vurdere tilstedeværelsen av ARGs, VFs og plasmider, kan verktøy som ResFinder, VirulenceFinder og PlasmidFinder, sammen med tilhørende databaser, være et godt utgangspunkt. Carriço et al.22 ga en detaljert oversikt over de forskjellige bioinformatikkprogramvarene og relaterte databaser som ble brukt for mikrobiell WGS-analyse, fra rådataforbehandling til fylogenetisk inferens.

Flere studier har vist den brede nytten av WGS for genomundersøkelse angående antimikrobielle resistensattributter, patogent potensial og sporing av fremveksten og evolusjonære forhold mellom klinisk relevante varianter av E. coli hentet fra forskjellige opprinnelser23,24,25,26 . WGS har gjort det mulig å identifisere molekylære mekanismer som ligger til grunn for fenotypisk resistens mot antimikrobielle midler, inkludert de sjeldne eller komplekse resistensmekanismene. Dette er gjennom å oppdage ervervede ARG-varianter, nye mutasjoner i legemiddelmålgener eller promotorregioner27,28. Videre tilbyr WGS potensialet til å utlede antimikrobielle resistensprofiler uten å kreve forkunnskaper om resistensfenotypen til en bakteriestamme29. Alternativt har WGS tillatt karakterisering av de mobile genetiske elementene (MGE) som bærer både antimikrobiell resistens og virulensegenskaper, noe som har drevet bakteriell genomutvikling av eksisterende patogener. For eksempel resulterte anvendelsen av WGS under undersøkelsen av det tyske E. coli-utbruddet i 2011 i å avdekke de unike genomiske egenskapene til en tilsynelatende ny E. coli-patotype; interessant nok stammer disse utbruddsstammene fra den enteroaggregerende E. coli (EAEC) -gruppen, som kjøpte prophage-kodingen av Shiga-toksinet fra den enterohemoragiske E. coli (EHEC) patotypen30.

Dette arbeidet presenterer en metodisk tilpasning av arbeidsflyten for bakteriell WGS ved hjelp av en benchtop sequencer. Videre tilbys en bioinformatikk-rørledning ved hjelp av nettbaserte verktøy for å analysere de resulterende sekvensene og ytterligere støtte forskere med begrenset eller ingen bioinformatikkkompetanse. De beskrevne metodene tillot belysning av antimikrobiell resistens, virulens og mobilomegenskaper av en patogen E. coli-stamme ACM5, isolert i 2011 fra innlandet oppdrettet Oreochromis spp. i Sinaloa, Mexico12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: E. coli-stammen ACM5 ble gjenfunnet ved bearbeiding og dyrking av fiskeprøven for fekal koliform (FC) bestemmelse12. Under prøvetakingen viste fisken ikke kliniske tegn på sykdom, bakterie- eller soppinfeksjon, og gjennomsnittstemperatur på 22,3 °C hersket. Etter isolering ble E. coli-isolatet utsatt for biokjemisk testing og kryopreservert i hjernehjerteinfusjon (BHI) buljong med DMSO (8% v / v) som kryobeskyttende middel.

1. Reaktivering av frossen E. coli ACM5 lagerkultur

  1. Fra den frosne bakteriestammen åpner du tuben og bruker en steril løkke, pipettespiss eller tannpirker til å skrape overflaten av den frosne bakteriekulturen.
  2. Strek bakteriene på en Luria-Bertani (LB) agarplate og inkuber ved 37 ± 2 °C i 24 timer.

2. Bestemmelse av antibakteriell følsomhet

MERK: Den antimikrobielle følsomhetstestingen som er beskrevet her, tilsvarer diskdiffusjonsmetoden basert på retningslinjene fra Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli ATCC 25922-stammen er nødvendig for kvalitetskontrollformål.

  1. Inokulumpreparasjon ved kolonisuspensjonsmetode
    1. Fra LB-platen inkubert i trinn 1.2, strek en eller to kolonier på en Mueller-Hinton (MH) agarplate og inkuber ved 37 ± 2 °C i 18-24 timer.
    2. Bruk en steril løkke til å plukke to eller tre kolonier fra det nydyrkede E. coli-isolatet på MH-agarplaten og resuspendere dem i 3 ml steril MH-buljong eller 0,85% (w / v) saltoppløsning, bland grundig ved vortexing for å oppnå en jevn bakteriell suspensjon.
    3. Bruk et UV-synlig spektrofotometer (se materialtabell) til å justere bakteriesuspensjonen til turbiditet som kan sammenlignes med en 0,5 MacFarland-standard (tilsvarende ca. 1-2 x 108 celler/ml). Hvis bakteriesuspensjonen er for lett eller for tung, tilsett flere E. coli-kolonier eller MH-buljong etter behov. Bruk det tilberedte inokulum innen 15 minutter etter tilberedning.
  2. Inokulering av testagarplatene
    1. Dypp en steril bomullspinne i den justerte bakteriesuspensjonen. Roter vattpinnen flere ganger og trykk den godt på innsiden av rørets vegg for å fjerne overflødig væske fra vattpinnen.
    2. Inokuler en MH-agarplate ved å stripe vattpinnen 3x over hele agaroverflaten, og roter platen 60 ° hver gang. Vattpinne kanten av agar også for å sikre en jevn fordeling av inokulum.
    3. La petriskållokket stå på gløtt i 3-5 minutter for å la fuktigheten fordampe.
  3. Påføring av den antimikrobielle disken på inokulerte agarplater
    1. Fordel jevnt og trykk hver antimikrobiell disk (se materialtabell) ned på overflaten av de inokulerte agarplatene for å sikre fullstendig kontakt. Snu platene innen 15 minutter etter diskapplikasjon og inkuber ved 35 ± 2 °C i 16-18 timer.
      MERK: Maksimalt 12 og seks disker må brukes i petriskåler på henholdsvis 150 mm og 100 mm.
  4. Etter inkubasjon måler du sonen for hemmingsstørrelser ved hjelp av en Vernier-tykkelse og tolker de resulterende diametrene i henhold til CLSI-bruddpunktkriteriene (M100 - tabell 2A)32.

3. Genomisk DNA (gDNA) ekstraksjon og kvantifisering

  1. Genomisk DNA-ekstraksjon
    1. Resuspend en løkke av nydyrkede E. coli-kolonier i 5 ml LB-buljong og inkuber over natten i en ristingsinkubator (180 o / min) ved 37 ± 2 ° C.
    2. Sentrifuger bakteriesuspensjonen ved 3,500 x g i 5 minutter og kast supernatanten forsiktig.
    3. Ekstrahere gDNA i henhold til retningslinjene for DNA-ekstraksjonssett (se tabell over materialer).
    4. Kontroller renheten til gDNA ved å måle optisk tetthet ved 260/280 nm (forhold: >1,8) og 260/230 nm (forhold: 2,0-2,2) ved hjelp av et UV-synlig spektrofotometer. Utfør 0,8% agarosegelelektroforese for å verifisere gDNA-integriteten.
  2. Genomisk DNA-kvantifisering
    MERK: Bruk bare tynnveggede, klare, 0,5 ml PCR-rør som er godkjent av produsenten av fluorescensanalysesettet (se Materialtabell).
    1. Sett opp det nødvendige antall rør for prøver og analysestandarder. Forbered arbeidsanalyseløsningen ved å blande komponent A og komponent B som følger med i settet, i henhold til produsentens retningslinjer.
    2. Forbered analysestandardene ved å legge til 190 μL av arbeidsløsningen og 10 μL av hver standard til riktig rør (to standarder kreves).
    3. Tilsett 198 μL av arbeidsløsningen og 2 μL av DNA-prøven til riktig rør. Bland kraftig ved å virvle alle rørene i 5 s. Vær forsiktig så du ikke lager bobler.
    4. Inkuber alle rør i 2 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys. Mål fluorescensen til alle rør basert på produsentens retningslinjer ved bruk av fluorometeret (se materialtabell).
    5. Juster riktig konsentrasjon av gDNA-prøven for sekvensering.

4. Forberedelse av DNA-bibliotek

MERK: Forberedelse og sekvensering av DNA-bibliotek ble utført i henhold til produsentens retningslinjer og protokoller (se materialtabell). Start gDNA-konsentrasjonen er 4,0 ng.

  1. Taggment, PCR-forsterkning og indeksering
    1. I et 0,2 ml rør tilsettes 2,5 μL tagmentasjonsbuffer og 2 μL inngang gDNA (2,0 ng / μL). Bland forsiktig ved pipettering.
    2. Tilsett 1 μL forsterkningsbuffer og bland forsiktig ved pipettering. Spinn ned ved 280 x g i 1 min ved romtemperatur.
    3. Plasser prøvene i en termosyklus (se materialtabell) og kjør følgende PCR-program: 55 °C i 5 minutter, og hold deretter ved 10 °C. Når prøvene når 10 °C, fortsett umiddelbart for å nøytralisere reaksjonen.
    4. Tilsett 1 μL nøytraliserende buffer til prøverørene og bland forsiktig ved pipettering. Spinn ned ved 280 x g i 1 min og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
    5. Legg til 1,7 μL av hvert indekskort (dvs. indeksene i7 og i5) og 3 μL indeksering PCR-mastermiks. Bland forsiktig ved pipettering. Spinn ned ved 280 x g i 1 min ved romtemperatur.
    6. Plasser prøvene i termocykleren og utfør en andre PCR-reaksjon som følger: 72 °C i 3 minutter, 95 °C i 30 s, 18 sykluser på 95 °C i 10 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, 72 °C i 5 minutter og hold ved 10 °C.
  2. Forsterket bibliotekopprydding
    1. Bland ved å vortexe den kommersielle magnetiske perleløsningen (se materialtabell) basert på produsentens retningslinjer.
    2. Overfør den merkede/indekserte gDNA-prøven til et nytt 1,5 ml rør og tilsett 0,6 μL magnetiske perler for hver μL av det endelige volumet av gDNA-prøven (≈13 μL). Bland forsiktig med pipettering og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Plasser prøverørene på et magnetisk stativ (se materialtabell) i 2 minutter til supernatanten har ryddet. Fjern og kast supernatanten forsiktig uten å forstyrre perlene.
    4. Tilsett 200 μL nytilberedt 80% etanol uten blanding. Inkuber i 30 s til eluatet rydder og fjern og kast supernatanten forsiktig uten å forstyrre perlene.
    5. Utfør et nytt vasketrinn. Tilsett 200 μL 80% etanol til perlene og inkuber i 30 s. Etter at eluatet er ryddet, fjern og kast supernatanten og lufttørk perlene i 10 minutter.
    6. Tilsett 15 μL 10 mM tris buffer (pH 8) til perlene og bland forsiktig ved pipettering. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur. Plasser prøverørene igjen på magnetstativet i 2 minutter, slik at supernatanten kan rydde.
    7. Overfør forsiktig 14 μL av supernatanten fra prøverøret til et nytt 0,2 ml rør. Dette er det ryddede biblioteket.
      MERK: På dette tidspunktet kan det ryddede biblioteket oppbevares ved -20 °C i opptil 7 dager.
  3. Normalisering av bibliotek
    1. Fortsett med å kvantifisere de oppryddede bibliotekene ved fluorescensanalyse som beskrevet i trinn 3.2, bortsett fra trinn 3.2.5.
    2. Visualiser de ryddede bibliotekene på en 1% agarosegelelektroforese for å bestemme de gjennomsnittlige fragmentstørrelsene.
    3. Beregn molaritetsverdien til biblioteket ved hjelp av følgende ligning:
      Equation 1
    4. Bruk molaritetsverdien til å beregne de riktige volumene av resuspenderingsbuffer (RSB) og ryddede biblioteker for å fortynne det enkelte bibliotek med en startkonsentrasjon på 10 nM.

5. Bibliotek pooling, denaturalizing, og sequencer initiere

  1. Tine reagenspatronen i henhold til produsentens anvisninger. Trekk ut strømningscellen fra kjøleskapet (4 °C) og bring den til romtemperatur før sekvensering.
  2. Basseng 5 μL av hvert normalisert bibliotek (10 nM) til et lavbind 1,5 ml rør. Fortynn det samlede biblioteket ved 4 nM med riktig volum RSB.
  3. Tilsett 5 μL av det samlede biblioteket (4 nM) og 5 μL 0,2 N NaOH i et nytt lavbinding 1,5 ml rør. Bland kort ved virvel, spinn ned ved 280 x g i 1 min, og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur for å denaturere det samlede biblioteket i enkeltstrenger.
  4. Bland forsiktig 10 μL denaturert samlet bibliotek og 990 μL forkjølt hybridiseringsbuffer ved pipettering og legg på is til den endelige fortynningen for sequencerbelastning er utført. Konsentrasjonen av det denaturerte samlede biblioteket er 20 pM.
  5. Tine og klargjør et kontrollbibliotek (se Materialtabell) med en konsentrasjon på 4 nM ved å blande 2 μL kontrollbibliotek (10 nM) og 3 μL nukleasefritt vann.
  6. Bland 5 μL i kontrollbiblioteket (4 nM) og 5 μL nylaget 0,2 N NaOH. Bland kort ved vortexing, spinn ned ved 280 x g i 1 min, og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur for å denaturere kontrollbiblioteket i enkeltstrenger.
  7. Bland forsiktig 10 μL denaturert kontrollbibliotek og 990 μL forkjølt hybridiseringsbuffer ved pipettering og legg på is til den endelige fortynningen for sequencerbelastning er ferdig. Konsentrasjonen av det denaturerte kontrollbiblioteket er 20 pM.
  8. I et nytt low-bind 1,5 ml rør, kombiner 594 μL av det denaturerte samlede biblioteket ved 20 pM og 6 μL av det denaturerte kontrollbiblioteket ved 20 pM. Bland riktig.
  9. Fortynn den endelige bibliotekblandingen (20 pM) til en endelig belastningskonsentrasjon på 1,2 pM i et volum på 600 μL ved bruk av den forkjølte hybridiseringsbufferen.
  10. Før du legger den endelige bibliotekblandingen på reagenskassetten, må du utføre en ekstra termisk forbehandling for å oppnå effektiv belastning i strømningscellen. Inkuber den endelige bibliotekmiksen i 2 minutter ved 96 °C. Snu røret for å blande, og legg røret på is i 5 minutter.
  11. Legg 500 μL av den endelige bibliotekblandingen inn i det konstruerte reservoaret på reagenspatronen. Initier sekvensering i henhold til retningslinjene. Last inn flytcellen og reagenskassetten, og konfigurer sekvenseringskjøringen.

6. Analyse av sekvensdata

MERK: Sjekk tilleggsfil 1 for ytterligere beskrivelse av den generelle WGS-dataforbehandlingen, programvaren, parameterinnstillingene og sekvensanalysen av E. coli-genomet.

  1. Koble til sekvenseringsdataserveren og last ned FASTQ-filene.
  2. Evaluer den opprinnelige kvaliteten på råsekvensdata med tredjepartsprogramvare. Fjern gjenværende adaptersekvenser, baser av lav kvalitet (tilleggsfil 1).
  3. Sett sammen de kvalitetssikrede sekvenseringsdataene til kontig- eller stillasnivå ved hjelp av tredjepartsprogramvare (se Tilleggsfil 1).
  4. Utfør genommerknad ved å sende FASTA-filen som inneholder det sammensatte genomet til RAST-serveren (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Last opp FASTA-filen til Center for Genome Epidemiology (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) og ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) webplattformer for å identifisere epidemiologiske egenskaper, ARGs, VAGs og plasmider (se tilleggsfil 1).
  6. Last opp FASTA-filen til PHASTER-serveren for å identifisere prophagesekvenser (https://phaster.ca/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den antimikrobielle følsomheten ble bestemt ved diskdiffusjonsmetoden og tolket av CLSI-brytningskriterier for 12 antibiotika som spenner over seks forskjellige antimikrobielle klasser, det vil si aminoglykosider, β-laktamer, fluorokinoloner, nitrofuraner, fenoler og folatveiantagonister. E. coli ACM5 viste følsomhet overfor alle antibiotika unntatt ett β-laktammedikament. Fire β-laktammedikamenter ble testet: ampicillin, karbenicillin, cefalotin og cefotaksim. Blant disse ble det målt en 14 mm hemmingshalo for ampicillin. Derfor, i henhold til CLSI-tolkningskategoriene for ampicillin (utsatt: ≥17 mm; mellomliggende: 14-16 mm; resistent: ≤13 mm) 32, viser E. coli ACM5 en mellomliggende følsomhet for ampicillin.

E. coli ACM5 ble utsatt for WGS ved hjelp av benchtop sequencer. Derfor ble DNA-prøven fremstilt, multiplekset og sekvensert etter den beskrevne protokollen. Samlet sett ga sekvenseringskjøringen med midtutgangskonfigurasjon 3,37 Gb data med en feilrate på 0,73%, og 89,71% av basene scoret en kvalitet over Q3033. Spesielt genererte sekvenseringen av E. coli ACM5 totalt 1.490.594 parede endeavlesninger (PE). Råsekvensdataene fra denne studien ble deponert i SRA-databasen (Sequence Read Archive) ved National Center for Biotechnology Information (NCBI) under BioProject-nummer PRJNA715781.

Etter den første kvalitetskontrollen og filtreringen ble 96,8 % av avlesningene konservert fra råsekvenseringsdata og satt sammen til stillaser med en dekningsdybde på 38x. Genomsamlingen på stillasnivå genererte 83 stillaser (>300 bp), 5 272 433 bp i lengde og med 50,61% GC-innhold. Genommerknad viste 5 633 kodede egenskaper, hvorav 5 524 er proteinkodende gener (CDS) og 109 er RNA-relaterte sekvenser (figur 1). I tillegg grupperte genommerknad CDS-er i samlinger av funksjonelt relaterte proteiner kalt delsystemer, spesielt de som spiller funksjonelle roller i karbohydrater, proteiner, aminosyrer og derivatmetabolisme og membrantransport (figur 2).

I silico typing predikerte E. coli ACM5 som en O-nontypeable (ONT) stamme tildelt ONT: H21 serotype. I tillegg viste den at den tilhører fylogruppe B1 og sekvenstype (ST) 40. En enkelt ervervet antimikrobiell resistensdeterminant som koder for en multidrug efflukspumpe med bredspektret ble identifisert, det vil si mdf (A) -genet (figur 1).

Når det gjelder virulensegenskaper, er flere VAG-er omtalt i E. coli-genomet som studeres, inkludert gener som koder for et varmestabilt enterotoksin (astA), et serumresistensprotein (iss) og type III-sekresjonssystemet (T3SS) sammen med dets utskilte effektorproteiner (figur 1). Den buntdannende pili (BFP) operonen og perABC-genklyngen ble ikke bevist. Følgelig, i henhold til den predikerte virulensprofilen, ble E. coli ACM5 tildelt aEPEC-patotypen.

WGS-analyse avslørte også to antatte store plasmider som tilhører forskjellige inkompatibilitetsgrupper (Inc) i E. coli-genomet (dvs. IncF- og IncI-plasmidgruppene). Imidlertid manglet begge ARGs og VAGs. Videre ble 18 profagassosierte regioner identifisert; Imidlertid, i motsetning til plasmider, har disse VAGs, inkludert iss-genet , sitABCD-operonkodingen for en jern / mangantransportør, og noen få T3SS-effektorproteiner (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Sirkulært kart over utkastet til genomet til E. coli ACM5. Data fra den ytterste til den innerste sirkelen deklareres og farges som følger. Sirkel 1: Genomstørrelsesskala i basepar. Sirkler 2 og 3: Annoterte CDS-er transkribert på henholdsvis den fremre (blå) og omvendte (røde) DNA-strengen. Sirkler 4 og 5: Ribosomale RNA (svart) og overførings-RNA (grønn). Sirkel 6: 83 stillaser av utkastet genom (grå). Sirkel 7: Annoterte egenskaper: antimikrobielle resistensdeterminanter (rød), virulensassosierte gener (lilla) og prophageregioner (aqua). Sirkel 8: %GC-innhold (svart). Sirkel 9: GC skjev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Subsystemfordeling av aEPEC-stamme ACM5. Analysen er basert på RAST SEED-merknad. Kakediagrammet organiserer delsystemene etter cellulær prosess, og proteinkodende gener involvert i den respektive cellulære prosessen er angitt i parentes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1. Beskrivelse av WGS-dataforbehandling, programvare, parameterinnstillinger og sekvensanalyse av E. coli ACM5-genomet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien presenterer en tilpasning av den bakterielle WGS-arbeidsflyten ved hjelp av en benchtop sequencer og en rørledning for genomisk karakterisering av en patogen E. coli-variant. Avhengig av sekvenseringsplattformen som brukes, kan behandlingstidene (TATs) for våte laboratorieprosedyrer (bakteriell dyrking, gDNA-ekstraksjon, bibliotekpreparasjon og sekvensering) og sekvensanalyse variere, spesielt hvis sakte voksende bakterier studeres. Etter protokollen for WGS beskrevet ovenfor var TAT innen 4 dager, noe som er sammenlignbart med hva litteraturen for tiden sier (<5 dager) 34.

Den teoretiske dekningsdybden for genomsekvensering av E. coli ACM5 ble beregnet til 30x. Ikke desto mindre genererte sekvenseringen empiriske data for genomsamlingen på 38x dybde. Som tidligere anbefalt35, var dette tilstrekkelig til å få en hel genomrepresentasjon og følge nedstrøms dataanalyse angående antimikrobiell resistens, virulens og mobilomegenskaper av E. coli ACM5. Med hensyn til antimikrobiell resistens ble bare de ervervede determinantene undersøkt. E. coli ACM5 er et ampicillinresistent isolat, men bare MdfA multidrug efflukspumpekodingsgenet ble observert. Dette gir imidlertid ikke resistens mot β-laktamer36, og ingen annen ervervet determinant involvert i β-laktamresistens ble identifisert. Det er derfor sannsynlig at en kombinasjon av andre molekylære mekanismer, som redusert cellemembranpermeabilitet og økt ekspresjon av distinkte efflukspumpesystemer, ligger til grunn for den observerte ampicillinresistensen37.

Når det gjelder virulensegenskaper, er den eneste tilstedeværelsen av intimin-kodingsgenet (eae) den karakteristiske genetiske markøren for aEPEC-stammer. AEPEC-patotypen er en undergruppe av intestinal patogen E. coli-stamme som bærer stedet for enterocytt effacement (LEE) patogenitetsøy, hvor en T3SS og tilhørende effektor / translokatorproteiner er kodet, inkludert Cif, EspA / B / D, EspF, intimin og den translokerte intiminreseptoren (Tir). Samspillet mellom T3SS og dets effektorer er direkte involvert i evnen til å fremme feste- og effacing (A / E) lesjoner på tarmepitelceller av typiske enteropatogene E. coli (EPEC) og EHEC, begge patotyper kjent som humane matbårne sykdomsfremkallende midler17,19. astA-genet koder for et varmebestandig enterotoksin kalt EAST1, og selv om det først ble anerkjent og assosiert med EAEC-stammer, er EAST1-toksinet utbredt blant E. coli-patotyper38. Her viste WGS at E. coli ACM5 har astA-genet, og til tross for at EAST1-produserende E. coli-isolater har vært assosiert med diarésykdom hos mennesker og dyr, er dets patogene rolle i å fremkalle diaré fortsatt kontroversiell39.

Den sentrale begrensningen i denne metodiske tilnærmingen bør anerkjennes; Den første samlingen på kontignivå resulterte i et fragmentert trekkgenom, og ble derfor ytterligere utsatt for stillas mot et nærmere referansegenom. Den implementerte sekvenseringsleselengdekonfigurasjonen (2 x 150 bp) og tilstedeværelsen av store, repeterende elementer i hele genomet til E. coli er de mest antatte forklaringene på den fragmenterte samlingen på contig-nivå. Kortleste datasett kan ikke løse riktig, og rekonstruerer derfor store repeterende elementer, noe som forårsaker potensielle feilmonteringer og flere bruddpunkter under monteringsprosessen. Derfor vil implementeringen av langleste sekvenseringsteknologier hjelpe til med å overvinne disse begrensningene og oppnå lukkede genomer40.

Flere kritiske trinn må vurderes gjennom WGS-protokollen. gDNA av høy kvalitet er det første sjekkpunktet som kreves for å sikre sekvenseringsdata av høy kvalitet. For det andre, i bibliotekets forberedelse, må det utvises ekstra forsiktighet under tagmenteringsprosessen, spesielt ved håndtering av flere prøver og tilsetning av indeksprimere, for å unngå krysskontaminering og for å kontrollere inkubasjonstiden, for å fragmentere DNA-prøvene riktig. Videre er kvantifiserings- og normaliseringstrinn avgjørende for å eliminere eventuelle skjevheter som DNA-biblioteker kan introdusere i de endelige sekvenseringsdataene, siden et feil ekvivaltilt forhold i det samlede biblioteket kan favorisere en vesentlig ulik fordeling i antall avlesninger per prøve. Metoden som presenteres her er enkel og representerer et kostnadseffektivt alternativ, hovedsakelig for optimal bruk av reagensene som finnes i DNA-bibliotekets forberedelsessett. Protokollen for WGS beskrevet ovenfor har blitt brukt ikke bare på E. coli genomsekvensering, men også på andre ikke-relaterte bakteriearter som Vibrio parahaemolyticus41. Ifølge FNs mat- og jordbruksorganisasjon (FAO) og Verdens helseorganisasjon (WHO) kan NGS-metoder spille en avgjørende rolle i mattrygghet ved å gi rask identifisering og karakterisering av mikroorganismer og antimikrobiell resistens (AMR) med nøyaktighet som tidligere ikke var mulig42. Derfor utgjør disse metodene et verktøy for overvåking og kildesporing av patogener, ikke bare i klinisk sammenheng, men også i risikovurdering av matbårne patogener, og avslører innsikt i de økologiske og fysiologiske egenskapene til disse mikroorganismer43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Til National Council of Science and Technology of Mexico (CONACyT ved akronym på spansk) for doktorgradsstipend tildelt José Antonio Magaña-Lizárraga [nr. 481143].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Tags

Genetikk utgave 190 helgenomsekvensering Escherichia coli aEPEC antimikrobiell resistens akvakultur Oreochromis spp.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Karakterisering av en patogen <em>Escherichia coli-stamme</em> avledet fra <em>Oreochromis</em> spp. Gårder ved bruk av helgenomsekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter