Summary
O presente protocolo descreve uma operação detalhada de imagem de fluorescência NIR-II em tempo real de um rato usando um dispositivo de imagem óptica NIR-II.
Abstract
Como uma tecnologia de imagem emergente, a imagem de fluorescência no infravermelho próximo II (NIR-II, 1000-1700 nm) tem um potencial significativo no campo biomédico, devido à sua alta sensibilidade, penetração de tecidos profundos e imagem superior com resolução espacial e temporal. No entanto, o método para facilitar a implementação de imagens de fluorescência NIR-II para alguns campos urgentemente necessários, como ciência médica e farmácia, tem intrigado pesquisadores relevantes. Este protocolo descreve em detalhes a construção e as aplicações de bioimagem de uma sonda molecular de fluorescência NIR-II, HLY1, com um esqueleto D-A-D (doador-aceitador-doador). O HLY1 apresentou boas propriedades ópticas e biocompatibilidade. Além disso, a imagem vascular e tumoral NIR-II em camundongos foi realizada usando um dispositivo de imagem óptica NIR-II. Imagens de fluorescência NIR-II de alta resolução em tempo real foram adquiridas para orientar a detecção de tumores e doenças vasculares. Desde a preparação da sonda até a aquisição de dados, a qualidade da imagem é muito melhorada e a autenticidade das sondas moleculares NIR-II para registro de dados em imagens intravitais é garantida.
Introduction
A imagem por fluorescência é a ferramenta de imagem molecular comumente utilizada na pesquisa básica, e também é frequentemente utilizada para orientar a ressecção cirúrgica de tumores em clínicas1. O princípio essencial da imagem de fluorescência é empregar uma câmera para receber a fluorescência emitida por um laser após a irradiação de amostras (tecidos, órgãos, etc.) 2. O processo é concluído dentro de alguns milissegundos3. Os comprimentos de onda de imagem de fluorescência podem ser divididos em ultravioleta (200-400 nm), região visível (400-700 nm), infravermelho próximo I (NIR-I, 700-900 nm) e infravermelho próximo II (NIR-II, 1000-1700 nm)4,5,6. Como as moléculas endógenas como hemoglobina, melanina, desoxihemoglobina e bilirrubina nos tecidos biológicos têm forte absorção e um efeito de dispersão sobre a luz nas regiões visíveis, a penetração e a sensibilidade da luz são bastante reduzidas, e a imagem de fluorescência nos comprimentos de onda da luz visível é afetada negativamente 7,8,9.
A imagem de fluorescência NIR-II tem baixa absorção e dispersão de fótons, alta velocidade de imagem e alto contraste (ou sensibilidade) da imagem10,11. À medida que o comprimento de onda da fluorescência aumenta, a absorção e o espalhamento da fluorescência nos tecidos biológicos diminuem gradualmente, e a autofluorescência na região NIR-II é extremamente baixa12. Assim, a janela NIR-II aumenta significativamente a profundidade de penetração dos tecidos e obtém maior resolução e relação sinal-ruído13,14,15. A janela NIR-II pode ser subdividida nas janelas NIR-IIa (1300-1400 nm) e NIR-lIb (1500-1700 nm)16. Até o momento, vários materiais marcantes do NIR-II foram relatados, incluindo nanotubos de carbono de parede única de material inorgânico, nanopartículas de terras raras, pontos quânticos e nanopartículas de polímero semicondutor de material orgânico, corantes de moléculas pequenas, materiais luminescentes induzidos por agregação, etc. 1,17,18,19,20,21,22. Os nanomateriais inorgânicos são facilmente acumulados no fígado, baço, etc., e têm potencial biotoxicidade a longo prazo23. O fluoróforo orgânico de moléculas pequenas tem as vantagens de metabolismo rápido, baixa toxicidade, fácil modificação e estrutura clara, que é a sonda mais promissora para uso clínico24.
O sistema de imagem óptica NIR-II também é um componente crítico da bioimagem por fluorescência, pois pode coletar de forma eficaz os sinais de fluorescência NIR-II da sonda NIR-II, tornando assim imagens funcionais, anatômicas e moleculares precisas25,26. O sistema de imagem NIR-II compreende principalmente câmeras infravermelhas de ondas curtas, filtros de passagem longa (LP), lasers e processadores de computador. In vivo A imagem fluorescente NIR-II é considerada uma das abordagens de imagem mais viáveis para elucidar os mecanismos das doenças e a natureza da vida27,28,29. A tecnologia de imagem NIR-II tem sido amplamente utilizada em campos biomédicos, como detecção de células cancerígenas, imagens dinâmicas, rastreamento direcionado in vivo e terapia direcionada, especialmente em pesquisas oncológicas30,31. No entanto, considerando os altos requisitos técnicos da tecnologia de imagem NIR-II em sondas e instrumentos de imagem, também confunde e restringe o uso prático de pesquisadores em diferentes campos. Portanto, a preparação de sondas de imagem NIR-II e as aplicações de imagens NIR-II são introduzidas em detalhes neste artigo.
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Protocol
Experimentos em animais para estudos de imagem NIR-II foram conduzidos no Centro de Experimentos Animais da Universidade de Wuhan, que recebeu a Associação Internacional de Cuidados com Animais Experimentais (AALAC). Todos os estudos em animais foram conduzidos seguindo as Diretrizes da Comissão de Bem-Estar Animal da China para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal (IACUC) do Centro Experimental Animal da Universidade de Wuhan.
Camundongos fêmeas BALB/c nus (~20 g) com 6 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo.
1. Preparação de imagem NIR-II
- Coloque o papelão preto comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais) no centro da transportadora. Em seguida, coloque a amostra em cima do papelão preto, de modo que a amostra esteja no centro da transportadora (um estágio localizado no dispositivo de imagem).
NOTA: Em comparação com o papelão branco, o papelão preto tem menos interferência de fundo durante a imagem NIR-II. - Selecione um filtro adequado com base no comprimento de onda da sonda NIR-II. Pressione long (>2 s) para controlar a área da caixa (como 900 LP) correspondente ao modelo de filtro na interface da tela quando o sistema mover o filtro para o caminho de imagem óptica.
- Plataforma de pressão longa na interface da tela sensível ao toque da área de controle do console da operadora para que a operadora se console; plataforma de pressão longa para baixo para que a operadora consoles para baixo .
- Ajuste a altura da plataforma para "0 mm" (ajuste de altura) e use o foco automático para tornar a imagem NIR-II clara.
2. Síntese do corante NIR-II (HLY1)
- Pesar as matérias-primas necessárias para o experimento de síntese. Certifique-se de que eles não se deteriorem.
- Adicionar o composto 1 (200 mg, 0,18 mmol), PdCl 2(dppf)2 CH 2 Cl 2 (28 mg, 0,04 mmol), N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano-2-il)fenil)naftaleno-2-amina (170 mg, 0,4 mmol) e K 2 CO3 (46 mg, 0,34 mmol) à solução de tetraidrofurano (THF) num balão de fundo redondo de 25 ml. Agitar a mistura durante 4 h a 75 °C sob atmosfera N2 (figura 1A).
NOTA: Para o procedimento de síntese do composto 1 e N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano-2-il)fenil)naftaleno-2-amina, consulte Li et al21. As estruturas químicas são mostradas na Figura 1A. - Após o resfriamento à temperatura ambiente, extinguir a reação com água destilada (DI) (80 mL) e extrair a mistura com DCM (diclorometano)/H2O (30 mL) (três vezes). Purificar o produto bruto por cromatografia em coluna16 (éter de petróleo:DCM = 10:1) para tornar o HLY1 um sólido verde (78 mg, rendimento de 30%).
- Coloque o corante HLY1 sob a proteção de nitrogênio na geladeira para uso posterior. Isso pode ser armazenado por até 6 meses.
3. Preparação de nanossonda suspensível à água
- Pesar HLY1 (1 mg) e materiais de encapsulamento anfipático, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenoglicol)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; ver Tabela de Materiais).
- Prepare os pontos20 do HLY1 empregando o DSPE-PEG2k como matriz de encapsulamento (método de nanoprecipitação12) (Figura 1C). Dissolver HLY1 em THF (1 mL) e adicionar lentamente em um copo contendo solução aquosa DSPE-PEG2k (9 mL) com sonicação a 25 °C. Posteriormente, retirar o THF da mistura por diálise20.
- Concentrar a solução acima referida centrífugamente com ultrafiltração 18 (7100 x g durante10 min) e, em seguida, colocá-la num frigorífico a 4 °C para utilização futura. Isso pode ser armazenado por até 1 mês.
NOTA: A solução aquosa de nanossonda carregada pelo DSPE-PEG2k deve ser armazenada acima de 0 °C e utilizada o mais rapidamente possível.
4. Construção de camundongos portadores de tumor
- Cultivar células de cancro da mama de ratinhos 4T1 (4T1) no meio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais), e manter numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 °C.
- Para o experimento de imagem fluorescente NIR-II, cultura de células 4T1 (5 x 107) por 24 h, digestão com tripsina (1 mL) e lavagem duas vezes com DMEM livre de soro (4 mL).
- Anestesiar os camundongos tratando com isoflurano (2%). Confirme a anestesia adequada estimulando os dedos dos pés ou as solas dos pés dos ratos e observe se os ratos respondem. Se não houver resposta, significa que a anestesia é suficiente32.
- Em seguida, usando uma agulha de injeção de insulina, injete a mistura de células 4T1 nos camundongos através de injeção subcutânea (100 μL).
Nota: Os estudos de imagem do NIR-II foram realizados ~2 semanas após a inoculação, quando o tumor cresceu para um volume de ~100 mm3. Antes da imagem do tumor NIR-II, confirme o tamanho do tumor. O tamanho do tumor foi estimado por um paquímetro vernier eletrônico para o presente estudo11.
5. Imagem de fluorescência NIR-II in vivo
- Anestesiar os camundongos tratando com isoflurano (2%) e realizar imagens NIR-II de todo o corpo dos camundongos usando um sistema de imagem óptico NIR-II (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Preste atenção à dosagem de anestésico para evitar a morte de ratos. Geralmente, a anestesia dura de 5 a 10 minutos. Estimule os dedos dos pés ou as solas dos pés dos ratos e observe se os ratos respondem. Se não houver resposta, isso significa que a anestesia é suficiente. - Tome uma solução de pontos HLY1 (0,8 mg/ml, 200 μL). Injete os pontos HLY1 por via intravenosa nos camundongos anestesiados e, 3 minutos depois, realize imagens de fluorescência NIR-II dos vasos sanguíneos de todo o corpo de camundongos usando um sistema de imagem NIR-II. Concentre-se ainda mais na cabeça do rato para coletar imagens vasculares cerebrais.
NOTA: Use luvas experimentais limpas durante a imagem, o que ajudará a obter imagens NIR-II limpas. - Colete as imagens 5 min após a injeção de pontos HLY1 em camundongos e processe os dados usando o software ImageJ. Os parâmetros do instrumento do sistema óptico de imagem NIR-II são 90 mW/cm2 (laser de 808 nm).
- Após a conclusão do experimento, eutanasiar os animais seguindo protocolos institucionalmente aprovados.
NOTA: Para o presente estudo, os animais foram eutanasiados expondo-os ao excesso deisoflurano 32.
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Representative Results
A intensidade fluorescente e o brilho dos pontos HLY1 suspensáveis à água foram determinados por um instrumento de imagem NIR-II. A intensidade fluorescente de HLY1 na mistura de 90% fwTHF/H2O foi cinco vezes maior que na solução de THF, o que indicou uma característica AIE proeminente de HLY1 (Figura 1B). Além disso, os pontos HLY1 emitiram fortes sinais fluorescentes sob um filtro LP de 1.500 nm, mostrando que os pontos HLY1 podem ser usados para imagens NIR-IIb (Figura 1D). A absorção máxima e o comprimento de onda máximo de emissão dos pontos HLY1 foram de 740 nm e 1.040 nm, respectivamente (Figura 2A). Além disso, o tamanho hidrodinâmico dos pontos HLY1 foi determinado como sendo de 145 nm por espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Figura 2B). Pontos HLY1 (0,2 mL, 0,8 mg/mL) foram administrados em camundongos Balb/c normais via injeção na veia caudal para imagem vascular (Figura Suplementar 1). Os microvasos do membro posterior foram identificados claramente sob filtro LP de 1.500 nm (Figura 3B). Além disso, os vasos cerebrais também foram claramente identificados sob um filtro LP de 1.500 nm (Figura 3A). O desempenho de imagem NIR-II dos pontos HLY1 em camundongos portadores de tumor 4T1 também foi avaliado através do sistema de imagem NIR-II. Pontos HLY1 (0,2 mL, 0,8 mg/mL) foram injetados por via intravenosa em camundongos 4T1 através da veia da cauda. O tumor 4T1 dos camundongos portadores de tumor foi claramente visível por imagem NIR-II (Figura 3C), indicando o efeito EPR dos pontos HLY1. Todos esses resultados sugerem que os pontos HLY1 são uma sonda de fluorescência NIR-II brilhante, que é aplicável para imagens vasculares e tumorais.
Figura 1: Síntese de moléculas de corante e preparação de sondas suspensíveis à água. (A) O percurso sintético de HLY1 (a: Pd(dppf)Cl 2 CH 2 Cl 2, K 2 CO3, 75 °C). (B) As imagens NIR-II de HLY1 em THF e 90% fw THF/H 2 O (1.000 nm LP,2ms). (C) Um diagrama esquemático da preparação de pontos HLY1. (D) A intensidade fluorescente NIR-IIb dos pontos HLY1 em solução aquosa (1.500 nm LP, 200 ms). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As propriedades ópticas e o tamanho hidrodinâmico dos pontos HLY1. (A) Os espectros de absorção e emissão de pontos HLY1 em solução aquosa. (B) O DLS dos pontos HLY1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem de fluorescência NIR-II usando pontos HLY1. (A) Imagem vascular cerebral em camundongos (LP de 1.500 nm, tempo de exposição de 300 ms). Barra de escala: 2 cm. (B) Imagem vascular de corpo inteiro em camundongos (LP de 1.500 nm, 300 ms). (C) Imagem tumoral 4T1 (LP de 1.250 nm, 30 ms). Barra de escala: 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 suplementar: Configuração de imagem NIR-II. (A) Diagrama esquemático de injeção de pontos HLY1 em camundongos. (B) A fotografia do dispositivo de imagem NIR-II. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A imagem fluorescente NIR-I pode ser usada até certo ponto para imagens tumorais e vasculares, mas devido ao comprimento de onda máximo limitado de emissão de fluoróforos NIR-I (<900 nm), resulta em baixa penetração tecidual e razão de fundo de sinal tumoral33,34. A baixa e baixa resolução de imagem pode causar um desvio entre o resultado do tratamento de feedback de imagem e o efeito terapêutico real. Além disso, a maioria dos fluoróforos NIR-I tem baixa estabilidade óptica e metabolismo extremamente rápido, resultando em instabilidade no processo de imagem. Devido à baixa penetração tecidual e instabilidade dos fluoróforos NIR-I, a aplicação em imagens tumorais e vasculares é bastante limitada35. Em comparação com a luz NIR-I, a imagem de fluorescência NIR-II tem as vantagens de reduzir significativamente o espalhamento e a absorção de fótons, menor autofluorescência tecidual, penetração mais forte do tecido corporal e melhor resolução do espaço-tempode imagem 36.
Este artigo descreve um corante AIE brilhante baseado em um esqueleto D-A-D, que tem excelente estabilidade. Um método eficaz de nanoprecipitação foi utilizado para preparar uma nanossonda para bioimagem multiuso, incluindo doenças vasculares e imagens tumorais. O alto rendimento quântico na solução aquosa deve-se às propriedades luminescentes induzidas pela agregação, que podem alcançar imagens NIR-II de alta definição com baixa dose e alta biossegurança. O brilho da sonda NIR-II e a solubilidade em água determinam a qualidade da imagem. Além disso, ao injetar uma sonda em um mouse, é necessário evitar o vazamento da sonda na cauda do mouse, o que afeta a precisão dos resultados da imagem. O método atual de administração é limitado apenas à injeção intravenosa e não pode usar métodos de injeção múltipla, o que é uma limitação do método atual. Além disso, a nanossonda NIR-II deste método só pode ser acumulada para o alvo por segmentação passiva e não pode identificar alvos específicos por segmentação ativa.
No processo de implementação da imagem NIR-II, a operação do dispositivo NIR-II também é importante para a aquisição de imagens. Para obter imagens vasculares de alta resolução, a câmera InGaAs precisa ser focada no mouse e posicionada perto do mouse, facilitando a observação dos minúsculos vasos sanguíneos. Para a imagem do tumor, as sondas precisam ser efetivamente acumuladas no tumor, e a fluorescência NIR-II deve ser emitida pelas sondas acumuladas no tumor, distinguindo efetivamente a fronteira entre o tumor e o tecido circundante. Devido à alta sensibilidade da imagem de fluorescência NIR-II, as imagens podem ser observadas dinamicamente durante a imagem, o que é ausente em muitas outras técnicas de imagem.
Neste estudo, a preparação de uma sonda fluorescente é introduzida. Ao mesmo tempo, imagens vasculares e tumorais de alta resolução são realizadas por uma nanossonda fluorescente NIR-II, que fornece um método preciso e eficaz para a detecção de doenças vasculares e câncer.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado por doações da NSFC (82273796, 82111530209), Fundos Especiais para Orientar o Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia Local do Governo Central (XZ202202YD0021C, XZ202102YD0033C, XZ202001YD0028C), Projeto Chave de Inovação Científica e Técnica da Província de Hubei (2020BAB058), os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais e os Programas de Prevenção e Controle COVID-19 da Região Autônoma do Tibete para o Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous pyridine | Perimed | 110-86-1 | |
| Anhydrous sodium sulfate | China national medicines Co.,Ltd | SY006376 | |
| Black cardboard | Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd | AO00158 | |
| Column chromatography | Energy Chemical | E080498 | |
| Diphenylphosphine palladium dichloride | Sigma-Aldrich | B2161-1g | |
| DSPE-PEG2000 | Ponsure | PS-E1 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
| Isoflurane | GLPBIO | GC45487-1 | |
| K2CO3 | Macklin | P816305-5g | |
| N. N '- dimethylformamide | China national medicines Co.,Ltd | 02-12-1968 | |
| NIR-II imaging instrument | Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd | 16011109 | |
| N-sulfenanilide | Enerry chemical | 1250030-5g | |
| PdCl2(dppf)2CH2Cl2 | TCI | B2064-1g | |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Tetrahydrofuran | China national medicines Co.,Ltd | M005197 | |
| Tetratriphenylphosphine palladium | Immochem | 1021232-5g | |
| Tetratriphenylphosphine palladium | Sigma-Aldrich | 1021232-5g | |
| Tributyltin chloride | Immochem | QH004335 | |
| Trimethylchlorosilane | China national medicines Co.,Ltd | 40060560 |
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