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Medicine

Une sonde de fluorescence NIR-II brillante pour l’imagerie vasculaire et tumorale

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64875
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2
1College of Science, Research Center for Ecology, Laboratory of Extreme Environmental Biological Resources and Adaptive Evolution, Tibet University, 2State Key Laboratory of Virology, Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (MOE) and Hubei Province Engineering and Technology Research Center for Fluorinated Pharmaceuticals, Wuhan University School of Pharmaceutical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Le présent protocole décrit une opération détaillée d’imagerie par fluorescence NIR-II en temps réel d’une souris à l’aide d’un dispositif d’imagerie optique NIR-II.

Abstract

En tant que technologie d’imagerie émergente, l’imagerie par fluorescence proche infrarouge II (NIR-II, 1000-1700 nm) présente un potentiel important dans le domaine biomédical, en raison de sa sensibilité élevée, de sa pénétration des tissus profonds et de son imagerie supérieure avec une résolution spatiale et temporelle. Cependant, la méthode visant à faciliter la mise en œuvre de l’imagerie par fluorescence NIR-II pour certains domaines urgents, tels que les sciences médicales et la pharmacie, a intrigué les chercheurs concernés. Ce protocole décrit en détail les applications de construction et de bioimagerie d’une sonde moléculaire de fluorescence NIR-II, HLY1, avec un squelette D-A-D (donneur-accepteur-donneur). HLY1 a montré de bonnes propriétés optiques et biocompatibilité. De plus, l’imagerie vasculaire et tumorale NIR-II chez la souris a été réalisée à l’aide d’un dispositif d’imagerie optique NIR-II. Des images de fluorescence NIR-II haute résolution en temps réel ont été acquises pour guider la détection des tumeurs et des maladies vasculaires. De la préparation de la sonde à l’acquisition des données, la qualité de l’imagerie est grandement améliorée et l’authenticité des sondes moléculaires NIR-II pour l’enregistrement des données en imagerie intravitale est assurée.

Introduction

L’imagerie par fluorescence est l’outil d’imagerie moléculaire couramment utilisé en recherche fondamentale, et est également souvent utilisée pour guider la résection chirurgicale de la tumeur dans les cliniques1. Le principe essentiel de l’imagerie par fluorescence est d’utiliser une caméra pour recevoir la fluorescence émise par un laser après l’irradiation d’échantillons (tissus, organes, etc.) 2. Le processus est terminé en quelques millisecondes3. Les longueurs d’onde d’imagerie de fluorescence peuvent être divisées en ultraviolet (200-400 nm), région visible (400-700 nm), proche infrarouge I (NIR-I, 700-900 nm) et proche infrarouge II (NIR-II, 1000-1700 nm)4,5,6. Parce que les molécules endogènes telles que l’hémoglobine, la mélanine, la désoxyhémoglobine et la bilirubine dans les tissus biologiques ont une forte absorption et un effet de diffusion sur la lumière dans les régions visibles, la pénétration et la sensibilité de la lumière sont considérablement réduites, et l’imagerie de fluorescence dans les longueurs d’onde de la lumière visible est affectéenégativement 7,8,9.

L’imagerie par fluorescence NIR-II présente une faible absorption et diffusion des photons, une vitesse d’imagerie élevée et un contraste (ou une sensibilité) d’image élevé10,11. À mesure que la longueur d’onde de fluorescence augmente, l’absorption et la diffusion de la fluorescence dans les tissus biologiques diminuent progressivement, et l’autofluorescence dans la région NIR-II est extrêmement faible12. Ainsi, la fenêtre NIR-II augmente considérablement la profondeur de pénétration des tissus et obtient une résolution et un rapport signal sur bruit plus élevés13,14,15. La fenêtre NIR-II peut être subdivisée en fenêtres NIR-IIa (1300-1400 nm) et NIR-lIb (1500-1700 nm)16. À ce jour, plusieurs matériaux NIR-II importants ont été signalés, notamment des nanotubes de carbone à paroi simple en matériaux inorganiques, des nanoparticules de terres rares, des points quantiques et des nanoparticules de polymères semi-conducteurs de matériaux organiques, des colorants à petites molécules, des matériaux luminescents induits par agrégation, etc. 1,17,18,19,20,21,22. Les nanomatériaux inorganiques s’accumulent facilement dans le foie, la rate, etc., et peuvent être biotoxiques à long terme23. Le fluorophore organique à petites molécules présente les avantages d’un métabolisme rapide, d’une faible toxicité, d’une modification facile et d’une structure claire, ce qui en fait la sonde la plus prometteuse pour un usage clinique24.

Le système d’imagerie optique NIR-II est également un élément essentiel de la bioimagerie par fluorescence, car il peut collecter efficacement les signaux de fluorescence NIR-II de la sonde NIR-II, produisant ainsi des images fonctionnelles, anatomiques et moléculaires précises25,26. Le système d’imagerie NIR-II comprend principalement des caméras infrarouges à ondes courtes, des filtres passe-long (LP), des lasers et des processeurs informatiques. In vivo L’imagerie fluorescente NIR-II est considérée comme l’une des approches d’imagerie les plus réalisables pour élucider les mécanismes des maladies et la nature de la vie27,28,29. La technologie d’imagerie NIR-II a été largement utilisée dans des domaines biomédicaux tels que la détection des cellules cancéreuses, l’imagerie dynamique, le traçage ciblé in vivo et la thérapie ciblée, en particulier dans la recherche en oncologie30,31. Cependant, compte tenu des exigences techniques élevées de la technologie d’imagerie NIR-II sur les sondes et les instruments d’imagerie, elle laisse également perplexe et restreint l’utilisation pratique des chercheurs dans différents domaines. Par conséquent, la préparation des sondes d’imagerie NIR-II et les applications de l’imagerie NIR-II sont présentées en détail dans cet article.

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Protocol

Des expériences sur des animaux pour les études d’imagerie NIR-II ont été menées au Centre d’expérimentation animale de l’Université de Wuhan, qui a reçu l’Association internationale pour les soins aux animaux expérimentaux (AALAC). Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux directives de la Commission chinoise du bien-être animal pour le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation et approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre d’expérimentation animale de l’Université de Wuhan.

Des souris nues BALB/c femelles (~20 g) à l’âge de 6 semaines ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation de l’imagerie NIR-II

  1. Placez du carton noir disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) au centre du support. Ensuite, placez l’échantillon sur le carton noir, de sorte que l’échantillon soit au centre du support (une étape située dans le dispositif d’imagerie).
    REMARQUE: Par rapport au carton blanc, le carton noir a moins d’interférences d’arrière-plan lors de l’imagerie NIR-II.
  2. Sélectionnez un filtre approprié en fonction de la longueur d’onde de la sonde NIR-II. Appuyez longuement (>2 s) pour contrôler la zone du boîtier (par exemple 900 LP) correspondant au modèle de filtre dans l’interface de l’écran lorsque le système déplace le filtre dans le chemin d’imagerie optique.
  3. Appuyez longuement sur la plate-forme sur l’interface de l’écran tactile de la zone de commande de la console de l’opérateur afin que la console de l’opérateur se console; Appuyez longuement sur la plate-forme vers le bas pour que le transporteur se console vers le bas.
  4. Ajustez la hauteur de la plate-forme à « 0 mm » (réglage de la hauteur) et utilisez la mise au point automatique pour rendre l’image NIR-II claire.

2. Synthèse du colorant NIR-II (HLY1)

  1. Peser les matières premières nécessaires à l’expérience de synthèse. Assurez-vous qu’ils ne se détériorent pas.
  2. Ajouter le composé 1 (200 mg, 0,18 mmole), PdCl2(dppf)2CH2Cl2 (28 mg, 0,04 mmole), le N-phényl-N-(4-(4,4,5,5-tétraméthyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phényl)naphtalène-2-amine (170 mg, 0,4 mmole) et le K2CO3(46 mg, 0,34 mmole) dans une fiole à fond rond de 25mL. Agiter le mélange pendant 4 h à 75 °C sous atmosphèreN2 (figure 1A).
    NOTE: Pour la procédure de synthèse du composé 1 et du N-phényl-N-(4-(4,4,5,5-tétraméthyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)phényl)naphtalène-2-amine, se référer à Li et al21. Les structures chimiques sont illustrées à la figure 1A.
  3. Après refroidissement à température ambiante, éteindre la réaction avec de l’eau distillée (DI) (80 mL) et extraire le mélange avec du DCM (dichlorométhane)/H2O (30 mL) (trois fois). Purifier le produit brut par chromatographie sur colonne16 (éther de pétrole:DCM = 10:1) pour faire de HLY1 un solide vert (78 mg, rendement de 30%).
  4. Placez le colorant HLY1 sous la protection de l’azote dans le réfrigérateur pour une utilisation ultérieure. Celui-ci peut être conservé jusqu’à 6 mois.

3. Préparation d’une nanosonde à suspense d’eau

  1. Peser HLY1 (1 mg) et les matériaux d’encapsulation amphipathique, 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylèneglycol)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; voir le tableau des matériaux).
  2. Préparer les points20 HLY1 en utilisant DSPE-PEG2k comme matrice d’encapsulation (méthode de nanoprécipitation12) (Figure 1C). Dissoudre HLY1 dans du THF (1 mL) et ajouter lentement dans un bécher contenant une solution aqueuse DSPE-PEG2k (9 mL) avec sonication à 25 °C. Par la suite, éliminer le THF du mélange par dialyse20.
  3. Concentrer la solution ci-dessus par centrifugation avec l’ultrafiltration 18 (7100 x g pendant10 min), puis la placer dans un réfrigérateur à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Cela peut être stocké jusqu’à 1 mois.
    NOTE: La solution aqueuse de nanosonde chargée par DSPE-PEG2k doit être stockée au-dessus de 0 °C et utilisée dès que possible.

4. Construction de souris porteuses de tumeurs

  1. Culture de cellules cancéreuses du sein de souris 4T1 (4T1) dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, supplémenté avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matières), et conserver dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 °C.
  2. Pour l’expérience d’imagerie fluorescente NIR-II, cultiver des cellules 4T1 (5 x 107) pendant 24 h, les digérer avec de la trypsine (1 mL) et laver deux fois avec du DMEM sans sérum (4 mL).
  3. Anesthésier les souris en les traitant à l’isoflurane (2%). Confirmez une anesthésie adéquate en stimulant les orteils ou la plante des pieds des souris et observez si les souris réagissent. S’il n’y a pas de réponse, cela signifie que l’anesthésie est suffisante32.
  4. Ensuite, à l’aide d’une aiguille d’injection d’insuline, injecter le mélange de cellules 4T1 dans les souris par injection sous-cutanée (100 μL).
    Remarque: Les études d’imagerie NIR-II ont été effectuées ~ 2 semaines après l’inoculation, lorsque la tumeur avait atteint un volume de ~ 100 mm3. Avant l’imagerie tumorale NIR-II, veuillez confirmer la taille de la tumeur. La taille de la tumeur a été estimée par un étrier vernier électronique pour la présente étude11.

5. Imagerie par fluorescence NIR-II in vivo

  1. Anesthésier les souris en les traitant à l’isoflurane (2%) et effectuer une imagerie NIR-II de l’ensemble du corps des souris à l’aide d’un système d’imagerie optique NIR-II (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE: Faites attention à la posologie de l’anesthésique pour éviter la mort des souris. Généralement, l’anesthésie dure de 5 à 10 minutes. Stimulez les orteils ou la plante des pieds des souris et observez si les souris réagissent. S’il n’y a pas de réponse, cela signifie que l’anesthésie est suffisante.
  2. Prenez une solution de points HLY1 (0,8 mg/mL, 200 μL). Injectez les points HLY1 par voie intraveineuse dans les souris anesthésiées et, 3 minutes plus tard, effectuez une imagerie par fluorescence NIR-II des vaisseaux sanguins de tout le corps des souris à l’aide d’un système d’imagerie NIR-II. Concentrez-vous davantage sur la tête de la souris pour recueillir l’imagerie vasculaire cérébrale.
    REMARQUE: Utilisez des gants expérimentaux propres pendant l’imagerie, ce qui aidera à obtenir des images NIR-II propres.
  3. Collectez les images 5 min après l’injection de points HLY1 chez la souris et traitez les données à l’aide du logiciel ImageJ. Les paramètres de l’instrument du système d’imagerie optique NIR-II sont 90 mW/cm2 (laser 808 nm).
  4. À la fin de l’expérience, euthanasier les animaux en suivant des protocoles approuvés par l’institution.
    REMARQUE : Pour la présente étude, les animaux ont été euthanasiés en les exposant à un excès d’isoflurane32.

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Representative Results

L’intensité fluorescente et la luminosité des points HLY1 suspensibles dans l’eau ont été déterminées par un instrument d’imagerie NIR-II. L’intensité fluorescente de HLY1 dans le mélange THF/H2O à 90 % f w était cinq fois supérieure à celle de la solution de THF, ce qui indiquait une caractéristique AIE importante de HLY1 (figure 1B). De plus, les points HLY1 émettaient de forts signaux fluorescents sous un filtre LP de 1 500 nm, ce qui montre que les points HLY1 peuvent être utilisés pour l’imagerie NIR-IIb (Figure 1D). L’absorption maximale et la longueur d’onde d’émission maximale des points HLY1 étaient respectivement de 740 nm et 1 040 nm (figure 2A). De plus, la taille hydrodynamique des points HLY1 a été déterminée à 145 nm par diffusion dynamique de la lumière (DLS) (figure 2B). Des points HLY1 (0,2 mL, 0,8 mg/mL) ont été administrés à des souris Balb/c normales par injection veineuse de queue pour l’imagerie vasculaire (Figure supplémentaire 1). Les microvaisseaux du membre postérieur ont été clairement identifiés sous un filtre LP de 1 500 nm (figure 3B). De plus, les vaisseaux cérébraux ont également été clairement identifiés sous un filtre LP de 1 500 nm (Figure 3A). La performance d’imagerie NIR-II des points HLY1 chez des souris porteuses de tumeurs 4T1 a également été évaluée par le système d’imagerie NIR-II. Des points HLY1 (0,2 mL, 0,8 mg/mL) ont été injectés par voie intraveineuse à des souris 4T1 par la veine de la queue. La tumeur 4T1 des souris porteuses de tumeurs était clairement visible par imagerie NIR-II (Figure 3C), indiquant l’effet EPR des points HLY1. Tous ces résultats suggèrent que les points HLY1 sont une sonde de fluorescence NIR-II brillante, applicable à l’imagerie vasculaire et tumorale.

Figure 1
Figure 1 : Synthèse des molécules de colorant et préparation des sondes hydro-suspensibles. (A) La trajectoire synthétique de HLY1 (a:(dppf)Cl2CH2Cl2, K2CO3,75 °C). (B) Les images NIR-II de HLY1 en THF et à 90 % fw THF/H2O(1 000 nm LP, 2 ms). (C) Un schéma de principe de la préparation des points HLY1. (D) L’intensité fluorescente NIR-IIb des points HLY1 en solution aqueuse (1 500 nm LP, 200 ms). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les propriétés optiques et la taille hydrodynamique des points HLY1. (A) Les spectres d’absorption et d’émission des points HLY1 en solution aqueuse. (B) Le DLS des points HLY1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Imagerie par fluorescence NIR-II à l’aide de points HLY1. (A) Imagerie vasculaire cérébrale chez la souris (1 500 nm LP, temps d’exposition de 300 ms). Barre d’échelle: 2 cm. (B) Imagerie vasculaire du corps entier chez la souris (1 500 nm LP, 300 ms). (C) Imagerie tumorale 4T1 (1 250 nm LP, 30 ms). Barre d’échelle: 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Configuration de l’imagerie NIR-II. (A) Schéma de principe de l’injection de points HLY1 chez la souris. (B) La photographie du dispositif d’imagerie NIR-II. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’imagerie fluorescente NIR-I peut être utilisée dans une certaine mesure pour l’imagerie tumorale et vasculaire, mais en raison de la longueur d’onde d’émission maximale limitée des fluorophores NIR-I (<900 nm), elle entraîne une faible pénétration tissulaire et un rapport de fond du signal tumoral33,34. Une résolution d’imagerie faible et faible peut entraîner un écart entre le résultat du traitement par rétroaction d’imagerie et l’effet thérapeutique réel. En outre, la plupart des fluorophores NIR-I ont une faible stabilité optique et un métabolisme extrêmement rapide, ce qui entraîne une instabilité dans le processus d’imagerie. En raison de la faible pénétration tissulaire et de l’instabilité des fluorophores NIR-I, l’application en imagerie tumorale et vasculaire est très limitée35. Par rapport à la lumière NIR-I, l’imagerie par fluorescence NIR-II présente les avantages d’une diffusion et d’une absorption significativement réduites des photons, d’une autofluorescence tissulaire plus faible, d’une pénétration plus forte des tissus corporels et d’une meilleure résolution de l’espace-tempsd’imagerie 36.

Cet article décrit un colorant AIE brillant basé sur un squelette D-A-D, qui a une excellente stabilité. Une méthode efficace de nanoprécipitation a été utilisée pour préparer une nanosonde pour la bioimagerie polyvalente, y compris les maladies vasculaires et l’imagerie tumorale. Le rendement quantique élevé de la solution aqueuse est dû aux propriétés luminescentes induites par l’agrégation, ce qui permet d’obtenir une imagerie NIR-II haute définition avec une faible dose et une biosécurité élevée. La luminosité de la sonde NIR-II et la solubilité dans l’eau déterminent la qualité de l’imagerie. De plus, lors de l’injection d’une sonde dans une souris, il est nécessaire d’éviter de laisser échapper la sonde dans la queue de la souris, ce qui affecte la précision des résultats d’imagerie. La méthode d’administration actuelle se limite uniquement à l’injection intraveineuse et ne peut pas utiliser plusieurs méthodes d’injection, ce qui est une limitation de la méthode actuelle. De plus, la nanosonde NIR-II de cette méthode ne peut être accumulée sur la cible que par ciblage passif, et ne peut pas identifier des cibles spécifiques par ciblage actif.

Dans le processus de mise en œuvre de l’imagerie NIR-II, le fonctionnement du dispositif NIR-II est également important pour l’acquisition d’images. Pour obtenir une imagerie vasculaire à haute résolution, la caméra InGaAs doit être focalisée sur la souris et positionnée près de la souris, ce qui facilite l’observation des minuscules vaisseaux sanguins. Pour l’imagerie tumorale, les sondes doivent être efficacement accumulées dans la tumeur, et la fluorescence NIR-II doit être émise par les sondes accumulées dans la tumeur, distinguant efficacement la frontière entre la tumeur et le tissu environnant. En raison de la sensibilité élevée de l’imagerie par fluorescence NIR-II, les images peuvent être observées dynamiquement pendant l’imagerie, ce qui fait défaut dans de nombreuses autres techniques d’imagerie.

Dans cette étude, la préparation d’une sonde fluorescente est introduite. Dans le même temps, l’imagerie vasculaire et tumorale à haute résolution est réalisée par une nanosonde fluorescente NIR-II, qui fournit une méthode précise et efficace pour la détection des maladies vasculaires et du cancer.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été partiellement soutenu par des subventions de NSFC (82273796, 82111530209), des fonds spéciaux pour guider le développement scientifique et technologique local du gouvernement central (XZ202202YD0021C, XZ202102YD0033C, XZ202001YD0028C), le projet clé d’innovation scientifique et technique de la province du Hubei (2020BAB058), les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales et les programmes de prévention et de contrôle COVID-19 de la région autonome du Tibet pour le développement scientifique et technologique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous pyridine Perimed  110-86-1
Anhydrous sodium sulfate China national medicines Co.,Ltd SY006376
Black cardboard Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd AO00158
Column chromatography Energy Chemical E080498
Diphenylphosphine palladium dichloride Sigma-Aldrich B2161-1g
DSPE-PEG2000 Ponsure PS-E1
Dulbecco's modified eagle medium  Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Isoflurane GLPBIO GC45487-1
K2CO3 Macklin P816305-5g
N. N '- dimethylformamide China national medicines Co.,Ltd 02-12-1968
NIR-II imaging instrument Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd 16011109
N-sulfenanilide Enerry chemical  1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2 TCI  B2064-1g
penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Tetrahydrofuran China national medicines Co.,Ltd M005197
Tetratriphenylphosphine palladium Immochem 1021232-5g
Tetratriphenylphosphine palladium Sigma-Aldrich 1021232-5g
Tributyltin chloride Immochem QH004335
Trimethylchlorosilane China national medicines Co.,Ltd 40060560

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Médecine numéro 193
Une sonde de fluorescence NIR-II brillante pour l’imagerie vasculaire et tumorale
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Li, Y., Qiao, X., Hong, X. A Bright… More

Li, Y., Qiao, X., Hong, X. A Bright NIR-II Fluorescence Probe for Vascular and Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (193), e64875, doi:10.3791/64875 (2023).

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