使用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植小鼠模型评估嵌合抗原受体T细胞相关毒性

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法彻底改变了癌症免疫治疗领域。它已被证明可成功治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病 （ALL）、大 B 细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和多发性骨髓瘤 1,2,3,4,5,6,7^，最近获得了 FDA 的批准。尽管在临床试验中取得了初步成功，但CART细胞疗法的毒性通常很严重，偶尔会致命。CART细胞治疗后最常见的毒性包括CRS和NI的发展，也称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）^8,9。CRS是由于CART细胞在体内的过度活化和大量扩增引起的，导致随后分泌多种炎性细胞因子，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-6（IL-6）。这会导致低血压、高烧、毛细血管渗漏综合征、呼吸衰竭、多器官衰竭，在某些情况下会导致死亡^10,11。CRS在CART19细胞疗法后50-100%的病例中发展11,12,13。ICANS是与CART细胞治疗相关的另一种独特的不良事件，其特征是全身性脑水肿，意识模糊，反应迟钝，失语，运动无力，偶尔癫痫发作^9,14。任何级别的ICANS发生在多达70%的患者中，据报道3-4级发生在20-30^{%的患者中}5,10,15,16。总体而言，CRS和ICANS很常见，可能是致命的。

CART细胞治疗后ICANS的管理具有挑战性。大多数ICANS患者也会出现CRS¹⁷，通常可以用IL-6受体拮抗剂托珠单抗或类固醇¹⁸治疗。之前的一份报告显示，托珠单抗的早期干预降低了严重CRS的发生率，但不影响ICANS¹⁹的发病率或严重程度。目前，ICANS没有有效的治疗方法或预防剂，研究预防策略至关重要²⁰。

骨髓细胞和相关细胞因子/趋化因子被认为是CRS和ICANS²¹发展的主要驱动力。虽然CRS与细胞因子的极端升高和T细胞扩增直接相关，但ICANS的病理生理学在很大程度上是未知^的22,23。因此，当务之急是建立一个小鼠模型，概括CART细胞治疗后的这些毒性，以研究其机制并制定预防策略。

目前有多种临床前动物模型用于研究、优化和验证 CART 细胞的功效，以及监测其相关毒性。这些包括同系、异种移植、免疫功能正常的转基因、人源化转基因和患者来源的异种移植小鼠，以及灵长类动物模型。然而，这些模型中的每一个都有缺点，有些不能反映CART细胞^24,25的真正功效或安全问题。因此，必须仔细选择适合研究预期目标的最佳模型。

本文旨在描述用于评估CART细胞相关毒性，CRS和NI的方法，使用ALL患者来源的异种移植（PDX）体内模型（图1）。具体来说，在这里描述的方法中，按照先前描述的方案使用作者实验室中产生的CART19细胞。简而言之，通过密度梯度技术从健康供体外周血单核细胞（PBMC）中分离人T细胞，在第0天用CD3 / CD28磁珠刺激，并在第1天用由CD19靶向单链可变片段组成的CARs等地转入4-1BB和CD3ζ信号结构域。然后将这些 CART 细胞扩增，在第 6 天去珠，并在第 8 天冷冻保存 26,27,28,29,30。如前所述，小鼠接受淋巴细胞消耗治疗，然后施用患者来源的白血病原始细胞（ALL）²⁸。首先，通过下颌下采血验证肿瘤植入。在建立适当的肿瘤负荷后，将CART19细胞施用于小鼠。然后，每天对小鼠称重以评估健康状况。进行小动物磁共振成像（MRI）以评估NI，同时进行尾部出血以评估T细胞扩增和细胞因子/趋化因子的产生。强烈建议将下面描述的技术用作在PDX模型中研究CART细胞相关毒性的模型。

本协议遵循妙佑医疗国际机构审查委员会 （IRB）、机构动物护理和使用委员会 （IACUC A00001767） 和机构生物安全委员会 （IBC， Bios00000006.04） 的指南。

注意:用于小鼠的所有材料必须是无菌的。

1.向NSG小鼠注射白消安

1. 获得雄性，8-12周龄，免疫功能低下，NOD-SCID IL2rγnull（NSG）小鼠，并在注射前称重。
   注意:为了统计显着性，建议每组至少使用五只小鼠，并至少对雌性小鼠重复该实验一次。
2. 准备用于腹膜内（ip.p.）注射的白消安。使用1mL胰岛素注射器，缓慢而小心地向注射器填充30mg / kg的白消安，然后腹腔注射到小鼠身上，并将它们放回笼子中。

2.向NSG小鼠注射所有患者来源的原始细胞（CD19 ⁺）

注意:本协议遵循妙佑医疗国际机构生物安全委员会（IBC，Bios00000006.04）的指南。

1. 从复发和难治性 ALL 患者的外周血中收集原发性白血病原始细胞。
2. 准备用于静脉（静脉注射）注射的靶细胞。
   1. 使用血细胞计数器计数CD19 ⁺ 靶细胞，并记录细胞的最终体积和浓度。
      注意:为了确定细胞活力，强烈建议在计数细胞时使用台盼蓝。
   2. 通过在4°C下以300× g 离心5分钟来沉淀细胞。
   3. 将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，在 1.5 mL 微量离心管中重悬至终浓度为 50 ×^{10 6} 个细胞/mL，然后放在冰上。
   4. 用手指涡旋含有靶细胞的 1.5 mL 微量离心管，直到细胞完全匀浆。
   5. 使用 1 mL 胰岛素注射器，缓慢而小心地将 100 μL 准备好的靶细胞填充注射器，然后轻弹注射器以去除气泡。
      注意:100μL的体积将向每只小鼠施用5×10⁶ 个细胞。
   6. 将小鼠置于暖光下5-10分钟。一旦尾静脉充血并且肉眼更明显，将小鼠置于适当的禁闭/约束室中。
   7. 用酒精棉签擦拭鼠标尾巴。将靶细胞直接注射到尾静脉（IV）中，然后将小鼠放回笼中。接种靶细胞后，每天监测小鼠或按照当地动物伦理委员会的建议监测小鼠。

3.肿瘤植入评估

1. 从注射靶细胞后 6 周开始，通过使用流式细胞术测量外周血中 CD19⁺ 细胞的表达来评估肿瘤植入。
2. 外周血测定以评估 CD19⁺ 扩增
   1. 注射CART19细胞后6-8周从小鼠中提取血液。
      注意:可以使用几种方法抽血。对于该方案，下颌下采血是首选方法。
   2. 在含有5%异氟醚的诱导室中用异氟醚麻醉小鼠。一旦达到麻醉，维持在1-3%的异氟醚通过鼻锥吸入。
      注意:强烈建议使用眼药膏以防止眼睛干燥。
   3. 将鼠标从腔室中取出，然后用非惯用手抓住脖子上的松弛皮肤来握住鼠标。用柳叶刀在下颌骨后面稍微刺穿静脉。
      注意:只需要针尖（1-2毫米）即可进入静脉。
   4. 当血液滴落时，在肝素包被的试管中收集至少 50 μL，并通过上下倒置试管数次充分混合。将 30 μL 血液转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。
      注意:对于剩余的血液，在4°C下以17,000× g 旋转管10分钟。 将血清（上清液层）转移到干净且标记的1.5mL微量离心管中，并将其储存在-80°C（用于细胞因子测定）。
   5. 将 2 mL 裂解缓冲液（10 倍氯化铵裂解缓冲液，使用无核酸酶水稀释至 1 倍）加入含有血液的 5 mL 圆底管中。通过涡旋管充分混合。将试管在室温下孵育20分钟，以确保红细胞的适当裂解。
   6. 加入 2 mL 流动缓冲液（PBS、0.2 g/L 氯化钾、0.2 g/L 磷酸一元钾、8 g/L 氯化钠和 1.15 g/L 磷酸二氢钠，含 2% 胎牛血清和 1% 叠氮化钠）。
   7. 将管在4°C下以300× g 离心5分钟。 倒出上清液，加入 2 mL 流动缓冲液。重复此洗涤步骤2次。
   8. 小心地倒出管中的内容物。观察管中残留的少量液体。加入 100 μL 流动缓冲液，并重悬良好。
   9. 将 5 mL 流管中的所有剩余液体转移到 96 孔板中。确保每个样品都贴有正确的标签。向相应的孔中加入 100 μL 流动缓冲液，并在 4 °C 下以 650 × g 离心 96 孔板 3 分钟。
3. 通过流式细胞术评估CD19 ⁺ 靶细胞的扩增（图2）。
   1. 制备含有 0.3 μL 活/死染色剂、0.13 μg （2.5 μL） 抗人 CD19 抗体、0.06 μg （2.5 μL） 抗人 CD45 抗体、5 μg （2.5 μL） 抗小鼠 CD45 和 42.2 μL 流动缓冲液的预混液，每个样品总共 50 μL。在室温下在黑暗中孵育15分钟。
   2. 用150μL流动缓冲液洗涤，然后在4°C下以650× g 离心3分钟。 倒出上清液，并将沉淀重悬于 195 μL 流动缓冲液和 5 μL 计数珠中。
   3. 在流式细胞仪上采集以确定CD19 ⁺ 细胞表达水平。出于设门和分析目的，首先根据前向与侧向散射特征对感兴趣的群体（CD19⁺）进行门控，然后是单个门控群体，然后是活细胞。一旦活细胞被设门，评估人类CD45与小鼠CD45群体，并从人类群体中，确定CD19 ⁺ 目标群体。
4. 定量以确定 70 μL 中存在的量，然后使用公式 （1） 以细胞/μL 表示:
   绝对 CD19+ 细胞计数 = （[CD19⁺ 细胞/计数磁珠] × 5 μL 内的计数磁珠数量）/70
   注意:每5天重复一次外周血测定以评估CD19 ⁺ 细胞扩增。根据当地动物伦理委员会的指导方针，每 2 周累积收集不超过 200 μL 的血液。一旦小鼠达到≥10个细胞/μL的疾病负荷，随机分配到CART19细胞组或对照组（第4节）。

4. 体内CART19细胞的给药

1. CART19细胞的制备（~第80天）:
   注意:CART19细胞的生成已于27,30,31之前发布。该程序必须在生物安全柜2+级内使用无菌技术和个人防护设备进行。
   1. 在水浴容器（37°C）中解冻CART19细胞。然后，在温热的T细胞培养基（TCM）中洗涤细胞以除去二甲基亚砜。
      注意:中药由10%的人AB血清（v / v），1%青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（v / v）和无血清造血细胞培养基^27,30制成。
   2. 将CART19细胞在4°C下以300× g 离心8分钟，并在温热的TCM中重悬至终浓度为2×10⁶ 细胞/ mL。让CART细胞在培养箱（37°C，5%CO₂）中休息过夜，但不超过16小时。
2. 通过静脉注射 施 用CART19细胞（第~80天）
   1. 计数CART19细胞，并在4°C下以300× g 旋转8分钟。
   2. 用10mL PBS重悬CART19细胞，并在4°C下以300× g 旋转8分钟。
   3. 用PBS将CART19细胞重悬至终浓度为40×10⁶ 细胞/ mL，将细胞转移到无菌的1.5 mL微量离心管中，并将它们放在冰上。
   4. 通过静脉注射 100 μL 重悬细胞进行 CART19 细胞尾静脉注射（如上所述）。
      注意:100 μL 的体积将向每只小鼠施用 4 × 10⁶ 个细胞。包括一组未经治疗的小鼠作为阴性对照。

5. CART19细胞相关毒性的评估

1. CART19细胞给药后，每天监测小鼠2次，以评估其健康状况的任何变化，例如运动无力，驼背和体重减轻。
   注意:所有这些物理变化都与此模型²⁸ 中的 CRS 症状相关。
2. 一旦小鼠开始出现运动无力和体重减轻（从基线减少10-20%），收集外周血以分析肿瘤负荷，并根据第3节中描述的方法进行细胞因子的血清分离（图3）。
3. 将血清微量离心管储存在-80°C，并使用血清使用多重测定分析趋化因子和细胞因子（图4）。
   注意:如果小鼠表现出后肢麻痹的迹象，显得奄奄一息或昏昏欲睡，并且体重减轻>其体重的20%，以至于限制了它们获得食物和/或水的能力，那么它们将受到安乐死。

6. 磁共振成像

注意:带有垂直孔径磁铁的临床前（用于小动物）MRI扫描仪用于体内磁共振和图像采集^32,33。

1. 混合 120 μL 钆 + 880 μL 盐水溶液，并加载到 1 mL 胰岛素注射器中。向每只小鼠（ip）中注入100μL。
   注意:钆应在实验开始前15-20分钟注射。
2. 在诱导室中使用异氟醚（2-3%）麻醉小鼠10-15分钟。
   注意:强烈建议使用眼药膏以防止眼睛干燥。
3. 将鼠标脊柱放在与啮齿动物兼容的摇篮探针上。然后，通过将鼠标的牙齿钩在咬杆上来继续定位鼠标。
4. 将鼠标头拉入25毫米体积线圈中，并调整拴在异氟烷麻醉系统上的鼻锥。拧紧咬杆的旋钮，以在扫描期间保持该位置。
   注意:如果进行对比增强MRI扫描，请确保在将设备放入孔磁体之前至少10分钟注射钆（在这种情况下）或造影剂。在整个成像过程中，将通过鼻锥吸入空气中的2-3%异氟醚来麻醉小鼠，并同时监测它们的呼吸频率。
5. 对于呼吸评估，请使用呼吸/呼吸监测设备。
   注意:评估体温也很重要，以防止由于长时间接触麻醉而导致的体温过低。建议使用加热垫来控制体温。
   1. 将呼吸监测探头靠近横膈膜，并用手术胶带固定。将呼吸频率保持在每分钟20-60次呼吸之间，以使小鼠的状况稳定。
      注意:此速率可提供更稳定的MRI图像，并防止采集的图像中出现运动伪影。如果呼吸频率高于每分钟20-60次呼吸的范围，则增加异氟醚的浓度。如果呼吸频率低于每分钟20次呼吸，则麻醉太深;因此，需要降低浓度。
6. 将动物探头插入垂直孔小动物MRI系统内的小孔中。调整线圈中心的动物头部。用锁固定设备，使其可以直立，并将仪器连接到计算机。
7. 打开并使用软件（例如，Paravision）设置扫描位置和扫描类型。确定最佳轴向和矢状位置，同时保持所有实验组的一致性。
   注意:建议在实际进行全长MRI扫描之前使用试验扫描的采集作为参考。
8. 继续进行MRI数据收集（如前所述32,34,35,36）。使用下面提到的建议设置获取 T1 加权和 T2 加权 MRI 图像。
   1. 对于 T1 加权 MRI 图像，请使用重复时间 （TR） 为 300 毫秒、回波时间 （TE） 为 9.5 毫秒、视场 （FOV） 为 4 cm x 2 cm x 2 cm 和矩阵为 192 x 96 x 96 的 T1 加权多层多回波 （MSME） 序列。
   2. 对于 T2 加权 MRI 图像，使用TR 为 300 毫秒、TE 为 9.5 毫秒、FOV 为 4 cm x 2 cm x 2 cm 和 192 x 96 x 96 矩阵的多层多重回波 （MSME） 序列。
9. 扫描完成后，将探头从孔中取出。通过将牙齿从咬杆上移开来轻轻拔出鼠标。在单独的笼子里监测动物，直到它完全清醒并恢复足够的运动功能。
10. 从软件中提取数据后，使用分析软件对高信号区域进行定量和3D体积渲染（图4）。
    注意:如果可能，强烈建议使用两个单独的盲观察者进行数据分析。

该协议的目的是使用来自ALL患者肿瘤细胞的PDX小鼠模型评估CART细胞相关毒性（图1）。首先，NSG小鼠接受腹膜注射白消安（30mg / kg），目的是免疫抑制它们并促进CART细胞植入28。第二天，他们收到了来自所有患者的~5×106 个PBMC（IV）。通过尾部出血测定 监测 小鼠的植入~13周。收集并裂解红细胞，然后进行流式细胞术制备以评估CD19 + 肿瘤细胞的表达（图2）。

一旦小鼠达到≥10个肿瘤细胞/ μL，它们被随机分配并准备接受4×106个CART19细胞（IV）。为了评估CART19相关的毒性，每天称量小鼠一次（图3A）。体重减轻被选为CRS外观的症状，因为之前已经发现它与CART细胞相关的毒性有关28,37。通过流式细胞术分析人CD19+肿瘤细胞和人CD3+ T细胞进行外周血测定（通过下颌下采血）以评估肿瘤负荷和CART细胞扩增。此外，收集血清，并评估炎性细胞因子。在 CART19 细胞输注前一天以及 CART19 细胞输注后 5 天和 10 天进行检测，因为这些时间点与 CRS 的发作和症状的发展特别相关。

特别是，在CART19细胞给药前后进行了多重测定，其中最具代表性的细胞因子和趋化因子是GM-CSF，IL-18，MIP-1α和IP-10（图3B）。然而，可以进行其他测定来评估血清中这些蛋白质的浓度。或者，对小鼠进行MRI扫描以评估中枢神经系统（CNS）的血管通透性。向小鼠注射造影剂钆（ip）以测量脑部炎症和血脑屏障破坏38。然后，用异氟醚麻醉，并拍摄对比增强的T1加权和T2加权图像（图4）。对于T2图像（图4，左），较亮的部分（白色）表明存在水肿或液体，这主要见于脑肿瘤和炎症。对于T1图像（图4，中间），较亮的部分表示存在血液泄漏或血脑屏障破坏的区域。最后，在软件的帮助下，使用钆增强的T1图像组装3D重建图像（图4，右），该图像基于对应于血管通透性的高信号，该信号使大脑中的钆泄漏量34。

图 1:用于评估 CART 细胞相关毒性、细胞因子释放综合征和神经炎症的患者衍生异种移植模型的实验方案。用30mg / kg白消安（ip）对NSG小鼠进行条件反射，并接受来自ALL患者外周血的3×10 6-5×106原始细胞（IV）。接下来，通过下颌下采血监测小鼠的肿瘤植入，然后进行流式细胞术以评估CD19 +原始细胞。当外周血CD19 +细胞为≥10个细胞/μL时，小鼠接受2×106-5×106 CART19细胞。每天对小鼠进行称重，以衡量其健康状况。在CART19细胞输注后10天，进行小鼠脑MRI以检测神经炎症。在注射CART19细胞后每周进行尾部出血以评估细胞因子/趋化因子的产生和T细胞扩增。缩写:CART = 嵌合抗原受体 T 细胞;CART19 = CD19 靶向购物车;ALL = 急性淋巴细胞白血病;静脉注射=静脉注射;ip. = 腹膜内;PB = 外周血;NSG = NOD-SCID IL2rγnull。请点击此处查看此图的大图。

图 2:在 ALL PDX 模型中将 CD19+ 肿瘤细胞作为肿瘤负荷指标进行分析，以评估 CART 细胞相关毒性。 （A）代表性流式细胞术分析，显示门控策略，以分析从注射有患者来源的ALL原始细胞的小鼠外周血样本中提取的CD19 + 细胞群。（B）根据流式细胞术分析获得的原始数据，定量和比较用CART19处理的小鼠与未处理的小鼠之间的CD19 + 细胞群。（单向方差分析;每组n = 3只小鼠;误差线，SEM）。缩写:ns = 不显著;ALL = 急性淋巴细胞白血病;PDX = 患者来源的异种移植物;CART = 嵌合抗原受体 T 细胞;CART19 = CD19 靶向购物车;SSC-H = 侧散射峰高度;FSC-H = 前向散射峰高度;SSC-A = 侧散射峰面积;FSC-A = 前向散射峰面积。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:使用 ALL PDX 模型评估 CART19 相关毒性。 （A）在CART后前6天用CART19细胞或对照未转导T细胞处理的小鼠体重减轻百分比的代表性图（双向方差分析，****p < 0.001，****p < 0.00001;误差线，SEM）。（B）CART19细胞给药前后NSG小鼠血清中细胞因子和趋化因子的表达。NSG小鼠在CART19细胞给药（IV）之前和之后进行下颌下出血，以收集其血清并评估以下细胞因子和趋化因子的表达:GM-CSF，IL-18，MIP-1α，IP-10，IL-1β和IL-6（双向方差分析，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001; n = 3只小鼠; 九次技术重复; 误差线， 搜索引擎优化）。缩写:ns = 不显著;ALL = 急性淋巴细胞白血病;PDX = 患者来源的异种移植物;CART = 嵌合抗原受体 T 细胞;CART19 = CD19 靶向购物车;NSG = NOD-SCID IL2rγnull;GM-CSF = 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;IL-18 = 白细胞介素-18;MIP-1α = 巨噬细胞炎症蛋白-1 α;IP-10 = 干扰素 γ 诱导蛋白 10;IL-1β = 白细胞介素-1β;IL-6 = 白细胞介素-6。请点击此处查看此图的大图。

图 4:在 PDX 模型中用于评估 CART19 细胞治疗期间神经炎症的磁共振成像。 用来自ALL患者的肿瘤细胞移植的NSG小鼠输注CART19细胞，并在CART输注后10天内小鼠出现神经系统症状后，用钆增强MRI对大脑进行成像。（左）T2加权图像显示CART19处理小鼠NI期间水肿和可能的炎症浸润的证据（红色箭头）。（中）T1加权MRI的代表性轴向切片显示脑实质内的对比度增强，表明CART19处理的小鼠血管通透性增加（红色箭头）。（右）使用Analyze 12.0软件生成具有T1高信号区域（红色）的啮齿动物大脑的三维重建。缩写:MRI = 磁共振成像;ALL = 急性淋巴细胞白血病;PDX = 患者来源的异种移植物;CART = 嵌合抗原受体 T 细胞;CART19 = 以 CD19 为目标的购物车。 请点击此处查看此图的大图。

表1:通过ALL PDX模型概述临床观察到的CART细胞相关毒性。 缩写:GM-CSF = 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;IL = 白细胞介素;CRS = 细胞因子释放综合征;NI = 神经炎症;BBB = 血脑屏障;中枢神经系统=中枢神经系统;MCP-1 = 单核细胞化学引诱蛋白 1。

S.S.K.是CAR免疫治疗领域专利的发明人，这些专利已授权给诺华（通过妙佑医疗国际，宾夕法尼亚大学和诺华之间的协议）和Mettaforge（通过梅奥诊所）。R.L.S. 和 S.S.K. 是 CAR 免疫治疗领域专利的发明人，这些专利已授权给 Humanigen。S.S.K.获得Kite，Gilead，Juno，Celgene，Novartis，Humanigen，MorphoSys，Tolero，Sunesis，Leahlabs和Lentigen的研究资助。