Summary
Het vastleggen van dynamische veranderingen in de eiwitactivering van geënucleeerde rode bloedcellen brengt methodologische uitdagingen met zich mee, zoals het behoud van dynamische veranderingen in acute stimuli voor latere beoordeling. Het gepresenteerde protocol beschrijft monstervoorbereidings- en kleuringstechnieken die het behoud en de analyse van relevante eiwitveranderingen en daaropvolgende detectie mogelijk maken.
Abstract
Antilichaamlabeling van rode bloedcellen (RBC) -eiwitten is een veelgebruikte, semi-kwantitatieve methode om veranderingen in het totale eiwitgehalte of acute veranderingen in eiwitactiveringstoestanden te detecteren. Het vergemakkelijkt de beoordeling van RBC-behandelingen, karakterisering van verschillen in bepaalde ziektetoestanden en beschrijving van cellulaire coherenties. De detectie van acuut veranderde eiwitactivering (bijvoorbeeld door mechanotransductie) vereist een adequate monstervoorbereiding om anders tijdelijke eiwitmodificaties te behouden. Het basisprincipe omvat het immobiliseren van de doelbindingsplaatsen van de gewenste RBC-eiwitten om de initiële binding van specifieke primaire antilichamen mogelijk te maken. Het monster wordt verder verwerkt om optimale omstandigheden te garanderen voor de binding van het secundaire antilichaam aan het overeenkomstige primaire antilichaam. De selectie van niet-fluorescerende secundaire antilichamen vereist aanvullende behandeling, waaronder biotine-avidinekoppeling en de toepassing van 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) om de kleuring te ontwikkelen, die in realtime onder een microscoop moet worden gecontroleerd om de oxidatie, en dus de kleuringsintensiteit, op tijd te stoppen. Voor de detectie van de kleurintensiteit worden beelden gemaakt met een standaard lichtmicroscoop. Bij een wijziging van dit protocol kan in plaats daarvan een fluoresceïne-geconjugeerd secundair antilichaam worden toegepast, wat het voordeel heeft dat er geen verdere ontwikkelingsstap nodig is. Deze procedure vereist echter een fluorescentieobjectief dat aan een microscoop is bevestigd voor kleuringsdetectie. Gezien de semi-kwantitatieve aard van deze methoden, is het noodzakelijk om verschillende controlevlekken te verstrekken om rekening te houden met niet-specifieke antilichaamreacties en achtergrondsignalen. Hier presenteren we zowel kleuringsprotocollen als de bijbehorende analytische processen om de respectieve resultaten en voordelen van de verschillende kleuringstechnieken te vergelijken en te bespreken.
Introduction
Rode bloedcellen (RBC's) doorkruisen het cardiovasculaire systeem gedurende 70 tot 140 dagen, met een gemiddelde RBC-leeftijd van ongeveer 115 dagen 1,2. Senescente of beschadigde RBC's worden uit de circulatie verwijderd door erytrofagocytose, een efficiënt zuiveringsproces aangedreven door macrofagen3. De vooraf bepaalde levensduur van deze cellen is een gevolg van het opgeven van de celorganellen, inclusief de kern, mitochondriën en ribosomen, tijdens differentiatie en rijping4. Circulerende RBC's zijn dus verstoken van een translationele machinerie, waardoor de synthese van nieuwe eiwittenwordt uitgesloten 3. Hieruit volgt dat dynamische, posttranslationele modificaties aan bestaande eiwitten het enige levensvatbare mechanisme vormen van acute, biochemische regulatie als reactie op extracellulaire en intracellulaire stressoren die inwerken op RBC's5.
Mechanische krachten lijken de belangrijkste extracellulaire signalen te zijn die de activering of modulatie van biochemische routes binnen RBC's veroorzaken. De ontdekking van het mechanosensitieve eiwit, Piezo1, in RBC-membranen6 inspireerde verschillende onderzoekslijnen naar mechanisch geactiveerde signalering in deze cellen7. Recente ontwikkelingen hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de fysische eigenschappen van RBC's actief worden gereguleerd door acute en dynamische veranderingen van eiwitten8, waaronder posttranslationele fosforylering en ubiquitinatie9. Aangezien deze normale modificaties verschillen in bepaalde ziekten 9,10,11, lijkt het van wetenschappelijk en klinisch belang om de activeringstoestand van RBC-eiwitten te bepalen, specifiek met betrekking tot mechanobiologische processen.
De bepaling van acute veranderingen in RBC-eiwitactiveringstoestanden brengt enkele methodologische uitdagingen met zich mee. De opslag van RBC-monsters voor latere analyse vereist bijvoorbeeld behoud van de gemodificeerde RBC-eiwitten, omdat posttranslationele modificaties niet duurzaam zijn. Bovendien zijn klassieke eiwitdetectiemethoden (bijv. Western blotting) notoir moeilijk te standaardiseren in RBC's vanwege de lage overvloed aan eiwitten ten opzichte van hemoglobine, dat goed is voor ~ 98% van het eiwitgehalte in deze cellen12. Op antilichamen gebaseerde kleuring van chemisch geconserveerde RBC's is dus de voorkeursmethode geweest bij het onderzoeken van acute modificaties van belangrijke RBC-eiwitten, zoals de RBC-specifieke isovorm van stikstofmonoxidesynthase (RBC-NOS)13,14. Van RBC-NOS is aangetoond dat het enzymatisch stikstofmonoxide (NO) produceert, wat onmisbaar lijkt voor essentiële RBC-eigenschappen, waaronder RBC-vervormbaarheid15,16,17. Posttranslationele modificaties van RBC-NOS reguleren de katalytische enzymactiviteit, waarbij fosforylering van het serine 1177-residu wordt beschreven om de enzymactiviteit te verhogen, terwijl fosforylering van de residuen serine 114 of threonine 495 in verband is gebracht met verminderde RBC-NOS-activiteit18,19.
Gezamenlijk dragen tijdelijke modificaties van RBC-eiwitten bij aan een belangrijke cellulaire functie en gestandaardiseerde protocollen die detectie van deze gemodificeerde eiwitten mogelijk maken, zijn van hoge waarde. Hier presenteren we twee verschillende protocollen die specifieke antilichamen gebruiken om de detectie van RBC-NOS-eiwitactivering te vergemakkelijken en bespreken we aanbevelingen voor gegevensanalyse en -interpretatie.
De prestaties van de beschreven protocollen werden beoordeeld door de goed gerapporteerde toename van de fosforylering van RBC-NOS bij het serine 1177-residu te meten als reactie op mechanische krachten die reflecteren op die welke optreden in de menselijke vasculatuur (5 Pa).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier beschreven protocollen zijn in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en zijn goedgekeurd door de ethische commissies van de Duitse Sportuniversiteit Keulen (16-9-2013) en de Griffith-universiteit (2019/808). Vrijwilligers werden gescreend om de afwezigheid van relevante pathologieën te garanderen en gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. Kleuring van RBC-eiwitten met behulp van immunohistochemische protocollen
OPMERKING: Een gedetailleerde lijst van de vereiste chemicaliën en materialen is opgenomen in de materiaaltabel. De volgende secties beschrijven de bereiding van de vereiste oplossingen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van het immunohistochemieprotocol (figuur 1).
Figuur 1: Schema van de afzonderlijke stappen die nodig zijn voor de immunohistochemische en immunofluorescentiekleuring van RBC-NOS op fosforyleringsplaats 1177. Een typische workflow van de gepresenteerde protocollen die zich uitstrekt van oplossingsvoorbereiding en bloedafname tot op antilichamen gebaseerde detectie en visualisatie wordt gepresenteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Afname van bloedmonster
- Verkrijg bloedmonsters (10 ml volbloed) van zeven gezonde mannen. De vrijwilligers waren gezonde personen die naar verluidt vrij waren van cardiovasculaire, hematologische, neurologische, endocriene of metabole ziekten. De vrijwilligers waren ook niet-rokers.
- Verzamel bloed met behulp van een steriele naald en spuit uit een prominente ader in het antecubitale gebied van de onderarm en breng het onmiddellijk over in buizen die zijn bedekt met een van de volgende anticoagulantia: natriumheparine (voor immunohistochemie) of ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA; voor fluorescerende etikettering).
- Stel de antistollingsbloedmonsters bloot aan nauwkeurig gecontroleerde mechanische krachten met behulp van een Couette-type schuifsysteem, zoals beschreven vóór 7,20.
- Het knipapparaat bestaat uit een draaibare beker en een stationaire bob, gescheiden door een opening van 300 μm. Breng het bloedmonster over in de opening, waardoor de nauwkeurig controleerbare rotatiesnelheid van de beker goed gecontroleerde mechanische krachten op het monster uitoefent. Representatieve gegevens die hier worden gepresenteerd, werden geproduceerd door mechanische krachten toe te passen die reflecteren op die welke zich voordoen in de menselijke vasculatuur (5 Pa) gedurende langere tijd (300 s).
- Bereiding van oplossingen die nodig zijn voor immunostaining
- Bereid de oplossingen voor zoals in tabel 1. De oplossingen kunnen worden bereid voordat de immunostainingprocedure wordt uitgevoerd en bij een bepaalde temperatuur worden bewaard totdat ze nodig zijn.
OPMERKING: De opslagduur kan variëren tussen de chemicaliën. Controleer het veiligheidsinformatieblad.
- Bereid de oplossingen voor zoals in tabel 1. De oplossingen kunnen worden bereid voordat de immunostainingprocedure wordt uitgevoerd en bij een bepaalde temperatuur worden bewaard totdat ze nodig zijn.
- Monstervoorbereiding
- Verwerk volbloed onmiddellijk na ontwenning of experimentele behandeling (indien van toepassing; bijv. mechanische stimulus in onze monsters; zie stap 1.1.3) om kortlevende effecten te kunnen detecteren, bijvoorbeeld na het aanbrengen van schuifspanning, lichaamsbeweging, kortdurende blootstelling aan hypoxie, enz.
- Voer RBC-eiwitfixatie uit met formaldehyde als volgt: verdun volbloed in een verhouding van 1:2 in 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer het monster op 132 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant voorzichtig door pipetteren.
- Suspensie de RBC-pellet opnieuw in twee volumes van 0,1 mol/L fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (1:3 verdunning) en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Herhaal de centrifugatie zoals hierboven beschreven en verwijder het supernatant, dat helder moet zijn, door pipetteren. Suspensie van de RBC-pellet opnieuw in één volume van 0,1 mol/L PBS (1:2 verdunning).
- Bereid bloeduitstrijkjes als volgt voor: label een microscoopglaasje met de monster-ID, aangebracht antilichaam, enz. met behulp van een alcoholbestendige pen (bijv. Potlood). Voeg vervolgens 10 μL van de bereide RBC-oplossing direct boven het etiketveld toe.
- Plaats een tweede dia op het monster onder een hoek van ongeveer 45° en verdeel het monster gelijkmatig over de dia. Bevestig de schuif over een Bunsen-brander door het monster met constante beweging gedurende 5-7 s over de brander te laten zweven.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de monsters aan de lucht te drogen voordat ze aan de hitte worden bevestigd. De monsters kunnen bij RT worden bewaard totdat ze kleuren (figuur 2).
- Immunohistochemische kleuring
- Markeer twee gebieden op elke dia: een testgebied waarin de RBC's worden geïncubeerd met het respectieve primaire en secundaire antilichaam, en een controlegebied waarin het primaire antilichaam wordt vervangen door een controleoplossing. Dit gebied dient als een binnen assay controle om het achtergrondsignaal van de RBC's te bepalen.
- Bereid oplossingen voor of tijdens de procedure, zoals aangegeven in tabel 2. Per testgebied is een volume van 300 μL en per controlegebied 200 μL nodig.
OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat deze op antilichamen gebaseerde kleuringsprocedures semi-kwantitatieve in plaats van kwantitatieve gegevens opleveren. Om ervoor te zorgen dat uit de geproduceerde gegevens zinvolle conclusies kunnen worden getrokken, zijn dus absoluut geschikte controlemonsters nodig (d.w.z. om een referentiepunt te bieden voor de beoordeelde relatieve veranderingen in eiwitactivering). - Voor trypsinevertering, ontdooi 0,1% trypsine en evenwicht tot RT. Markeer twee gebieden op elke dia met een vetpotlood: een testgebied (2/3 van de dia) en een controlegebied (1/3 van de dia). Breng voorzichtig tris-buffered zoutoplossing (TBS) aan met behulp van transferpipetten om de monstergebieden te wassen. Laat de TBS 30 s zitten en giet hem dan af. Herhaal de wasstap.
OPMERKING: Voeg de volgende oplossingen toe aan zowel het besturingselement als het testgebied, tenzij anders beschreven. De gebieden moeten voldoende worden afgedekt met de betreffende oplossing. Breng de oplossingen aan met wegwerppipetten en wissel na elke oplossing van pipet. - Voeg 0,1% trypsine toe, bedek de dia's met behulp van een speciaal gebouwde incubatiekamer met een deksel of aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een incubator. Stop na de incubatie de enzymreactie door leidingwater toe te voegen. Giet de oplossing af. Was beide gebieden 3x met TBS, zoals hierboven beschreven.
- Voeg voor het blokkeren van peroxidase-activering methanoloplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT. Bedek de dia's gedurende die tijd. Giet de oplossing af.
OPMERKING: Voor immunofluorescentiedetectie (rubriek 2) kan deze stap worden weggelaten, aangezien de blokkering van endogene peroxidasen dient om artefactueel signaal te voorkomen dat wordt veroorzaakt door de detectie met mierikswortelperoxidase (HRP) en 3,3′-Diaminobenzidine-hydraat (DAB). - Was beide gebieden 3x met TBS, zoals beschreven in stap 1.4.3. Voeg 3% magere melkoplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT om te blokkeren. Giet de oplossing af. Daarna niet wassen.
- Voeg alleen primair antilichaam (AB) toe aan het testgebied. Voeg AB-besturingsoplossing (zie tabel 2) toe aan het besturingsgebied. Incubeer de monsters bij 4 °C gedurende een nacht. Bedek dia's gedurende die tijd om uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Vermijd het overbrengen van de oplossingen van de test naar het controlegebied, omdat dit de controlewaarden zal beïnvloeden. - Giet de antilichaamoplossing af. Was beide gebieden 3x met TBS, zoals beschreven in stap 1.4.3.
- Voer een blokkeringsstap uit om niet-specifieke binding te voorkomen. Voeg 3% normaal geitenserum toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT. Giet de oplossing af.
- Voeg de secundaire antilichaamoplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT. Giet de antilichaamoplossing af. Was de gebieden 3x met TBS, zoals beschreven in stap 1.4.3.
- Ontwikkeling van beitsen en afdekking
- Voer de avidine-gekoppelde HRP-reactie uit (zie verdunning in tabel 2) door verdunde avidineperoxidase-oplossing toe te voegen en gedurende 30 minuten bij RT te broeden.
- Bereid het DAB-mengsel voor om de immunokleuring vóór gebruik te ontwikkelen, zoals beschreven in tabel 3.
LET OP: DAB is gevaarlijk. Overweeg gevarenaanduidingen H341 (verdacht van het veroorzaken van genetische defecten) en H350 (kan kanker veroorzaken). Houd rekening met de volgende voorzorgsmaatregelen: P201, P202, P280, P308+P313, P405 en P501. - Voer DAB-controlekleuring als volgt uit: verzamel de HRP-oplossing uit stap 1.5.1 van een dia en meng met een klein volume (bijv. 1 ml) bereide DAB-oplossing in een afzonderlijke centrifugebuis voordat u kleurt. Het mengsel moet een bruin/grijze kleur ontwikkelen.
- Plaats de dia's onder een microscoop (vergroting van ten minste 200x) en voeg DAB-oplossing toe aan beide gebieden. Controleer de kleuring van de RBC's continu en stop de vlekken door de DAB-oplossing te verwijderen met een wegwerppipet voordat de achtergrond begint te kleuren. Voor RBC-NOS serine 1177-kleuring is de DAB-incubatietijd ongeveer 17 minuten.
- Voer uitdroging van het monster uit. Plaats de dia's in een glazen rek en dompel ze gedurende 5 s elk onder in ethanoloplossingen van verschillende verdunningen, beginnend met 70%, gevolgd door 96%, en dan 100%, en ten slotte in xylol. Verwijder de dia's uit het rek en plaats ze op een tissue, met RBC's aan de bovenkant om overtollige vloeistof te absorberen.
- Voeg twee of drie druppels montagemedium toe aan de hele dia. Bedek de dia met een coverslip. Vermijd het opnemen van luchtbellen, omdat dit de microscopische evaluatie belemmert. Droog de monsters minstens een nacht in een zuurkast.
- Microscopische evaluatie uitvoeren
- Plaats dia's voor visualisatie en beeldvorming in een microscoop met doorgelaten licht met een vergroting van ten minste 200x. Zorg ervoor dat de microscoop is gekoppeld aan een camera om foto's te maken van de bevlekte RBC's.
- Schakel de lichtbron van de microscoop in. Schakel de op de microscoop bevestigde camera in en start de microscoopbesturingssoftware. Gebruik brightfieldmicroscopie om de juiste scherpstelling te bepalen door aan de knoppen voor grove en fijne scherpstelling te draaien en het focusniveau te vinden waar RBC's zichtbaar zijn.
- Stel de achtergrondwaarden van de afbeeldingen in op 220 ± 5 grijswaarden, gemeten op drie celvrije gebieden van de dia. Om dit te doen, opent u de eerste afbeelding met behulp van de gratis beschikbare software ImageJ. Selecteer de optie Gemiddelde grijswaarden in het deelvenster Metingen instellen. Gebruik het ovale pictogram om de grijswaarde te meten met de opdracht Meting . Als de gemeten waarden buiten bereik zijn, past u het achtergrondlicht op de microscoop dienovereenkomstig aan. Herhaal deze stappen totdat de achtergrondwaarden correct zijn.
OPMERKING: Deze achtergrondwaarden moeten binnen het opgegeven bereik liggen voor alle gemaakte foto's. Anders zijn de gegevens niet vergelijkbaar. - Voor de analyse van de RBC-grijswaarde markeert u de rand van elke RBC met het selectiegereedschap Ovaal in de ImageJ-software. Bepaal de grijswaarden van afzonderlijke RBC's met de opdracht Meting . Meet de grijswaarden van minimaal 50 RBC's uit de test en minimaal 10 RBC's uit het controlegebied.
OPMERKING: Het totale aantal geanalyseerde RBC's kan afzonderlijk worden aangepast. Hoe meer RBC's worden geanalyseerd, hoe betekenisvoller het resultaat. Het totale aantal geanalyseerde RBC's moet echter vergelijkbaar zijn voor elke aandoening, onderwerp, enz. binnen een bepaald experiment.- Vermijd analyse van RBC's in de buurt van het vetpotlood, omdat de kleuring in dit gebied onvolledig kan zijn. Vermijd analyse van overlappende RBC's, omdat dit de kleuringsintensiteit beïnvloedt. Gebruik alleen RBC's die gescheiden zijn van andere RBC's. Analyseer ten minste vijf beelden uit de test en ten minste twee afbeeldingen uit het controlegebied voor de evaluatie van 50/10 RBC's. Neem RBC's van elke afbeelding op in de uiteindelijke analyse.
- Om de kleuringsintensiteit te berekenen, berekent u de eindsignalen als:
(individueel testgebied RBC - gemiddelde testgebiedachtergrond) - (individueel controlegebied RBC - gemiddelde regelgebiedachtergrond)
Figuur 2: Weergave van het fixatieve proces en het genereren van bloeduitstrijkjes. (Schema gemaakt met BioRender.com.) Verdunde bloedmonsters worden chemisch gefixeerd in paraformaldehyde, vervolgens gecentrifugeerd en gewassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Ten slotte wordt geresuspendeerd bloed op een glazen dia gesmeerd en thermisch gefixeerd door boven een Bunsen-brandervlam te zweven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Bereidings- en bewaarcondities voor oplossingen die nodig zijn voor immunohistochemische kleuring. De oplossing kan voorafgaand aan het protocol worden voorbereid. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Beschrijving van antilichaamoplossingen voor onmiddellijk gebruik. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Componenten en protocol om de DAB-oplossing voor te bereiden voor onmiddellijk gebruik. Klik hier om deze tabel te downloaden.
2. Fluorescerende etikettering van RBC-eiwitten
OPMERKING: In de volgende paragraaf wordt een aanpassing van het immunohistochemische protocol beschreven, ontwikkeld met als doel het gebruik van antilichamen met fluorescerende conjugaten mogelijk te maken (figuur 1).
De voorbereiding van het bloedmonster voor het immunofluorescentieprotocol is identiek aan die beschreven in rubriek 1, dus de volgende sectie begint met de kleuring van monsters.
- Immunofluorescentiekleuring
- Incubeer met het secundaire, fluorescerende geconjugeerde antilichaam (voor het volume, zie stap 1.4.2) gedurende 30 minuten bij RT beschermd tegen licht, met behulp van een speciaal gebouwde incubatiekamer of aluminiumfolie.
- Giet de secundaire antilichaamoplossing af en was de monsters 3x met TBS. Laat de laatste was op de monsters om uitdroging te voorkomen.
- Giet de TBS af en verwijder de monsters één voor één uit het monsterrek om langdurige blootstelling aan licht te voorkomen. Voor het uitdrogen van de monsters, stelt u de dia's bloot aan verschillende ethanoloplossingen voor ~ 5 s elk, beginnend met 70%, gevolgd door 90% en uiteindelijk 100%. Stel de dia's gedurende 5 s bloot aan xylol/xyleenoplossing.
- Maak een coverslip met twee of drie druppels montagemedium en monteer vervolgens de dia met de coverslip. Zorg voor een gelijkmatige verdeling van het montagemedium door lichte druk uit te oefenen met een pincet of een vergelijkbaar, steriel metalen instrument. Elimineer luchtbellen, die anders de beeldvorming kunnen verstoren, met hetzelfde instrument. Laat de monsters een nacht drogen in een donkere en droge ruimte.
- Microscopische evaluatie
- Voor visualisatie en beeldvorming plaatst u de dia op het microscooppodium met een totale vergroting van ten minste 400x. Schakel de microscooplichtbron en de fluorescerende lichtbron in en zorg ervoor dat de fluorescerende lichtbron op maximale intensiteit wordt ingesteld.
- Schakel de op de microscoop bevestigde camera in en start de microscoopbesturingssoftware. Gebruik brightfieldmicroscopie om de juiste scherpstelling te bepalen door aan de knoppen voor grove en fijne scherpstelling te draaien en het scherpstelniveau te vinden waar RBC's zichtbaar zijn.
OPMERKING: Overmatige blootstelling aan licht kan fotobleking van de fluorescerende conjugaten veroorzaken. Men kan hiervoor een dia uit een eerder experiment gebruiken om de blootstelling aan licht van de dia's die nog moeten worden geanalyseerd te minimaliseren. - Bepaal de optimale laserintensiteit door RBC's in het controlegebied te inspecteren. Zorg ervoor dat de intensiteit hoog genoeg is dat RBC's zichtbaar zijn, terwijl er geen groot achtergrondsignaal wordt geproduceerd. Houd de intensiteit en belichtingstijd consistent tussen gebieden en monsters om vergelijkbaarheid te garanderen.
- Leg brightfield- en fluorescerende beelden vast in ten minste drie verschillende gebieden van het testgebied van de dia, willekeurig geselecteerd. Als u een gebied wilt selecteren, schuift u weg van de randen van de dia die zijn gemarkeerd door de lipidenpen, met behulp van de bedieningselementen van het microscooppodium. Selecteer een gebied met een uniforme verdeling van een enkelvoudige RBC-laag.
- Stel de belichtingstijd in op 1 s voor fluorescerende beelden en leg een beeld vast met behulp van de softwarebesturing van de microscoopbesturingssoftware. Schakel over naar de brightfield-modus, stel de belichtingstijd in op 'Auto' en leg het bijbehorende brightfield-beeld vast.
- Leg helderveld- en fluorescerende afbeeldingen vast in ten minste twee verschillende willekeurig geselecteerde gebieden van het besturingsgebied van de dia door stap 2.2.3 te herhalen.
- Sla de afbeeldingen op in .tif indeling om de oorspronkelijke grijswaarden van pixels te behouden, compressie te voorkomen en metagegevens van de acquisitie over te dragen.
- Meet de grijswaarden van de vastgelegde RBC's. Open ImageJ (of FIJI21; zie Aanvullend bestand 1). Bepaal de grijswaarden van afzonderlijke RBC's. Hiertoe markeert u elke afzonderlijke cel met het selectiegereedschap Ovaal en analyseert u met de opdracht Meten .
OPMERKING: RBC's mogen niet worden geanalyseerd als ze overlappen met andere cellen, omdat dit het resulterende signaal kan verhogen. - Markeer tussen drie en vijf gebieden die vrij zijn van RBC's en bepaal de grijswaarden om een maat voor het achtergrondsignaal te bieden. Analyseer ten minste 150 RBC's van ten minste drie verschillende afbeeldingen voor elk testgebied en ten minste 50 RBC's van ten minste twee verschillende afbeeldingen voor elk controlegebied.
OPMERKING: Analyse van meer cellen /gebieden kan worden geadviseerd om de variabiliteit te minimaliseren. Aangezien de RBC-populatie inherent heterogeen is, kan de cel-celvariabiliteit in signaal significant zijn, afhankelijk van het eiwit van belang. - Voer alternatieve gegevensanalyse uit van vastgelegde afbeeldingen met behulp van macroopdrachten. Maak /installeer een macro-opdracht via de FIJI-release van ImageJ voor geautomatiseerde selectie, achtergrondcorrectie en grijswaardeanalyse van een bepaalde afbeelding.
OPMERKING: Deze routine maakt gebruik van geautomatiseerde drempelwaarden om de cellen in een bepaalde afbeelding te detecteren met behulp van een kopie van de oorspronkelijke afbeelding, waardoor een overlay wordt geproduceerd die op de oorspronkelijke afbeelding wordt opgelegd om grijswaarden van fluorescerende RBC's te extraheren. De macro wordt gedeponeerd als een .ijm-bestand, als aanvullend coderingsbestand 1. - Open het afbeeldingsbestand in .tif formaat klaar voor analyse in FIJI. Open de macro RBC fluorescence.ijm (Supplementary Coding File 1) en klik op Uitvoeren.
OPMERKING: De macro is ingesteld voor afbeeldingen die zijn verkregen met een vergroting van 600x en een grote signaal-ruisverhouding. Automatische selectie van cellen moet door de onderzoeker worden beoordeeld.
- Bereken de eindsignalen als:
(testgebied RBC - achtergrond testgebied) - (controlegebied RBC - achtergrond van het controlegebied) voor handmatige analyse;
(testgebied - controlegebied) voor geautomatiseerde analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gepresenteerde protocol, dat methoden beschrijft die de detectie van acute veranderingen in RBC-eiwitten vergemakkelijken, werd getest op een bekende mechanisch gevoelige eiwitverandering: fosforylering van RBC-NOS bij het serine 1177-residu. Volbloed werd verkregen van gezonde vrijwilligers en vervolgens opgesplitst in twee afzonderlijke aliquots. Een bepaald bloedmonster werd blootgesteld aan mechanische schuifspanning van fysiologische omvang (5 Pa) gedurende 300 s, waarvan eerder was aangetoond dat het RBC-NOS-fosforylering bij serine 117714 opwekte. Onmiddellijk na het staken van de mechanische schuifblootstelling werd het bloedmonster gefixeerd in paraformaldehyde. Als controle werd een bloedmonster blootgesteld, in het scheerapparaat geladen en 300 s laten rusten voordat het in paraformaldehyde werd gefixeerd. Het signaal van antilichamen gericht tegen RBC-NOS gefosforyleerd op het serine 1177-residu in rust en als reactie op blootstelling aan mechanische kracht werd beoordeeld met behulp van zowel immunohistochemie (figuur 3A,B) als immunofluorescentie (figuur 3C,D). Geschoren en niet-geschoren monsters produceerden statistisch significant verschillende signalen [Friedman-test: χ2 (3) = 18,71, p = 0,0003]. Een vergelijkbare, ongeveer drievoudige toename van het signaal van antilichamen gericht tegen RBC-NOS gefosforyleerd op het serine 1177-residu werd gedetecteerd als reactie op mechanische krachtblootstelling van RBC's, vergeleken met de respectieve niet-afgeluisterde cellen (zowel p < 0,01) wanneer beoordeeld met het immunohistochemische of immunofluorescentieprotocol (figuur 3E).
Vergelijking van de resultaten verkregen met beide methoden duidt dus op een uitstekende overeenstemming tussen de gepresenteerde protocollen, die ook met succes en betrouwbaar verhoogde RBC-NOS-fosforylering detecteerden als reactie op mechanische stimulatie.
Figuur 3: Representatieve gepoolde gegevens van immunohistochemische (A,B) en immunofluorescente (C,D) kleuring van RBC-NOS serine 1177 fosforylering na mechanische afschuiving. Analyse van de signaalintensiteit van deze monsters wordt gepresenteerd in (E), waar witte balken gegevens weergeven die zijn verkregen met behulp van HRP-kleuring en zwarte balken gegevens vertegenwoordigen die zijn verkregen met behulp van de fluorescerende methode. Bloed werd bereid in rust of onmiddellijk na blootstelling aan mechanische kracht (d.w.z. afschuiving). N = 7 bloedmonsters werden verkregen van verschillende donoren. De als gemiddelde weergegeven gegevens ± standaardfout van het gemiddelde. **p < 0,01, bepaald met behulp van een niet-parametrische Friedman-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Geautomatiseerde semi-kwantitatieve beeldanalyse ruwe code met stapsgewijze annotaties voor afbeeldingen van immunofluorescente rode bloedcellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: Gecompileerde code die compatibel is met FIJI/ImageJ-software om geautomatiseerde beeldanalyse van immunofluorescente rode bloedcellen uit te voeren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Recente literatuur suggereert sterk dat het RBC-NOS-eiwit van cruciaal belang is voor de regulatie van RBC-vervormbaarheid 15,22,23, wat op zijn beurt hun passage door smalle haarvaten vergemakkelijkt 24. De eiwitactiviteit is sterk afhankelijk van posttranslationele eiwitmodificaties, met name de fosforylering van bepaalde residuen18. De focus ligt op de fosforyleringsplaats 1177, die betrekking heeft op de activering van het RBC-NOS-eiwit23. Veranderingen van dit eiwit zijn aangetoond in een verscheidenheid van ziekten 25,26,27,28,29, dus onderzoek van deze veranderingen zou waardevolle kennis kunnen opleveren, niet alleen voor het begrip van bepaalde ziekten, maar ook om specifieke therapieën te ontwikkelen en te begeleiden30.
Er zijn verschillende stimuli geïdentificeerd om RBC-NOS serine 1177 fosforylering22 te verhogen, maar mechanische krachten lijken een belangrijke extracellulaire stimulus te zijn die activering of modulatie van het RBC-NOS-eiwit 13,18,31,32 veroorzaakt. De modulaties van de RBC-NOS-activiteit zijn echter eerder tijdelijk33; Daarom moeten analyse/behoud van schuifafhankelijke veranderingen onmiddellijk worden uitgevoerd. Immunohistochemische en later immunofluorescentieprotocollen werden ontwikkeld om het behoud en de analyse van acute, regulerende modificaties van RBC-NOS te vergemakkelijken.
De hier gepresenteerde resultaten, verkregen via immunohistochemische en immunofluorescentieprotocollen, tonen een hoge mate van overeenstemming over de verhoogde fosforylering van RBC-NOS serine 1177 na afschuifblootstelling. Beide protocollen zijn dus geschikt voor het onderzoek naar voorbijgaande posttranslationele veranderingen van RBC-eiwitten, en de respectieve experimentator kan beslissen welke methode ze in hun respectieve laboratorium kunnen gebruiken, rekening houdend met de lokaal beschikbare middelen en infrastructuur. Gezien de brede commerciële beschikbaarheid van antilichamen gericht op eiwitten, zowel in hun oorspronkelijke staat als na posttranslationele modificaties, zijn de huidige testen aanpasbaar voor een aanzienlijk aantal doelwitten. Ze bieden dus nuttige hulpmiddelen voor het beoordelen van RBC-signalering14,27,34.
Bepaalde aspecten moeten tijdens de procedure in overweging worden genomen. De genoemde antilichamen zijn niet specifiek ontwikkeld om te worden toegepast in RBC's. In plaats daarvan zijn dit specifieke endotheel-type NOS (eNOS) antilichamen. Aangezien eNOS en RBC-NOS een grote homologie lijken te delen22,23, worden eNOS-specifieke antilichamen traditioneel gebruikt om RBC-NOS-activering te visualiseren. Het is belangrijk op te merken dat antilichamen gericht tegen de induceerbare (iNOS) of neuronale (nNOS) isovormen geen signalen produceren in RBC's, wat ondersteunt dat RBC-NOS significante structurele gelijkenis vertoont met eNOS22. De juiste verdunning moet worden getest voordat een antilichaam in het experiment wordt gebruikt, aangezien de door de leverancier aanbevolen gegevens niet zonder testen op RBC-experimenten kunnen worden toegepast. Verder vereist een overstap van distributiebedrijven overmatig testen van verschillende verdunningen voorafgaand aan gebruik. We raden aan om een zeer systemische aanpak te volgen bij het testen van nieuw geproduceerde antilichamen / chemicaliën; Nieuwe componenten moeten worden getest met dosis-responsbenaderingen, waarbij alleen de specifieke stappen waarbij het nieuwe bestanddeel wordt geïntroduceerd, mogen worden gewijzigd. Positieve controles (d.w.z. het stimuleren van RBC-NOS-activering) moeten worden verstrekt door geschoren met niet-gehoord bloed te vergelijken, zoals hier gepresenteerd. Als alternatief is aangetoond dat farmacologische stimulatie van RBC-NOS-fosforylering met 350 pM-insuline resulteert in verhoogde RBC-NOS-fosforylering, vergelijkbaar met die waargenomen bij mechanische krachttoepassing7.
De beperkingen van de gepresenteerde detectiemethoden strekken zich uit tot gemeenschappelijke beperkingen van methoden die afhankelijk zijn van de specificiteit van commercieel verkregen primaire antilichamen (bijv. Western Blot). Ten eerste moet een primair antilichaam gericht op het antigeen van belang beschikbaar zijn. Indien beschikbaar, moet het antilichaam specifiek zijn voor het doelwit, wat kan worden bevestigd door functionele maatregelen (d.w.z. farmacologische behandeling met activatoren / remmers) of met behulp van western blotting. Bovendien moeten de gegevens die via de beschreven methoden worden geproduceerd, zorgvuldig worden geïnterpreteerd. Dat wil zeggen, de gepresenteerde methoden zijn semi-kwantitatief en geven informatie over veranderingen in eiwitmodificaties ten opzichte van geschikte controlemonsters. De semi-kwantitatieve evaluatie die hier wordt gepresenteerd, verwijst altijd naar de activering van het enzym en moet niet worden verward met de enzymactiviteit. Metingen van enzymactiviteit vereisen afzonderlijke assays, zoals de arginine-citrulline-assay die de conversiesnelheid (fmol / min) meet van [3 H] L-arginine tot [3H] citrulline of [14 C] L-arginine tot [14C] citrulline 35,36. Om na te gaan of een verhoogde RBC-NOS-activering ook gepaard gaat met hogere NO-niveaus en/of verhoogde RBC-vervormbaarheidswaarden, moet bijvoorbeeld een aanvullende analyse van de NO-concentratie worden uitgevoerd. Bovendien, om RBC-NOS als bron van NO te selecteren, moeten NOS-remmers zoals L-NIO worden gebruikt15.
Samenvattend kan worden gesteld dat de hier gepresenteerde methoden goed ontwikkeld zijn om veranderingen in RBC-NOS-activering te analyseren als reactie op toegepaste stimuli ten opzichte van niet-gestimuleerde controlecellen. Deze methoden dragen dus bij aan het begrijpen hoe mechanische stress de functies van RBC-eiwitten beïnvloedt, die van cruciaal belang zijn voor de cellulaire functie en uiteindelijk van vitaal belang zijn voor adequate perfusie van werkweefsel en gasuitwisseling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben bekendgemaakt dat er geen belangenconflicten zijn.
Acknowledgments
LK erkent de steun van een Australian Government Research Training Program Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
References
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
