利用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植小鼠模型评估嵌合抗原受体T细胞相关毒性

摘要

本文描述了一种利用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植模型，作为评估和监测靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞相关毒性的策略。

摘要

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法已成为治疗多种CD19⁺恶性肿瘤的有力工具，这也促使美国食品药品监督管理局（FDA）近期批准了多个靶向CD19的CART（CART19）细胞治疗产品。然而，CART细胞疗法伴随一系列独特的毒性反应，可能导致显著的发病率和死亡率，其中包括细胞因子释放综合征（CRS）和神经炎症（NI）。在CART技术的研发过程中，临床前小鼠模型的应用至关重要，可用于评估CART细胞的疗效与毒性。目前可用于测试这种过继性细胞免疫疗法的临床前模型包括同源性模型、异种移植模型、转基因模型以及人源化小鼠模型。尚无单一模型能够完全模拟人类免疫系统，每种模型均有其优势与局限性。本方法学论文旨在介绍一种利用急性淋巴细胞白血病患者来源的白血病母细胞建立的患者来源异种移植模型，用于评估CART19相关的毒性反应，包括CRS和NI。该模型已被证实能够重现临床上观察到的CART19相关毒性反应以及治疗效果。

引言

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法彻底改变了癌症免疫治疗领域，在治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）、大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和多发性骨髓瘤方面已显示出显著疗效^{1,2,3,4,5,6,7}，从而推动了近期美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。尽管临床试验初期取得成功，但CAR-T细胞治疗仍可引发毒性反应，这些反应通常较为严重，偶有致死情况。CAR-T细胞治疗后最常见的毒性反应包括细胞因子释放综合征（CRS）和神经系统毒性（NI），后者也被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。^8,9CRS 是由于 CAR-T 细胞的过度活化和大量扩增所致 体内，进而导致多种炎症性细胞因子的分泌，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-6（IL-6）。这可引起低血压、高....

方案

本方案遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB）、机构动物护理和使用委员会（IACUC A00001767）以及机构生物安全委员会（IBC, Bios00000006.04）的指南。

注意：所有用于小鼠操作的材料必须是无菌的。

1. 向NSG小鼠注射白消安

1. 获取雄性、8–12 周龄、免疫缺陷型 NOD-SCID IL2rγnull (NSG) 小鼠，在注射前称重。
   注意：为确保统计学显著性，建议每组至少使用五只小鼠，并至少再用雌性小鼠重复实验一次。
2. 准备用于腹腔（i.p.）注射的白消安。使用 1 mL 胰岛素注射器，缓慢而小心地吸取准确剂量为 30 mg/kg 的白消安，随后对小鼠进行腹腔注射，并将其放回笼中。

2. 注射ALL患者来源的原始细胞（CD19⁺) 到NSG小鼠

注意：本方案遵循梅奥诊所机构生物安全委员会（IBC，Bios00000006.04）的指导方针。

1. 从复发性和难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）患者的外周血中收集原代白血病母细胞。
2. 制备用于静脉内（i.v.）注射的靶细胞。
   ....

结果

本方案旨在利用来自急性淋巴细胞白血病（ALL）患者肿瘤细胞的PDX小鼠模型，评估CART细胞相关毒性。图1首先，NSG小鼠通过腹腔注射白消安（30 mg/kg），旨在实现免疫抑制，促进CART细胞的植入。²⁸第二天，他们接受了约 5 × 10⁶ 来自白血病（ALL）患者的外周血单个核细胞（PBMCs，静脉注射）。小鼠移植情况监测约13周。 通过 尾部出血实验。收集红细胞并进行裂解，随后制备流式细胞术样品以检测CD19的表达水平⁺ 肿瘤细胞（图2).

当小鼠达到≥10个肿瘤细胞/µL，他们被随机分组并准备接受 4 × 10⁶ CART19 细胞（静脉注射）。为评估 CART19 相关毒性，小鼠每日称重一次（图3A）。选择体重减轻作为CRS出现的症状，因为先前研究已表明其与CAR.......

讨论

在本报告中，描述了一种利用急性淋巴细胞白血病PDX模型评估CAR-T细胞相关毒性的方法。更具体而言，该模型旨在模拟患者在输注CAR-T细胞后常出现的两种危及生命的毒性反应：细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NI）。该模型再现了临床中观察到的CAR-T细胞毒性的多种特征：体重减轻、运动功能障碍、神经炎症、炎症性细胞因子和趋化因子的产生，以及不同效应细胞向中枢神经系统的浸润^8,20,28此前，该PDX模型已被用于模拟CRS和NI的初始发生过程（表1并评估不同的毒性预防和治疗方法。一项在此PDX模型中开展的研究利用了耗竭GM-CSF的CART19细胞。更具体而言，这些结果表明，GM-CSF的耗竭可减少与细胞因子释放综合征（CRS）相关的细胞因子和趋化因子的分泌，这一点在该急性淋巴细胞白血病（ALL）PDX小鼠模型中得到了明确验证。²⁹该PDX模型还已成功用于评估CAR-T.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 抗人 CD19	Biolegend	302211
酒精消毒片	Wecol	6818
Analyze 14.0 软件	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
人工泪液（矿物油和凡士林）	Akorn	17478-062-35	用于预防眼部干燥的局部眼用凝胶
BD FACS 溶血溶液	BD	349202	红细胞裂解缓冲液
BD Micro-Fin IV 胰岛素注射器	BD	329461
Brilliant Violet 421 抗人 CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 特斯拉	Bruker Biospin	N/A	MRI 设备
白消安（NSC-750）	Selleckchem	S1692
CountBright 绝对计数微球	Invitrogen	C36950
CytoFLEX 系统 B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	流式细胞仪
杜氏磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144
ERT 控制/门控模块	SA Instruments	Model 1030	小动物呼吸监测与门控系统
胎牛血清	Millipore Sigma	F8067
血细胞计数板	Bright-Line	Z359629-1EA
人 AB 型血清；男性供体；AB 型；美国来源	Corning	35-060-CI
异氟烷（液体）	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒（适用于 405 nm 激发）	Invitrogen	L34966
Microvette 500 锂肝素采血管	Sarstedt	20.1345.100	血液采集管
MILLIPLEX 人细胞因子/趋化因子磁珠检测面板	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	免疫学多重检测，用于鉴定细胞因子和趋化因子
Omniscan	GE Healthcare Inc.	0407-0690-10	基于钆的对比剂
Pd 抗小鼠 CD45	Biolegend	103106
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓度），液体	Gibco	10378-016
圆底聚苯乙烯试管	Corning	352008
叠氮化钠，5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
不锈钢外科手术刀片	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基	Lonza	04-418Q