Summary
Bu protokol, mantar ve bakterilerin kontaminasyonunu önlemek için araştırma hücre kültürü laboratuvarında kullanılacak temel hücre kültürü tekniklerini ve uygulamalarını sunmaktadır. Bakteri kategorisinde, mikoplazma kontaminasyonunun önlenmesine özel önem verilecektir.
Abstract
Hücre kültürü, kontrollü bir ortamda insan, hayvan ve böcek hücrelerini veya diğer dokuları büyütmek için gerekli olan hassas bir beceridir. Protokolün amacı, mantar ve bakterilerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için bir araştırma laboratuvarında kullanılan doğru teknikleri vurgulamaktır. Küçük boyutu ve hücre kültürü için kullanılan çoğu antibiyotiğe direnci nedeniyle hücre kültürü odasında büyük bir endişe kaynağı olan mikoplazma kontaminasyonundan kaçınmaya özel önem verilmektedir. Aynı teknikler sürekli büyümeyi sağlar ve sağlıklı hücreleri korur. Hem yeni hem de deneyimli hücre kültürü kullanıcıları için, kontaminasyon riskini azaltmak için bu en iyi uygulamalara tutarlı bir şekilde uymak önemlidir. Yılda bir kez, laboratuvarlar hücre kültürü en iyi uygulamalarını gözden geçirmeli ve gerekirse bir tartışma veya ek eğitim ile takip etmelidir. İlk etapta kontaminasyonu önlemek için erken önlem almak, kontaminasyon meydana geldikten sonra temizlemeye kıyasla zamandan ve paradan tasarruf etmenizi sağlayacaktır. Evrensel en iyi uygulamalar hücre kültürlerini sağlıklı tutar, böylece sürekli olarak yeni hücreleri çözme, pahalı hücre kültürü ortamı satın alma ve inkübatör dekontaminasyon ve arıza süresini azaltma ihtiyacını azaltır.
Introduction
Hücre kültürünün araştırma laboratuvarında birçok kullanım alanı vardır. 20. yüzyılın başlarında hücre kültürünün kökenlerinden bu yana, hücre hatları bilimin ilerlemesine yardımcı olmuştur. Hücre hatlarının birçok avantajı vardır; Çeşitli hücre hatları, araştırmacıların hücre biyolojisini incelemelerine, daha ileri çalışmalar için bakülovirüs üretmelerine veya birkaç1'i adlandırmak için büyük miktarlarda ilgi çekici bir protein üretmelerine yardımcı olabilir. Bazı ek kullanımlar arasında doku büyümesinin incelenmesi, aşı geliştirmenin ilerlemesine yardımcı olunması, toksikoloji araştırması, sağlıklı organizmalarda ve hastalıklı modellerde genlerin rolünün incelenmesi ve hibrit hücre hatlarının üretimisayılabilir 2,3. Hücre hatları ayrıca ilaç üretimini de sağlayabilir3. Hücre hatları ile çalışırken uygun aseptik teknikler gereklidir; Bu makalede özetlenen uygulama ve teknikler, hücre kültürü çalışmalarının yapıldığı araştırma laboratuvarlarına uygulanabilir. Diğer laboratuvar ortamları tartışılmamıştır.
Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken genellikle birincil endişe kaynağıdır. Bu makale bağlamında, kontaminasyon genellikle mantar ve bakterileri ifade eder. Bu makalede özetlenen yöntemin genel amacı, kontaminasyonu önlemek için en iyi uygulamaları kapsamlı bir şekilde tanımlamaktır. Tüm laboratuvar üyeleri, bir araştırma laboratuvarının hücre kültürü odasında çalışırken bu uygulamalara uymalıdır. Laboratuvarlar, tüm çalışanların kontaminasyonu önlemek için bu en iyi uygulamaları kullanmada aktif katılımcılar olmasını sağlamalıdır. Doğru uygulamaların ve tekniklerin bilgisi, hücre kültürlerinin canlı, sağlıklı ve kontaminasyondan uzak kalmasını sağlamaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin gelişimi, literatür araştırmalarına, hücre kültürleriyle çalışma deneyimine ve hem acemilerin hem de deneyimli hücre kültürü çalışanlarının yıllık bazda başvurabilecekleri bir yönteme duyulan ihtiyaca dayanmaktadır.
Tüm araştırma hücre kültürü laboratuvarlarının izlemesi gereken açık, standartlaştırılmış bir tekniğe ihtiyaç vardır. Hücre kültürü kontaminasyonu ile ilgili literatürün çoğunda, mikoplazmanın tespiti, aseptik teknikler, kontaminasyon kaynakları, kontaminantların ortadan kaldırılması ve antibiyotik kullanımı vedüzenli testler 4,5,6,7,8 ile önlenmesi tartışılmaktadır. Bu bilgiler yararlı olsa da, literatürde takip edilmesi gereken uygun hücre kültürü tekniklerini gösteren hiçbir video bulunmamaktadır. Sunulan uygulamaların alternatif tekniklere göre avantajı, hataları daha sonra tespit etmek ve düzeltmek yerine, kontaminasyonu gerçekleşmeden önce önlemeye odaklanmaktır. Ayrıca, aseptik tekniklerin kapsamlı bir gösterimi, mantarların ve bakteri üremesinin önlenmesi hakkında bir tartışma ve biyogüvenlik kabini hava akımı ile ilgili bilgiler hem acemi hem de deneyimli hücre kültürü çalışanları için değerlidir.
Bakteriler ve mantarlar en yaygın iki kirletici türüdür. Bakteri kategorisinde, mikoplazma, küçük boyutu ve fark edilmeden kalırken çoğalma kabiliyeti nedeniyle büyük bir endişe kaynağıdır. Büyümek için ökaryotik hücrelere dayanan sert hücre duvarı olmayan, kendi kendini kopyalayan organizmalardır. Metabolik yetenekleri azalmıştır ve hücre kültürlerinin rutin görsel muayenesinde ve düzenli mikroskobik analizde tanınmadan kalırken büyük ölçüde çoğalabilirler, ancak iletim elektron mikroskobu mikoplazma 9,10'u tespit edebilir. Ayrıca, mikrobiyolojik filtrelerden geçebilirler10. Hücre kültürü ortamı mikoplazmaya besin maddeleri sağlar, ancak ne yazık ki medyayı antibiyotiklerle desteklemek mikoplazma10'u etkilemez. Genel olarak, medyayı antibiyotiklerle desteklemenin gerekli olmadığı unutulmamalıdır; Kirlenmeyi uzak tutmak için uygun teknikler yeterli olmalıdır. Mikoplazma ile enfeksiyon anında hücre ölümüne yol açmaz, ancak veri tekrarlanabilirliğini ve kalitesini etkilediği için araştırmacıları ilgilendirir.
Tüm laboratuvar personeli iyi hücre kültürü uygulamalarına sıkı sıkıya bağlı kalmalıdır. Kültürler yeni satın alındıktan sonra, şu anda yetiştirilirken, kriyoprezervasyondan önce ve sıvı azot 2,10'dan çözüldüklerinde mikoplazma için test edilmelidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya immünoboyama kullanılarak piyasada farklı testler mevcuttur. 3 Literatür, "insan izolatlarının, hücre kültüründe bulunan mikoplazma kirleticilerinin büyük bir yüzdesini temsil ettiğini"5 göstermektedir. 200'den fazla mikoplazma türü tanımlanmış olmasına rağmen, bunların yaklaşık altısı çoğu enfeksiyonu oluşturmaktadır. Bu altı tür M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale ve Acholeplasma laidlawii10'dur. Diğer kontaminasyon türlerinde olduğu gibi, hava ve aerosoller bunları hücre kültürlerine getirir5. Bu, "insan operatörü laboratuvardaki potansiyel olarak en büyük tehlikedir"7 nedeniyle diğer makalelerde de tekrarlanmaktadır. Bu insan hatası ile yapılsa da, standart bir prosedür izlenirse risk ortadan kaldırılabilir. Personelden dökülme sadece mikoplazma kontaminasyonu ile sınırlı değildir; Bir laboratuvardaki hücre kültürleri genellikle aynı mikoplazma türleriyle enfekte olur, bu da kontaminasyonun yanlış hücre kültürü teknikleri nedeniyle bir şişeden diğerine yayıldığını gösterir10.
Çapraz kontaminasyonun önlenmesi de uygun hücre kültürü tekniklerinin izlenmesinin bir başka nedenidir. Dünya çapında hücre hatlarının en az% 15-18'inin çapraz kontamine olabileceği veya yanlış tanımlanabileceği belirtilmektedir11,12. Hücre hatlarını mikoplazma kontaminasyonu açısından test etmenin yanı sıra, çapraz kontaminasyon10 için de test edilmelidirler. İnsan hücre hatları için, kısa tandem tekrarlama (STR) profillemesi adı verilen ucuz bir DNA tabanlı teknikle hücre hattı kimlik doğrulaması, hücre hattı kimliğini 2,10,13,14 doğrulamanın kolay bir yolu olduğu için mevcut uluslararası referans standardıdır. STR, yanlış etiketlenmiş veya çapraz kontamine olmuş hücre hatlarını tanımlayabilir, ancak yanlış doku orijinini tespit edemez10,13,14. Araştırma verilerinin geçerliliği, hücre hatlarının yanlış etiketlenmesi, yanlış tanımlanması veya kirlenmesi durumunda tehlikeye girebilir13. Diğer kontaminasyon türlerine benzer şekilde, aerosollerin yayılmasına neden olan zayıf teknik, bir şişeye giren yanlış hücre tipine yol açan yanlış temas veya farklı hücre hatlarına sahip aynı ortam şişesini ve reaktiflerini kullanan aynı ortam şişesi ve reaktifleri kullanarak çapraz kontaminasyon oluşabilir10. Medya şişelerinin paylaşılmaması gerekir; Bir şişe ortamın iki farklı hücre çizgisi arasında paylaşılması, bu hücre popülasyonlarının karıştırılmasına izin verebilir ve daha hızlı büyüyen hücre tipinin şişeyi tamamen ele geçirmesine neden olabilir. Bu değiştirme fark edilmez ve yanlış etiketlemeye ve yanlış tanımlamaya yol açar2. Bir hücre çizgisi,10'un işlenmesi veya etiketlenmesi sırasında kültürlerin karıştırılması durumunda başka bir hücre çizgisiyle de karıştırılabilir. Reaktifleri, medyayı ve şişeleri birbirinden ayrı tutmaya dikkat edilmelidir. Her laboratuvar üyesinin kendi medya şişeleri olmalıdır; Laboratuvar üyeleri arasında hiçbir paylaşım gerçekleşmemelidir. Hücre hatlarının kendileri nitelikli bir hücre bankasından ve sağlayıcıdan satın alınmalıdır. Laboratuvarlar hücreleri paylaşmamalıdır. Çalışmalar, STR ve mikoplazma testlerinin düzenli olarak kullanılmasına rağmen, literatürdeki birçok araştırma makalesinin yanlış tanımlanmış veya kontamine olmuş hücre hatlarını zaten kullandığını göstermektedir15. Bu sorunlu makaleleri bulmak ve okuyucuları bu konuda geriye dönük olarak bilgilendirmek için araştırmayı gözden geçirmek hantaldır. Önleme, bu sorunun ilk etapta ortaya çıkmamasını sağlamanın en iyi yoludur.
Öğelerin% 70 EtOH ile püskürtülmesinin basit eylemi organizmaları öldürebilir; % 70 EtOH, proteinleri denatüre ederek ve bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere en yaygın kirletici organizmalarda lipitleri çözerek çalışır16. Çalışmalar,% 70'in en etkili konsantrasyon olduğunu göstermiştir; Yüzey proteinleri% 70 EtOH ile hızlı bir şekilde pıhtılaşmaz, böylece hücreye girebilirler, içerdiği su ise proteinlerin denatüre etme işlemi için gereklidir. Hücre duvarının her iki tarafındaki su ve alkolün konsantrasyon farkı nedeniyle,% 70 EtOH hem enzimatik hem de yapısal proteinleri denatüre etmek için hücreye girer. Şişelerde küf büyümesi gözlenirse, tüm inkübatör önce% 70 EtOH ile püskürtülerek ve kuru olarak silinerek dekontamine edilmeli, ardından 60 ° C'de16 saat boyunca inkübasyon yapılmalıdır. Bu çoğu küfü ve bakteriyi öldürür.
Önleme uygulamalarının, kontaminasyon oluştuktan sonra ortadan kaldırmaya yönelik alternatif tekniklere göre temel avantajı, laboratuvar çalışanlarının kontaminasyonu erken önleyerek, hücre kültürlerinin sağlıklı olduğundan ve inkübatörlerin dekontaminasyonu veya hücre kültürlerinin atılması ile ilişkili yüksek maliyetler olmayacağından emin olabilmeleridir. Örneğin, mikoplazma kontaminantlarının daha sonra elimine edilmesi etkili değildir7. Laboratuvar personelinin uygun şekilde eğitildiğinden, hücre kültürü odasının kendi kendine yeten bir yer olduğundan ve standart bir prosedürün kullanıldığından emin olmak için erkenden zaman ayırmak, zamandan ve paradan tasarruf etmenizi sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlıklar
- Genel
- Sadece hücre kültürü odasında giyilmek üzere belirlenmiş temiz bir laboratuvar önlüğü giyin ve laboratuvarın diğer bölümlerinde giyilmemelidir.
NOT: Laboratuvar önlüğünün steril olması gerekmez. - Başka hiçbir yüzeye dokunmamış yeni eldivenler giyin. Eldivenlerin sıkıca oturduğundan emin olun. Nitril, pudrasız eldivenler en iyisidir.
NOT: Eldivenlerin steril olması gerekmez. - İşe hazırlanmak için eldivenleri, laboratuvar önlüğü kollarını ve biyolojik güvenlik kabininin iç kısmına %70 EtOH püskürtün. Çalışma yüzeyini ve cam paneli tüy bırakmayan bir kağıt havluyla kurulayın.
NOT: %70 EtOH kullanmak bakterileri en yüksek verimlilikle öldürür16. Kağıt havlunun steril olması gerekmez. - Su banyolarını hücre kültürü odasının içinde tutun ve bunları sadece kültür ortamını ısıtmak veya hücreleri çözmek için kullanın. Su banyolarını haftada bir kez, üreticinin temizlik talimatlarını izleyerek boşaltın ve yıkayın.
- Sadece hücre kültürü odasında giyilmek üzere belirlenmiş temiz bir laboratuvar önlüğü giyin ve laboratuvarın diğer bölümlerinde giyilmemelidir.
- Biyolojik güvenlik kabininin içinde
- Kabine getirilen öğelerin sayısını sınırlayın. Ön veya arka ızgaraları bloke ederek biyolojik güvenlik kabini içindeki hava akışını kesmeyin.
NOT: Havanın kabin içinde nasıl aktığına dair bir açıklama için Şekil 1'e bakınız. - Dolabın içine yerleştirilen tüm eşyaları %70 EtOH ile püskürtün ve kurulayın. Medya şişesinin üst kısmını püskürterek ve aşağı doğru çalışarak başlayın. Benzer şekilde, temiz bir kağıt havluyla, kademeli olarak tabana doğru çalışarak kurulayın. Tekrar kapağa doğru gitmeyin.
- Kabin serolojik pipetleri barındıracak kadar büyükse, içine yerleştirilebilirler, aksi takdirde kabinin dışına monte edilmiş bir kapta saklanabilirler. Kullanmadan önce muhafazalı pipetin her iki tarafında da delik, yırtılma veya delinme olup olmadığını kontrol edin. Sargıyı sökmeyin. Bunun yerine, sargının uçlarını nazikçe soyun, serolojik pipeti bir pipet yardımcısına yerleştirin ve sargıyı tek bir akışkan hareketle çıkarın.
- Açık şişelerin veya şişelerin üzerine gelmeyin; Açık şişelerin veya şişelerin üzerine uzanın veya biyolojik güvenlik dolabında önceden açılmış eşyaların üst kısımlarındaki eşyaları açın.
NOT: Kabin içindeki hava akımı çalışma yüzeyinde aşağı doğru itilir, bu nedenle örneğin manşonda bulunan herhangi bir kirlenme hücre kültürlerine girebilir. - Sıvı dökmeyin. Bunun yerine, serolojik bir pipet kullanarak ekleyin. Medyayı tamamladıktan sonra, içeriği iyice karıştırın ve şişeyi başlatın. Ayrıca, medyanın desteklendiği şey için bir etiket eklediğinizden emin olun.
- Kabine getirilen öğelerin sayısını sınırlayın. Ön veya arka ızgaraları bloke ederek biyolojik güvenlik kabini içindeki hava akışını kesmeyin.
2. Yapışkan hücre hatları ile çalışma
- Plastik bir şişeye ihtiyaç duyulursa, tüm torbayı püskürtün ve dolabın içine yerleştirin.
- Ortamı veya yıkama solüsyonlarını aspire etmek için otoklavlanmış cam pipetler veya tek kullanımlık steril plastik pipetler kullanın. Metal kapağı saklama kabından dikkatlice çıkarın. Bir cam pipeti, kabı bir açıyla hafifçe sallayarak izole edin. Kabın içine ulaşırken, diğer pipetlere dokunmaktan kaçının.
NOT: Seçilen pipeti yalnızca bir uçtan tutun. - Şişelerin üzerindeki kapakları mümkün olan en kısa sürede hızlı bir şekilde değiştirin. Kapakları çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin, böylece jant çalışma yüzeyine temas etmez. Kapağı üstten veya alttan tutmayın; bunun yerine, yanlardan kapaklara dokunun.
- Sıvıları aspire ederken, kabinin dışında bulunan bir vakum tuzağı şişesini zemindeki ikincil bir kapta kullanın.
NOT: Torbalar sızacağından biyolojik tehlike altındaki atık torbalarına sıvı atık atmayın. Kabin içinde çalışırken atık oluşacaktır. Elleri kabine çok sık girip çıkarmak hava akışını keser. Herhangi bir atığı geçici olarak kabinin içinde bırakın. İşi kesintiye uğratmaması için yana doğru yerleştirin. - Eldivenleri kuruduklarında cömertçe %70 EtOH ile püskürtün. Eldivenlerin ıslak damlamaması için ellerinizi birbirine sürün.
- Serolojik bir pipet yanlışlıkla kabindeki bir şeye dokunursa, dışarı atmaktan çekinmeyin. Kirlenmiş olabilecek bir pipet kullanmak yerine temiz bir serolojik pipetle yeniden başlayın.
4. Hücrelerin kontrol edilmesi ve saklanması
- Hücreleri inkübatöre yerleştirmeden önce, mikroskop altında nasıl göründüklerini kontrol edin. Hücreler iyice askıya alınmışsa, tek hücreler gözlenmelidir.
- Konuşmayın, hapşırmayın, öksürmeyin veya inkübatörlere ağır nefes almayın. İnkübatör kapılarını hızla açın ve kapatın. Kapıları gerekenden daha uzun süre açık bırakmak, havada bulunan kirleticilerin inkübatörlere girmesine izin verebilir.
NOT: Hücre kültürü odasında çalışırken maske takmak yardımcı olabilir, çünkü insan ağzında mikoplazma bulunabilir. Hücre kültürü odasında cep telefonu kullanmaktan kaçının, çünkü konuşma tavsiye edilmez. - Şişeleri kabinden çıkarmadan önce tüm şişelerdeki kapakların sıkıca kapatıldığından emin olun.
- Hücre kültürü ortamını, ışığa duyarlı olduğu için kullanılmadığında karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
- Hücre kültürü çalışması tamamlandıktan sonra kabinin içine% 70 EtOH ile tekrar püskürtün ve yüzeyi bir kağıt havlu ile silin. Biyolojik tehlike çöp atık torbalarını boşaltın. Bu işlemi tekrarlayın ve farklı bir hücre hattına geçerken eldivenleri değiştirin.
5. Süspansiyon hücre hatları ile çalışma
- Cam şişelerde yetiştirilen süspansiyon hücreleri için, eldivenlerin% 70 EtOH ile iyice püskürtüldüğünden emin olun, ardından alüminyum folyoya ıslak eldivenlerle dokunun ve dolabın içine yerleştirmeden önce şişenin sadece altına püskürtün.
- Hücre sayımı için bir örnek alırken, kabından sadece bir adet 1,5 mL tüp çıkarın. Başka tüplere dokunmayın. Kapağı çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. İç kenara dokunmayın. Yanlardan dikkatlice tutun ve bittiğinde değiştirin.
- Şişenin tüm boynunu kaplayan çift katlı alüminyum folyo parçasını dikkatlice çıkarın. Folyo çıktıktan sonra cam şişeyi yalnızca alttan tutun - boynunuzdan dokunmayın. Hücre sayımı için örnek almak üzere 1 mL'lik bir serolojik pipet kullanın.
- Medyanın şişelerin yanından aşağı damlamasına izin vermeyin; eğer öyleyse,% 70 EtOH içeren bir kağıt havlu püskürtün ve hemen temizleyin.
- Şişeleri veya şişeleri biyolojik güvenlik dolaplarından çıkarmadan önce kapakların ve alüminyum folyoların sıkıldığından emin olun.
6. Hücre inkübasyonu
- Farklı hücre tiplerinin çapraz kontaminasyonunu önlemek için farklı hücre tipleri için ayrı inkübatörler kullanın.
7. Sıvı atık toplama
- Sıvı atıkları, zemindeki dolabın dışında bulunan bir vakum kapanı şişesinde, 'Atık' etiketli ikincil bir kapta toplayın.
NOT: Hortum, aylık olarak değiştirilen yüksek verimli bir partikül emici (HEPA) filtreye bağlanır.
8. Temizleme
- Biyolojik tehlike atık torbasını çıkarın ve cam şişeleri mümkün olan en kısa sürede yıkayın. Lavabonun yanında bir cam yıkama protokolü bulundurun. Yıkama protokolü için Ek Dosya 1'e bakın.
- Hücre kültürü cam eşyalarını bir cam yıkama tesisine göndermek yerine otoklavlayın. Laboratuvarın ana alanındaki cam eşyalardan ayrı tutun.
NOT: SF-9 hücreleri, cam iyi temizlenmemişse, şişelerin yanında bir ölü hücre kenarı bırakır. Otoklav protokolü için Ek Dosya 1'e bakın.
9. Organizasyon
- Hücre kültürü odasını, tüm malzemeler tek bir alanda bulunacak şekilde düzenleyin, böylece laboratuvar üyelerinin malzeme aramak için odadan ayrılma ihtiyacını en aza indirin.
- Hücreleri toplamak için kullanılan ve daha sonra hücre kültüründe yeniden kullanılan plastik şişeleri 'Sadece Hücre Kültürü Kullanımı İçin' olarak etiketleyin. Belirli bir hücre tipi için belirlenmiş hücre kültürü şişelerini kullanın. Kolay erişim için şişeleri hücre kültürü odasında saklayın.
10. Bakteri, mantar ve mikoplazma kontaminasyonunun tanımlanması
NOT: Yukarıdaki iş akışına uyulmaması bakteriyel, mantar ve mikoplazma kontaminasyonuna yol açabilir.
- Her zaman çalışmaya başlamadan önce, ağır bulanıklık, bulanık toplar şeklinde ekstra büyüme ve yandaki yoğun hücre birikimleri için şişeleri gözlemleyin, bunların hepsi kirlenmenin göstergeleridir.
NOT: Deneyimli bir göz, mikrobiyal kontaminasyonun neden olduğu bulanıklık ile gerçek hücreler arasındaki farkı söyleyebilir. Hücreler normalde berrak ortamın bulanık görünmesine neden olurken, bakteriyel kontaminasyon beyaz renkte ağır bulanıklığa neden olur.- Ortamda yüzen yuvarlak, bulanık topların görünümünü not ederek küf kontaminasyonunu görsel olarak tanımlayın (bkz. Şekil 2).
- Ortam bulutlu, beyaz veya çalkantılı olduğunda bakteriyel kontaminasyonu görsel olarak tanımlayın (bkz. Şekil 2).
- Aylık mikoplazma testi yaparak mikoplazma kontaminasyonunu tanımlayın. PCR tabanlı bir test, kullanıcılara 1,5 mL'lik bir hücre örneği almalarını, 10 μL kullanarak hücre sayımı yapmalarını, 0,08 x 106 hücre / mL'ye seyreltmelerini, hücreleri aşağı döndürmelerini, kitte bulunan tamponu kullanarak hücreleri lize etmelerini ve son bir kez aşağı döndürmelerini söyler. Süpernatant, bir dizi mikoplazma türünü güçlendiren primerlerle inkübe edilir. Bantları görselleştirmek için bir DNA jeli çalıştırın. Bant olmaması, mikoplazmanın tanımlanmadığı anlamına gelir.
NOT: Bu ana kirletici insan ağzında bulunabilir. Hücrelerdeki mikoplazma kontaminasyonunu çözdükten sonra ve deneyler için kullanmadan önce test etmek iyi bir uygulamadır. Daha sonra, hücreleri ayda bir kez mikoplazma kontaminasyonu açısından izleyin. Birçok şirket mikoplazma test kitleri sunmaktadır. Uygun olanı seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede özetlenen uygun hücre kültürü teknikleri ve uygulamaları takip edilmezse, araştırma hücre kültürü laboratuvarında mantar ve bakteriler tarafından kontaminasyon meydana gelebilir. Şekil 2'de hem süspansiyonda hem de yapışkan kültürlerde kontaminasyon içeren şişeler görülmektedir.
Aseptik tekniklere uyulmadığında, küf kontaminasyonu 2-3 gün sonra ortaya çıkabilir. Ortamda yüzen yuvarlak bulanık toplar süspansiyon hücrelerinde fark edilirken, bağlı hücrelerdeki küf büyümesi büyük, düzensiz, beyaz veya yeşil lekeler olarak gözlemlenebilir.
Bakteriler için ertesi gün kontaminasyon gözlenir. Medya çalkantılı, beyaz ve bulutlu. Beyaz renk, hücre çizgilerinden çok daha hızlı çoğalan bakteri hücrelerinin tipik bir örneğidir. Deneyimli bir göz, kontamine olmayan ortam ile kontamine ortam arasındaki farkı söyleyebilir. Ekli hücreler için, şişede herhangi bir türbülans görülüp görülmediğini kontrol etmek için bir şişe açılmamış ortam bir şişe ile karşılaştırılabilir.
Biyolojik güvenlik kabininin içinde, ürün sayısı minimumda tutulmalıdır. Arka ve ön ızgaralara eşya yerleştirmekten kaçının (bkz. Şekil 3). Bu kabinde bir dizi pipet, uç, otoklavlanmış cam pipet, pipet yardımcısı ve işaretleyici bulunur. Ortadaki çalışma alanı açık. Dolapları bu şekilde organize etmek iyi bir fikirdir. Ek olarak, operatör çalışmaya başlamadan önce temiz bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giymelidir. Operatörün eldivenlerini sık sık püskürtebilmesi için %70 EtOH içeren bir sprey şişesi yakınlarda tutulmalıdır. Cilt eldiven veya laboratuvar önlüğü ile kaplıdır. Operatör, kabin içinde çalışırken sandalyesini kolları 90° açıyla olacak şekilde ayarlamalı ve eşyalar kabin içinde kolayca erişilebilecek bir yerde olmalıdır (bkz. Şekil 4).
Birçok mikoplazma türü, PCR tabanlı bir tahlil kullanılarak güvenilir bir şekilde tanımlanabilir. Şekil 5 , negatif bir mikoplazma testinin sonuçlarını göstermektedir. Soldaki bant, DNA için moleküler ağırlık standartlarını göstermektedir. Sağdaki dört bant pozitif kontrollerdir. Test edilen hücre tiplerinin altında hiçbir bant görünmez, çünkü mikoplazma tespit edilmemiştir.
Medya pH göstergeleri içeriyorsa, 7.4'teki hücrelerin optimal pH değeri için kırmızı olacaktır. Hücreler büyüdükten sonra, ortam rengi kırmızıdan sarıya3 değişecektir. Bu renk değişimi, bakteriler şişeyi ele geçirip aşırı büyürse de ortaya çıkabilir (Şekil 6). Sarı renk pH'ın düşük olduğunu gösterir. Bir şişenin yanında yeni, açılmamış bir ortam şişesini gözlemlemek, bağlı hücrelerdeki kontaminasyonu gözlemlemenin objektif bir yoludur. Süspansiyon kültürleri için, kullanıcı şişeyi ortamda yüzen herhangi bir büyüme için veya cam şişenin iç kısmında kalın bir büyümüş bakteri hücresi halkası olup olmadığını yakından gözlemleyebilir. Her iki hücre tipi için de mikroskop altında küçük bir örnek alınabilir ve gözlemlenebilir. Diğer büyümeler veya hücre şekilleri gözlenirse, özellikle hücreler hareket ediyorsa, bu kontaminasyonun bir göstergesidir (Şekil 7). Hücre sayımından önce hemositometrenin kapsamlı bir temizliği yapılmalıdır, çünkü bu tür döküntüler hücre kültürlerinin kendisinde değil, sadece hemositometrede bulunabilir.
Koku, bir inkübatördeki kontaminasyonun başka bir göstergesi olabilir. Bakteriyel aşırı çoğalma, deneyimli bir hücre kültürü kullanıcısının fark edeceği tipik bir kokuya sahiptir. Koku her zaman kontamine bir şişe ile çakışmaktadır, ancak enfekte olmuş bir şişe her zaman tüm inkübatörün kokmasına neden olmayabilir.
Küf kontaminasyonu, süspansiyonda yetiştirilen HEK 293 S hücrelerinde daha yaygın olma eğilimindedir. Bakteriyel kontaminasyon SF-9 hücrelerinde daha yaygındır. Bunun nedeni, RIC hücrelerinin nemle büyümesi ve böylece inkübatörlerde nem birikmesine yol açması olabilir. SF-9 hücreleri nem olmadan yetiştirilir, bu nedenle ortam daha kurudur. Yapışkan kültürlerdeki kontaminasyon oranı, süspansiyon kültürlerindeki kontaminasyon oranından daha azdır. Bunun nedeni daha küçük şişe boyutu, şişenin yeniden kullanılamaz doğası veya alüminyum folyo kullanımı yerine havalandırmalı kapak olabilir.
Mikoplazma çıplak gözle veya normal bir ışık mikroskobu ile gözlenemez, ancak özel transmisyon elektron mikroskobu mikoplazmayı tespit edebilir. Hücre kültürlerini aylık olarak test etmek için bir mikoplazma tanımlama kiti kullanılmalıdır. Birçok mikoplazma türü, PCR tabanlı bir tahlil kullanılarak güvenilir bir şekilde tanımlanabilir. Bu PCR testinin nasıl yapıldığı hakkında kısa bir açıklama protokol bölümünde, mikoplazma hakkında daha fazla bilgi ise tartışma bölümünde bulunabilir.
Resim 1: Bir biyogüvenlik kabininde havanın nasıl aktığı. Biyolojik güvenlik dolapları, kirli havayı odanın kendisinden ve kabinden ön ve arka ızgaralardan çeker. Bu hava, metal çalışma yüzeyinin altına, kabinin arkasına ve bir HEPA filtresinin bulunduğu ünitenin üstüne kadar gider. Orada, hava filtreden geçer ve filtrelenir. Bu temiz hava çalışma yüzeyini aşağı doğru iter. Filtrelenmiş hava akışının kabin içinde nasıl aşağı itildiği nedeniyle, asılı kalmamak iyi bir uygulamadır. Örneğin, açık bir şişenin üstünde bir manşona sahip olmak istenmez ve herhangi bir potansiyel kirleticinin ortama itilmesi riski vardır. Dolabın içine getirilen eşya sayısı minimumda tutulmalı, hava akışını kesintiye uğratmamak için ön veya arka ızgaralara eşyalar yerleştirilmemelidir. Kolları kabinin içine ve dışına çok hızlı hareket ettirmek de hava akışını bozabilir. NuAire, Inc. için Jeff Kaphingst, Jeff the Designer, LLC tarafından oluşturulmuştur. İzinle kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kirlenmemiş süspansiyon ve yapışkan hücreler ve küf veya bakterilerle kontamine olmuş hücreler. Soldaki ilk görüntü, kontamine olmayan böcek hücreleri (SF-9 hücreleri) içermektedir. İkinci görüntü, küfle kirlenmiş bu hücrelerin başka bir şişesini göstermektedir. Üçüncü şişe, kalın, beyaz, bulutlu görünümden de anlaşılacağı gibi bakteriler tarafından kirletilmiştir. İkinci ve üçüncü şişeler kontamine oldu, çünkü uygun hücre kültürü tekniklerinin ve uygulamalarının hiçbiri takip edilmedi. Tüm şişeler aynı gün hazırlandı. Ertesi gün bakteriyel kontaminasyon ve 2 gün sonra küf kontaminasyonu için büyüme gözlendi. Kontamine olmayan yapışkan hücreler (Hek293 hücreleri), yapışkan kültürlerde küf ve bakteriyel kontaminasyon ile birlikte gösterilmiştir. Küf kontaminasyonu ikinci satırda yuvarlak bir Petri kabında gösterilmiştir. Fotoğraf yemeğin üstünden çekilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre kültürü kabine organizasyonu. Biyolojik güvenlik kabininin içinde, öğelerin miktarı minimumda tutulmalıdır. Arka ve ön ızgaralara eşya yerleştirmekten kaçınılmalıdır. Bu kabinde bir dizi pipet, uç, otoklavlanmış cam pipet, pipet yardımcısı ve işaretleyici bulunur. Ortadaki çalışma alanı açık. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir operatörün akış davlumbazının altında çalışması için doğru yol. Bir operatör çalışmaya başlamadan önce temiz bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giymelidir. Operatörün eldivenlerini sık sık püskürtebilmesi için %70 EtOH içeren bir sprey şişesi yakınlarda tutulmalıdır. Cilt eldiven veya laboratuvar önlüğü ile kaplıdır. Operatör, kabin içinde çalışırken sandalyesini kolları 90° açıyla olacak şekilde ayarlamalıdır. Eşyalar kabinin içinde kolayca erişilebilecek bir yerde olmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Negatif bir mikoplazma testi sonucu. Birçok mikoplazma türü, PCR tabanlı bir tahlil kullanılarak güvenilir bir şekilde tanımlanabilir. Soldaki bant, DNA için moleküler ağırlık standartlarını göstermektedir. Sağdaki dört bant pozitif kontrollerdir. Test edilen hücre tiplerinin altında hiçbir bant görünmez, çünkü mikoplazma tespit edilmemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Normal ortam rengi kırmızıdan sarıya değişir. Hücre kültürü ortamı, pH göstergeleri mevcutsa rengi kırmızıdan sarıya değiştirir. Sarı renk, pH'ın düşük olduğunu ve ortamın değiştirilmesi gerektiğini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Işık mikroskobu altında gözlenen kirleticiler. Hücre sayımı yapılırken ışık mikroskobu altında başka büyümeler veya hücre şekilleri gözlenirse, bu kontaminasyonun bir göstergesi olabilir. Hücre sayımından önce hemositometrenin kapsamlı bir şekilde temizlenmesi gerektiğine dikkat edilmelidir, çünkü bu tür döküntüler hücre kültürlerinin kendisinde değil, sadece hemositometrede bulunabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Ek Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken birincil endişelerden biri olsa da, bu makalede özetlenen uygulamalar ve teknikler risklerin azaltılmasına yardımcı olacaktır. Kritik adımlar arasında, sadece hücre kültürü odasında kullanılan temiz bir laboratuvar önlüğü giymek, sık sık% 70 EtOH ile püskürtülen ve hücre hatları arasında geçiş yaparken değiştirilen temiz, pudrasız eldivenler kullanmak, her bireyi medya şişelerini paylaşmamaya teşvik etmek, kabini işten önce ve sonra iyice temizlemek, Serolojik pipetlerin ambalajını düzgün bir şekilde açmak, açık şişeler veya şişelerle uzun süreli yakın temastan kaçınmak, ortam şişelerini birden fazla hücre hattı arasında paylaşmamak ve inkübatör kapılarını hızla açıp kapatmak. Ek olarak, kişinin kendi cam eşyalarını yıkaması ve otoklavlaması, kalite kontrolünü sağlar, böylece dış kirleticilerin girme olasılığını azaltır. Kalite kontrol yöntemleri, sterilizatörün 121 ° C'lik uygun sıcaklığa ulaşıp ulaşmadığını belirtmek için otoklav bandı kullanılmasını, ekipmanın düzenli önleyici bakımını ve şişenin düzgün bir şekilde temizlendiğinden emin olmak için görsel olarak incelenmesini içerir18. Bir diğer önemli nokta, bir hücre tipinden kaynaklanan kontaminasyonun başkalarına aktarılmamasını sağlamak ve ayrıca hücrelerle çapraz kontaminasyonun oluşmamasını sağlamak için farklı hücre tipleri için ayrı inkübatörler kullanmaktır.
Bakteriyel ve fungal enfeksiyonlar, hücre kültürlerinde en yaygın iki davetsiz misafirdir. Başlıca kirleticilerden biri olan M. orale, insan ağzındaki en yaygın mikoplazma türüdür ve aynı zamanda "hücre kültürlerindeki tüm mikoplazma enfeksiyonlarının% 20-40'ını oluşturan en yaygın izolatı temsil eder"4. Başka bir deyişle, laboratuvar personeli bu kontaminasyonun ana kaynağıdır. Mikoplazma, 0.45 μm filtrelerden geçebilen sert bir hücre duvarından yoksun küçük, yavaş büyüyen bir mikroorganizma olduğu için hücre kültürü odasında her zaman bir endişe kaynağıdır4. Çalışmalar, mikoplazma kontaminasyonunun insidansının sürekli insan veya hayvan hücre hatlarının% 15-35'i olduğunu göstermektedir4. Ayrıca, istatistikler dünyadaki hücre hatlarının yaklaşık% 5 ila% 30'unun mikoplazmalarla kontamine olduğunu göstermektedir6. Ne yazık ki, mikoplazma hücre kültürü için kullanılan antibiyotiklerin çoğuna dirençlidir ve enfeksiyon hücre fizyolojisini ve metabolizmasını etkileyebilir 4,6. Kontaminasyon hücre metabolizmasını yavaşlatmasa da, nihai ürünü kirletebilir6. Enfeksiyonlar, laboratuvar üyeleri hücre hasarını fark etmeden etrafta dolaşabilir. Kontaminasyon meydana gelirse, yeni hücrelerin çözülmesinin maliyeti, yeni kültürleri yaymak için harcanan zaman, boşa harcanan pahalı medya, inkübatörlerin dekontamine edilmesi ve meslektaşların deneylerine tekrar başlamak için beklemek için harcadıkları zaman miktarı muazzamdır. Laboratuvarımız toplam kayıp zamanın 2 hafta boyunca hesaplandığını ve 8 L'lik tipik bir insan memeli hücresi proteini ekspresyonunun kontaminasyonu ile ilişkili toplam maliyetin 1.400 dolar olduğunu tahmin ediyor. Bu makalede özetlenen uygulamalar ve teknikler, ek maliyetleri, kayıp hücreleri ve kesinti sürelerini azaltmak için iyi önleyici tedbirler sunmaktadır.
Bu uygulamaların değiştirilmesi önerilmez. Tüm laboratuvar üyeleri hücre kültürü odasında çalışmadan önce eğitilmeli ve daha sonra her yıl tazeleme eğitimi almalıdır7. Laboratuvar üyeleri ayrıca hücre kültürü odasını, gerekli tüm malzemeler tek bir alanda olacak şekilde organize etmeli, böylece laboratuvar üyelerinin malzeme aramak için hücre kültürü odasından çıkma ihtiyacını en aza indirmelidir.
Kontaminasyonun serum, inkübatörler, arızalı otoklavlar, kirli laboratuvar önlükleri veya hücrelerin kaynağı gibi dış kaynaklardan gelmesi durumunda sunulan tekniklerin sınırlamaları gözlenir. Bu protokole sıkı sıkıya bağlı kalınmasına rağmen kontaminasyon meydana gelirse tekniğin sorun giderilmesi gerekli olabilir. Birçok dış faktör bu tür kontaminasyona katkıda bulunabilir. Laboratuvar üyelerinin ihtiyatlı olması ve dış kaynakları kontrol etmesi gerekir. Örneğin, tedarikçiden satın alınan fetal sığır serumu (FBS) lotu mikoplazma ile kontamine olmuş olabilir. 1950'lerle karşılaştırıldığında, bu şimdi nadir görülen bir durumdur, ancak yine de olabilir6. Herhangi bir kontaminasyon fark edilirse tüm medya şişeleri atılmalı ve protokol yeni hücreler çözülerek ve yeni ortamlar kullanılarak yeniden başlatılmalıdır. Kontaminasyon, küf veya bakteri ise, inkübatörün içinde zaten mevcut olabilir; Aynı inkübatörün içindeki diğer şişeler, bakteri veya küf büyümesinin gözlenip gözlenmediğini görmek için kontrol edilmelidir. Kirlenmiş tüm şişeler atılmalı ve inkübatör dekontamine edilmelidir. Herhangi bir kontaminasyon bulunmazsa, otoklav arıza hataları açısından kontrol edilmelidir; cam eşyalar ilk etapta düzgün bir şekilde otoklavlanmamış olabilir. Otoklav bandı, otoklavın 121 °C'ye ulaşmamasına rağmen renk değiştirebilir. Daha sonra kullanılan antibiyotik solüsyonlarının son kullanma tarihleri kontrol edilmeli; Yeni çözümlerin satın alınması gerekebilir. Son olarak, hücrelerin kaynağı göz önünde bulundurulmalıdır; Güvenilir bir laboratuvar tedarikçisinden mi yoksa başka bir laboratuvardan mı ödünç alındılar? Hücreler her zaman güvenilir bir laboratuvar tedarikçisinden satın alınmalı ve asla başka bir laboratuvardan ödünç alınmamalıdır. Son olarak, laboratuvar önlükleri temizliklerini sağlamak için yıkanmalıdır19. İnkübatörlerin dekontaminasyonu, bir şişe kirlendiğinde düşünülmelidir. Bakteri hücrelerinin veya küf sporlarının çoğalmasına ve kontaminasyonun yayılmaya devam etmesine izin verilmemelidir.
Mevcut yöntemler kontaminasyonun ortadan kaldırılmasına yansımaktadır. Bu makalede özetlenen yöntemler, kontaminasyonun ortadan kaldırılmasından ziyade önlenmesine odaklanmaktadır. Mikoplazma20'yi çıkarmak için antibiyotik kullanımı ile ilgili çeşitli prosedürler mevcuttur. Bununla birlikte, antibiyotik kullanımı enfeksiyonu tamamen ortadan kaldırmayabileceğinden ve "dirençli organizmaların gelişmesine izin verebileceğinden" risklidir12. Aslında, "antibiyotiklerde sürekli olarak yetiştirilen kültürlerin% 72'sinin mikoplazma pozitif olduğu gösterilirken, antibiyotik yokluğunda yetiştirilen sadece% 7'si enfekte olmuştur"12. Bu veriler, antibiyotik kullanımı tavsiye edilirken ve yararlı olabilirken, antibiyotiklere aşırı kullanım veya tamamen güvenmenin yararlı olmadığı fikrini vurgulamaktadır. Ayrıca, kontaminasyonu gidermek için antibiyotik kullanmak sadece sorunun devam etmesine izin verebilir. Antibiyotik çözeltileri gerekli değildir; Bu makaledeki teknikler takip edilirse, kontaminasyon başarılı bir şekilde önlenmelidir.
Bu makalede özetlenen uygulamalar ve teknikler, gelecekte aylık mikoplazma testi yapılırken ve ev yapımı yetkin bakteri hücreleri yapılırken aseptik bir ortam sağlamak için kullanılabilir. Her iki protokol de hücre kültürü çalışmalarına benzer şekilde temiz bir ortam gerektirir, böylece nihai ürün kirlenmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın herhangi bir çatışan çıkarı yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nün (HHMI) finansmanı sayesinde mümkün olmuştur. Laboratuvar başkanımız Jue Chen'e makaleyi okuduğu ve sürekli desteği için, Donna Tallent'e yararlı düzenlemeleri ve yorumları için ve Rockefeller Üniversitesi Bilgi Teknolojisi Bölümü'nden Jeff Hennefeld'e bu makalenin video bileşenindeki yardımları için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N.
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R.
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020).
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties (2023).
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004).
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023).
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020).
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
