本方案介绍了一套用于评估光控抗癌肽的实验方法，可用于此类化合物的临床前筛选。内容包括在二维和三维细胞培养体系中进行的细胞毒性评估、对肽类作用效果的评价 离体 （模型组织）光异构化效率，以及 体内 功效
方法文章
体外与体内光控生物活性化合物的评价——癌症光药理学潜在药物候选物
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
光控生物活性化合物是一类新兴的化合物 "智能" 候选药物。由于可通过将无害的非电离光精确引导至患者体内的特定部位，实现其在时空上的精准激活，因此在全身化疗中提供了额外的安全性。本文介绍了一组用于评估的方 体外 效价和 离体 光控生物活性化合物光激活的效率以及 体内 在药物开发早期阶段评估疗效。该方法应用于抗癌细胞毒性肽，即含有二芳基乙烯的已知抗生素短杆菌肽S（gramicidin S）类似物。实验采用癌细胞系（Lewis肺癌，LLC）的二维（贴壁细胞）和三维（球状体）细胞培养、活体组织替代物（猪肉糜）以及免疫健全小鼠的同种异体移植癌模型（皮下LLC）。通过自动荧光显微镜筛选最有效的化合物并估算实际的光治疗窗口。在不同深度的模拟组织中测定不同光照方案下的光激活效率，并将最优光剂量应用于最终的治疗。 体内 实验
引言
近年来，光控生物活性化合物已成为人类疾病安全化疗以及特异性消除恶性实体瘤的有前景的组成部分1。这类化合物含有可逆光异构化的片段（分子光开关），在不同波长的光照下可在无活性和有活性的光异构体之间切换。
与非光控类似物相比，光控药物可能更安全，因为它们可以以活性较低且基本无毒的形式全身性地引入患者体内，随后仅在必要部位（如肿瘤、溃疡和伤口）通过光照激活。尽管近年来的学术论文中已报道了多种此类分子药物原型的令人振奋的示例2,3,4,5,6,7，但临床光药理学——即获批药物/医疗器械/疾病组合的应用——这一领域尚不存在。光药理学仍处于药物发现阶段，尚未开展系统的临床前研究。
我们直到最近才证明了这一点 体内 对某些光控抗肿瘤肽具有安全优势，即肽类抗生素短杆菌肽S的类似物8这些光控衍生物包含一种二芳基乙烯（DAE）光开关，可在红光照射下生成的“开环”光异构体与紫外光照射下生成的“闭环”光异构体之间发生可逆的光诱导转化（如图所示）。 图1 对于其中一种衍生物，化合物 LMB002。
图 1：光控细胞毒性肽 LMB002 及其光异构化。 二芳基乙烯片段以红色标出。缩写：DAE = diarylethene。 请点击此处查看此图的放大版本。
发现苗头化合物并进行苗头化合物到先导化合物的优化，通常需要对合适的化合物库进行体外和体内筛选9,10。本文展示了一种适用于光控化合物细胞毒性系统性高通量筛选的方法学。我们还测定了光异构化效率，估算了模型组织中的光剂量，并评估了表现最佳候选化合物的体内功效。该方法符合生物伦理和动物护理的相关要求。
在本研究中，对传统的临床前方法进行了改进，以避免被测化合物发生非可控的光异构化。应用这些改进方法的总体目标是建立一种通用策略，该策略简便快速，且能够获得具有统计学意义的数据，从而实现可靠比较 体外 活性并进行合理化分析 体内 光开关化合物的效能测试，用于先导化合物的筛选与进一步开发。
该策略包含三个连续步骤。第一步涉及通过二维（2D，单层）和三维（3D，球状体）细胞培养结合共聚焦高通量自动荧光显微镜技术，测定选定的光控生物活性化合物在连续稀释条件下其活性与非活性光异构体的IC50（表观50%细胞存活率）。通过比较两种光异构体之间IC50的差异来评估光治疗窗口，并筛选出表现最优的候选化合物。在此阶段，采用自动显微镜与其他细胞毒性筛选平台（检测方法）进行毒性评估并无特定优势11；更复杂的基于细胞的肿瘤模型12可在此阶段轻松实施。
对于在步骤1中选定的化合物，第二步是通过在组织模拟物中使用经照射样品提取物的紫外检测高效液相色谱法（HPLC）定量测定其较不活跃光异构体的光致异构化效率，从而根据距照射组织表面深度的真实情况估算这些化合物在组织内部的光致异构化效率。体内也可研究光致异构化效率，但我们建议使用一种简单的组织模拟物——绞碎的猪肉。我们已验证了该方法的有效性。我们在小鼠癌症模型上测量了这些可光致异构化化合物的体内转化情况，观察到在某一深度下的光转化率与此前在小鼠实验中测得的结果大致相同8。也可选用任何合适的替代性人工组织13、3D生物打印组织/器官14、活检材料或其他豁免的动物源性材料。然而，该方案在经济性、速度和伦理方面达到了良好平衡。
第三步是确定 体内 在小鼠癌症模型中的抗癌功效。在特性上表现更优的化合物 体外 选择在模型组织中至少 1-1.5 cm 深度处能够进行实验并实现高效光切换的条件用于本实验。
该方案可适用于含有不同类型光开关的化合物，只要其光异构体（或光稳态，PSS）在合理时间内保持稳定（数天或更长时间）。为说明起见，本文采用一种先前报道的源自二芳基乙烯（DAE）的化合物 LMB002 作为示例15. LMB002 光敏形式具有热稳定性，可在 −20 °C 至少一年内不会发生显著降解。本研究选用刘易斯肺癌（LLC）细胞进行此项实验。 体外 和 体内 演示，但对细胞类型无限制。LLC细胞具有贴壁性，易于在三维条件下培养，并可用于生成肿瘤类器官（如参考文献所述）16). 在体 内 LLC 细胞可用于模拟转移过程，在免疫功能健全的小鼠中经皮下注射后可迅速形成实体瘤。 体内 该方法可普遍应用于其他癌症模型17,18该策略的详细实施步骤如下所述。
方案
动物饲养和实验操作均遵循涉及实验动物的研究项目相关的本地及国际法规（《乌克兰动物免遭虐待法》、《用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护欧洲公约》（欧洲公约，斯特拉斯堡，1986年）、《用于科学目的动物保护指令2010/63/EU》）。本研究已获得Bienta公司生物伦理委员会批准。实验中使用C57BL/6NCrl小鼠（成年雌性，每只体重约20 g）。具体的材料、试剂和设备列于材料表中。
1. 使用二维和三维LLC细胞培养评估LMB002（“闭环”和“开环”形式）的IC50
- 化合物缓冲液与储备溶液的配制
注意：使用标准方法配制缓冲液，或使用市售溶液。- 通过加入14.2 g Na2HPO4，2.4 g KH2PO4，80 克 NaCl 和 2 克 KCl 加入 1 升蒸馏水中。将配制好的 10x PBS 溶液高压灭菌，取 100 mL 10x 溶液加入 900 mL 蒸馏水中稀释成 1x 溶液。然后将溶液储存于 4 °C.
- 将 4.78 g DPBS 粉末加入 1 L 蒸馏水中，配制杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）。搅拌溶液至所有固体完全溶解，使用 pH 计检测 pH 值，并通过添加 1 M NaOH 或 1 M HCl 调节 pH 至 7.3–7.4。达到目标 pH 值后，将溶液经 0.22 µm 在无菌操作台中进行真空过滤。储存于 4 °C.
- 配制1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液：将238.3 g HEPES加入1 L蒸馏水中。用1 M NaOH调节溶液pH至7.5。经滤膜过滤 0.22 µm 在无菌操作台中进行真空过滤。储存于 4 °C.
- 通过稀释10倍浓度的胰蛋白酶-EDTA溶液（EDTA = 乙二胺四乙酸）来制备1倍浓度的胰蛋白酶-EDTA溶液。具体操作：在50 mL无菌离心管中，将5 mL 10x胰蛋白酶-EDTA溶液加入45 mL 1x PBS溶液中，混匀。储存于 4 °C.
- 准备基础杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）：加入13.4 g DMEM高糖粉末和3.7 g NaHCO₃至1 L去离子水中，搅拌溶解。过滤除菌，4 °C保存。2CO3 加入带有磁力搅拌子的量筒中，置于搅拌器上搅拌，直至所有固体溶解。使用pH计检测溶液pH值，并通过添加1 M NaOH或1 M HCl调节至pH 7.3–7.4。达到目标pH值后，将培养基溶液经由 0.22 µm 在无菌操作台中进行真空过滤，并保存于 4 °C.
- 将100 mL胎牛血清（FBS）、10 mL青霉素-链霉素溶液、10 mL L-谷氨酰胺溶液和10 mL 1 M HEPES缓冲液加入900 mL DMEM基础培养基中，配制DMEM完全培养基。储存于 4 °C.
- 制备待测化合物的储备液。
- 每种化合物分别称取两份5.12 mg（例如LMB002），置于两个1.5 mL离心管中（一个为透明管壁，另一个为黑色不透明管壁），另取一个透明管壁离心管称取2.28 mg阳性对照物（例如gramicidin S）。加入 100 µL 向每个样品中加入纯DMSO，并涡旋振荡30秒。
- 将贮备液（LMB002）置于透明管壁的离心管中，用660 nm激光（光功率密度0.6 W/cm²）照射溶液，使其从“关环”形式光异构化为“开环”形式2涡旋振荡以确保充分混匀。持续操作直至颜色明显由深紫色变为浅棕色。使用铝箔避光保护。
- 二维细胞培养实验——接种细胞（第1天）
- 从装有LLC细胞培养物的T-75培养瓶中转移10 mL DMEM完全培养基至15 mL无菌离心管中。用真空泵吸除剩余培养基。
- 用5 mL 1×DPBS洗涤细胞培养物，并用真空泵吸去溶液。
- 用 3 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA 溶液覆盖细胞，将培养瓶置于 2–3 分钟，进行孵育 37 °C 在5% CO₂环境中2 大气
- 通过向含有1x胰蛋白酶-EDTA溶液的细胞培养瓶中加入6 mL DMEM培养基（先前已转移至无菌管），终止胰蛋白酶反应，并用移液器反复吹打数次，使细胞从细胞培养瓶壁上脱落。
- 将悬液转移至15 mL离心管中，于200 × g离心 g 离心4分钟。离心后，用真空泵吸除上清液，避免触碰管底的细胞沉淀。
- 通过加入 2 mL 新鲜的 DMEM 完全培养基并反复吹打数次来重悬细胞。
- 通过取样约计数细胞 15 µL 将悬浮液分装至0.5 mL离心管中，加入 15 µL 加入0.4%台盼蓝，并将所得混合液转移至细胞计数室。
- 计数后，每个时间点准备 25 mL 细胞悬液。每孔接种 5,000–10,000 个 LLC 细胞（平均 8,000 个） 200 µL 在96孔板中央的60个孔中加入DMEM，该板具有透明底部和黑色不透明侧壁。其余36个孔中加入纯DMEM。
- 将培养板置于细胞培养箱中，37°C 过夜培养 37 °C 以及5% CO₂。在下方使用塑料培养皿盖以防止底部板受热不均。
- 二维细胞培养实验——添加化合物（第2天）
- 在培养板中通过光学显微镜观察细胞，直至细胞汇合度达到70%–80%。
- 用真空泵在无菌操作台中吸出孔板中的培养基。加入 100 µL 加入新鲜预热的DMEM培养基，并将培养板放入细胞培养箱中。
- 在聚丙烯灭菌透明板中配制待测化合物及阳性对照品的系列稀释液。为各个单独时间点的测定配制以下溶液：
注意：使用DMSO中的储备液，并用DMEM稀释，但最终最高浓度中DMSO的体积分数不得超过1%。- 获得一个 128 µM 短杆菌肽S溶液，加入 1.3 µL 20 mM 原液中的 198.7 µL DMEM的
- 为了获得一个 256 µM LMB002 溶液，“开环”形式，添加 1.3 µL 40 mM 溶液的 198.7 µL DMEM
- 为了获得一个 512 µM LMB002 溶液，“环闭合”形式，添加 2.6 µL 40 mM 储存液 197.4 µL DMEM
- 再进行三次重复实验，以获得每个浓度点的四组数据。通过吸取制备倍比稀释系列 100 µL 从每个起始孔转移至一个孔中 100 µL DMEM，充分混匀。
注意：使用光可切换化合物时需调整光照条件，以防止光异构化逆转。建议在无菌操作台内关闭光源。 - 获得各孔中化合物的最终浓度（5-150 µM通过转移 100 µL 每次在56孔板中加入制备好的溶液 100 µL 先前添加的DMEM。添加 100 µL 每次在四个孔中加入 DMEM 作为阴性对照。
- 用铝箔或塑料不透明保护罩覆盖培养板，以防止不受控的光转换。将培养板置于细胞培养孵育箱中 37 °C （使用下方额外的塑料板盖）孵育指定时间（10 分钟、60 分钟、24 小时或 72 小时）。
- 二维细胞培养实验——染色与成像（第2-5天）
- 孵育不同时间后，加入 50 µL 每孔加入染色液至已与化合物孵育10分钟和60分钟的孔板中。将孔板在 37 °C 20 分钟。
注意：通过添加为每个时间点配制储备染色液 8 µL 20 mM Hoechst 33342 溶液（终浓度为 5 µM), 32.5 µL 1 mM碘化丙啶（PI）溶液（终浓度为 1 µM），以及 650 µL 非无菌胎牛血清（FBS）的 5,810 µL 非无菌的1×PBS。将FBS和PBS在水浴中预热 37 °C 以防止细胞受到温度冲击。 - 使用20倍物镜进行自动荧光成像。
- 对经化合物孵育24小时（第3天）和72小时（第5天）的培养板重复相同的染色与成像步骤（步骤1.4.1–1.4.2）。
注：典型的二维平板图显示如下 图2.
- 孵育不同时间后，加入 50 µL 每孔加入染色液至已与化合物孵育10分钟和60分钟的孔板中。将孔板在 37 °C 20 分钟。
- 三维细胞培养实验——接种细胞（第1天）
注意：本节操作步骤与二维实验中所述的细胞培养准备、与待测化合物孵育及成像步骤（1.1–1.4）完全相同。然而，在本实验中，细胞以紧凑成熟的球体形式培养于384孔超低吸附U型底培养板中，该培养板具有黑色不透光侧壁。使用此种规格的培养板可在一次实验中同时比较两种化合物。- 重复二维实验方案中的步骤1.2.1-1.2.9，使用LLC细胞培养。
- 计数细胞后，制备25 mL细胞悬液。每孔接种1,000个细胞，接种至所有孔中 50 µL 在384孔低吸附U型底板中加入DMEM。
- 40 × g 离心 g 30 秒，然后在 250 rpm 条件下使用板式振荡器振荡 1 分钟，使细胞从孔壁脱落至孔底。
- 将培养皿置于培养箱中，在 37 °C 和5% CO₂2 置于额外的塑料板盖上方，以防止板底受热不均，持续48小时。
- 3D细胞培养实验——添加化合物（第3天）
- 通过显微镜观察培养板中的细胞，以确认致密成熟的球状体已形成。
- 在聚丙烯无菌透明板中配制待研究化合物的系列稀释液。本实验中，额外加入一种化合物。为各个时间点的测定分别配制以下溶液：
- 为了获得 175 µM 和 350 µM 短杆菌肽S溶液，加入 1.8 µL 20 mM 原液 198.2 µL DMEM并添加 3.6 µL 的储备液至 196.4 µL DMEM 的相应部分。
- 为了获得 175 µM 和 350 µM LMB002 溶液，“开环”形式，添加 1 µL 40 mM 储备液的 199 µL DMEM并添加 1.8 µL 的储备液至 198.2 µL DMEM 的相应部分。
- 获得 350 µμ 和 1,750 µM LMB002 溶液，“闭环”形式，添加 1.8 µL 40 mM 储存液 198.2 µL DMEM 并添加 8.8 µL 的储备至 191.2 µL 相应地，DMEM。
- 进行三次额外的重复实验，以获得每个浓度点的四组数据。通过移取获取系列稀释液 20 µL 从每个起始孔中转移至对应孔中， 180 µL DMEM，并充分混匀。
注意：使用光可切换化合物时需调整光照条件，以防止反向光异构化。建议在无菌操作台内关闭灯光。 - 通过转移获得孔中化合物的最终浓度 20 µL 每次在128个孔中加入配制好的溶液 50 µL DMEM。加入 20 µL 每次在三个孔中加入DMEM作为对照。用铝箔或塑料保护罩覆盖培养板，以防止光转换或蒸发。
- 将培养板置于塑料板盖上，放入细胞培养孵箱中，按照选定的孵育时间进行孵育。
- 三维细胞培养实验——染色与成像（第3-6天）
- 按时间点配制染色液，通过加入 13 µL 1 mM 钙黄绿素AM溶液（终浓度为 1 µM), 22 µL 20 mM Hoechst 33342 溶液（终浓度为 33 µM), 40 µL 1 mM PI 溶液的（终浓度为 3 µM), 300 µL 非无菌胎牛血清（FBS）的 2,625 µL 非无菌的1×PBS。将FBS和PBS在水浴中预热 37 °C 以防止细胞受到温度冲击。
- 孵育不同时间后，加入化合物 20 µL 每孔加入染色液，加入至已与化合物孵育10分钟的孔中。于 37 °C 2小时。
- 使用20倍物镜进行荧光共聚焦成像。
- 对在化合物中孵育 24（第 4 天）和 72（第 6 天）小时的孔重复相同的染色与成像步骤。
注意：本实验中，钙黄绿素 AM 用作多色染色溶液的第三种组分。使用仪器自带的自动图像分析软件对二维和三维实验获得的图像进行分析。经 Hoechst 和碘化丙啶染料共染的细胞被视为坏死性死亡细胞，以其占比作为浓度的函数用于计算 IC50 值
图2：二维培养实验中典型孔板布局示例。 图中显示了化合物与对照组的颜色编码。测试化合物的浓度（孔内数字）以 µM 表示。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 在组织模拟物中测定光开关效率
- 按照图3所示组装用于样品照射的光路（包括来自激光光源的光纤、可变焦距透镜、带不透明罩的注射器以及一个平切末端）。
- 通过调节透镜的焦距和孔径，获得一个光束平面，其直径比所用注射器的内径大1-1.5 mm，但尽可能仍处于孔径范围内。
- 使用一个末端被切平、内径为12.4 mm、并覆盖有不透明塑料罩的5 mL注射器。在激光输出功率为200 mW时，使用光度计测量光学系统输出端的功率密度，调节至约103 mW/cm2。
注意：所有后续操作必须在尽可能降低环境光照的暗室中进行。 - 用PBS配制3 mL浓度为1 mg/mL的LMB002（“闭环”形式）储备液。
- 在塑料容器中制备负载了LMB002非活性光异构体的模拟组织样品。典型操作中，将5 g新鲜绞猪肉与277 µL LMB002储备液和260 µL PBS机械混合，使样品中终浓度达到50 mg/kg，并使组织/PBS体积比约为9/1（v/v）。
- 将制备好的样品装入注射器中，确保内部无气泡，并在照射端（切口端）形成一个平整表面。
注意：注射器内样品柱沿轴向长度应约为40 mm。 - 按照图3所示光路对样品照射9分44秒，对应剂量约为60 J/cm2。
- 照射完成后，通过推动活塞将样品从注射器中挤出，并用手术刀切割成4 mm厚的切片。称重后将各切片分别放入不同的试管中，并根据其距照射表面的平均距离（mm）进行标记。
- 准备两个对照样品（最佳用量为0.5-0.7 g），分别置于试管中：其中一个为绞猪肉与10%（体积）PBS（54 µL）的混合物；另一个为步骤2.4中制得的模拟组织样品，用500 mW激光照射10分钟，以确保所有LMB002“闭环”分子完全转化为“开环”形式。
- 向每个切片及对照样品中加入乙腈-水混合液（70%/30% v/v，含0.01%三氟乙酸（TFA），1.4 mL/g），用玻璃棒充分混匀。
- 室温孵育至少10分钟，然后在5220 x g下离心20分钟，或在20 x g下离心30分钟两次，以去除不溶物并收集上清液。
- 小心收集上清液（约0.7 mL），并在16,000 x g下再次离心30分钟。
- 收集上清液（每份约0.5 mL），使用C18分析柱进行反相高效液相色谱（RP HPLC）分析，采用线性A:B梯度（3.46% B/min）、流速2.0 mL/min，进样体积100 µL。在570 nm（检测“闭环”形式）和270 nm（检测“开环”形式）记录紫外检测色谱图。利用未照射的样品（步骤2.4）和照射后的对照样品（步骤2.8）确定两种光异构体的特征保留时间（流动相A：含0.1% TFA的水溶液；流动相B：90%乙腈-水，含0.1% TFA），并对方法进行校准。
- 通过测定已知浓度LMB002溶液的色谱图并建立标准曲线，确定分析样品中LMB002各光异构体的实际含量。用于校准的LMB002“闭环”溶液，是将储备液（步骤2.3）用含0.01% TFA的乙腈-水混合液（70%/30% v/v）稀释，得到每100 µL进样体积中含0.36、0.9和3.6 µg的溶液；洗脱梯度和流速与步骤2.12相同。
- 重复实验（步骤2.4–2.12）三次，绘制每种光异构体归一化百分比随距照射组织表面距离变化的曲线图（横轴为距离，纵轴为百分比）。计算各浓度点的统计学参数（如标准偏差）。
图3：测定模型组织中光转化效率的实验装置。（A）示意图和（B）实物照片；1，来自激光光源的光缆；2，焦距可调的透镜；以及3，置于4中的肉糜-LMB002-磷酸盐缓冲液混合物，该容器为带不透明外壳且前端切开的注射器（B图中未显示外壳）。请点击此处查看此图的放大版本。
3. 体内 抗癌功效测定
注意：实验时间安排和终点见图4。处理后阶段的动物护理标准应符合3R原则——饲养环境应包含适当的笼内密度和资源供给。在可行的情况下，应采用非应激性动物操作方法，例如使用引导隧道或手捧法。
图 4：时间安排 体内 治疗实验 实验分组的命名、治疗细节、终点指标和 死后 分析时间表。缩写：LLC = Lewis 肺癌；IV = 静脉注射；SC = 皮下注射。 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 皮下接种癌细胞的准备（第0天）。
- 在37 °C、5% CO2条件下，使用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基（4.5 g/L葡萄糖）传代培养LLC细胞。
- 用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，离心后重悬于无血清DMEM培养基中。
- 使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法计数细胞并测定其活力。
- 将细胞重悬于DMEM与Matrigel（1:1）混合液中，调整终浓度为10 × 106 cells/mL。注射前将细胞悬液置于冰上保存。
- LLC细胞接种（第0天）
- 将一只成年雌性C57BL/6NCrl小鼠（体重约20 g）放入异氟烷麻醉机的诱导室中，以5%异氟烷进行麻醉，直至动物完全失去意识。
- 通过剃毛去除接种部位的毛发。
- 在小鼠右后肢皮下接种5 × 105个LLC细胞，接种体积约为100 µL，使用DMEM:Matrigel（1:1）混合液。
注意：尽可能遵循一次性使用针头的原则。
- 化合物给药与光照射
注意：接种后5-8天，当小鼠肿瘤可触及且体积达到约50-100 mm3时，即可开始治疗。所有涉及LMB002及其处理小鼠的操作均应在半暗环境中进行（工作区域至少距离一个4 W LED灯5米）。- 将LMB002（“闭环”形式）溶于无菌生理盐水中，配制成1 mg/mL的溶液，用于静脉注射给药（剂量为5 mg/kg），获得深蓝色均匀溶液。
- 照射前，将动物随机分为四组，每组八只，并通过剃毛去除肿瘤及其周围区域的毛发。
- 将小鼠固定于尾静脉注射装置中，将其尾巴在37 °C水浴中预热，以使尾静脉清晰可见。
注意：可考虑术前镇痛。 - 按5 mL/kg剂量经尾静脉注射化合物。对于两个对照组，每只动物（体重20 g）静脉注射100 µL生理盐水。确保两个实验组小鼠接受的是处于非活性光异构形式的测试化合物（1 mg/mL溶于生理盐水）。
注意：尽可能遵循一次性使用针头的原则。 - 给药后2小时45分钟，将小鼠置于麻醉状态。以氧气中含3%-4%异氟烷诱导麻醉，随后以氧气中含0.5%-1%异氟烷维持麻醉15分钟。
- 用带有开孔的黑色遮罩覆盖小鼠，仅暴露肿瘤区域接受光照。
- 开启波长为650 nm的激光二极管模块，将红色激光功率设为200 mW，蓝色/紫外引导激光功率设为2 mW。
注意：激光设备开启时应佩戴蓝色防护眼镜。 - 使用光度计测量红色激光的光通量（远离小鼠位置），确定光通量为100 mW/cm2时的光纤距离。将光纤固定在支架上，确保光源与肿瘤之间的距离恒定，并使光照完全覆盖肿瘤区域。此过程中使用蓝色/紫外引导激光进行定位。
- 开启红色激光，对肿瘤区域照射20分钟。
- 照射结束后，关闭异氟烷气流，将动物放回笼中，并在接下来的30分钟内密切观察其状态。
注意：给药后，小鼠需在黑暗环境中饲养2天。仅改变光照-黑暗周期，其余饲养条件应保持不变。
- 治疗后观察
- 每日观察动物状态，记录体重及肿瘤尺寸变化。测量肿瘤体积，并记录坏死进展情况。
注意：治疗后的动物护理标准应符合3R原则——饲养环境应保证适当的笼内密度和资源可及性。 - 利用上一步收集的数据评估死亡率，采用标准程序计算生存率。
注意：当动物出现严重临床症状（体重减轻超过15%、肿瘤溃烂持续7天未愈合、发出叫声）或肿瘤体积达到2,500 mm3时，应实施安乐死并计为死亡。
- 每日观察动物状态，记录体重及肿瘤尺寸变化。测量肿瘤体积，并记录坏死进展情况。
结果
本研究通过二维和三维细胞实验，测定LMB002的“闭环”和“开环”形式在不同孵育时间下的半数抑制浓度（IC50）（见图1），并将这些值与原型肽gramicidin S（作为阳性对照）的相应结果进行比较。典型的二维培养LLC细胞经染色后孵育图像如图5所示。使用Hoechst 33342（蓝色）和碘化丙啶（红色）共染色后，与“闭环”形式相比，“开环”形式处理的细胞中呈现更多不同深浅的紫色，表明两种形式之间的细胞毒性存在显著差异，且该差异易于量化。本实验成功示例基于采用96孔板格式收集的数据，其中按不同浓度加入肽的不同变体，如图2所示。类似数据也可通过384孔板及高密度孔板获得。然而，由于每孔体积减少，技术误差和系统误差将随之增加，导致IC50测定的准确性随孔密度升高而下降。
图 5：单层培养 LLC 细胞毒性实验的代表性图像。 细胞经 Hoechst 33342（蓝色）和碘化丙啶（红色）染色。所示时间：10 分钟、60 分钟、24 小时和 72 小时，为化合物孵育时间。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
在模拟组织（新鲜猪肉糜）中，通过激光照射测定LMB002的光转化过程：将LMB002“闭环”（非活性）形式溶解于PBS后与肉糜混合，制备样品，并沿辐射传播方向检测该非活性形式转化为LMB002“开环”（活性）形式的程度。将样品装入注射器中，用平束激光从一侧照射约10分钟（通常用于体内实验的照射时间），如图3所示。照射结束后，通过推动注射器活塞并用解剖刀切割出等厚的样品片，将样品圆柱体分段。采用反相高效液相色谱法（RP HPLC）测定各片层提取物中LMB002“开环”形式的浓度。
图6展示了由数据分析获得的剂量-效应曲线图6A-D。为了确定经Hoechst 33342和PI染料核共染色的死细胞百分比，我们使用了一种内置的分类器工具，该工具在选定的测量参数上设置数值阈值，将所有细胞计数划分为若干类别。例如，当对照组中红色通道（碘化丙啶）信号处于阈值（约110-130单位）时，细胞可被分类为碘化丙啶阳性（视为死亡）或碘化丙啶阴性（视为未受化合物影响）。对于LMB002，可见碘化丙啶阳性细胞百分比随化合物浓度变化的S形依赖关系。根据这些数据可确定IC50值。
图 6：二维培养中细胞毒性的分析。 在 Lewis 肺癌（LLC）细胞培养中，经化合物处理后在（A）10 分钟、（B）60 分钟、（C）24 小时和（D）72 小时时段孵育所获得的 S 形拟合曲线。通过拟合可准确确定 IC50 值（未显示）。误差棒表示标准误（SEM）。缩写：LLC = Lewis 肺癌；PI = 碘化丙啶。 请点击此处查看该图的高清版本。
根据获得的IC50值可以得出结论：这三种化合物的毒性均随孵育时间的延长而增加。实验结果显示，LMB002的“开环”形式比原型肽格拉米西丁S的毒性低约一个稀释梯度；而“闭环”形式的毒性则低三到四个稀释梯度，且其毒性随孵育时间延长而进一步增强。这两个稀释梯度之间的差异不受孵育时间延长的影响，可作为实验测定的光治疗窗数值6，用于与潜在化合物库中其他化合物进行比较。格拉米西丁S的IC50值被设定为参考点，以校正实验误差或生物学重复之间的差异性结果。
3D 细胞实验产生了相同类型的原始数据——每个孔中单个细胞分辨的球状体图像。通过加入钙黄绿素作为第三种染色染料，可对代谢活跃细胞的比例进行定量分析（在绿色通道中观察）。通过使用 384 孔板、增加技术重复次数、排除冗余的共孵育时间点以及调整稀释倍数，我们能够在单次测试运行（使用单个板）中直接比较多种化合物，如 图 7 中的板布局所示。
图 7：两种化合物的 3D 培养实验板图。 图中所示为化合物与对照组的颜色编码。孔中数字表示浓度，单位为 µM。10 min、24 h 和 72 h 为孵育时间。请点击此处查看该图的放大版本。
图8 显示了在存在待测化合物的情况下，以每孔1个类球体的密度培养的LLC类球体以及对照类球体在染色后拍摄的部分技术重复样本的图像。
图 8：三维培养细胞毒性测定的代表性图像。 图像显示了经 LMB002 的两种光异构体和短杆菌肽 S 共同孵育 10 分钟、24 小时和 72 小时后，48 小时龄的 LLC 类球体经 Hoechst 33342（蓝色）、钙黄绿素 AM（绿色）和碘化丙啶（红色）染色的结果。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看此图的放大版本。
使用仪器软件，从Z轴堆叠的图像中获得了剂量-效应曲线，类似于二维实验中的结果（图9A）。此外，可通过整体球体直径对三维培养中致密且无变形的类球体进行表征（图9B）。同时注意到，类球体的整体直径随化合物浓度的变化而变化。
图 9：采用三维培养进行的细胞毒性评估。（A）LLC 细胞三维共培养物与短杆菌肽 S 共同孵育 10 分钟、24 小时和 72 小时后，在染色前采集数据所得的浓度依赖性细胞毒性拟合曲线；（B）相应的浓度依赖性类球体直径变化图。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的高清版本。
第2步的实验通过紫外检测高效液相色谱法测定两种光异构体中LMB002的浓度。利用该装置可方便地评估并量化模型组织中的光转化效率（图3）。数据来源于对样品提取物色谱图的定量分析。在这些测试实验中，LMB002的色谱图在270 nm和570 nm波长下进行光谱检测。在270 nm处，观察到许多额外信号，归因于从模型组织中共提取的化合物（通过不含该化合物的对照提取物验证）。两种光异构体在保留时间和吸收特性上具有足够差异。然而，LMB002的“开环”信号与这些背景信号实现了基线分离（参见图10A中的代表性色谱图），因此该信号可无干扰地进行积分。在570 nm处，色谱图中仅含有LMB002“闭环”形式的信号（图10B）。在此，我们采用反相高效液相色谱法（RP HPLC）进行浓度测定。然而，若采用液相色谱-质谱联用（LC/MS）作为分析方法，则可实现更高的准确度和更低的检测限。
图10：从模型组织中提取的LMB002的代表性色谱图。（A）距辐照表面2 mm处的样品，在270 nm处记录（积分LMB002“开环”形式）；（B）距辐照表面38 mm处的样品，在570 nm处记录（积分LMB002“闭环”形式的峰）。保留时间值（已标出）进一步确认了该化合物的身份。请点击此处查看此图的放大版本。
对所有采集样品的相应信号进行积分后所得数据用于构建浓度-深度曲线图，如图11所示。基于这些图表，可方便地评估模型组织不同深度处的光转化效率。结果证实，在组织模拟物绞肉中（约103 mW/cm2条件下），我们的红光光源可在深度达1 c处诱导LMB002发生“闭环”光转化。
图11：光转化效率评估。 模型组织照射表面不同距离处（L，mm）LMB002 的“闭环”（非激活态，蓝色圆点）和“开环”形式（激活态，橙色圆点）的浓度（A，mg/kg）。请点击此处查看该图的放大版本。
实验结果 体内 实验 - 按照所示时间表进行的方法学第3步 图4 - 用显示肿瘤生长随时间变化的曲线图表示（图12）以及Kaplan-Meier生存曲线（图13).
图12：动物体内肿瘤生长动态。 接受LMB002治疗的动物与接受载体治疗的动物进行比较（C57BL/6NCrl小鼠皮下LLC同种移植模型，化合物剂量为7 mg/kg，静脉注射，孵育2 h 40 min后在650 nm波长、100 mW/cm2功率密度下照射20 min）。请点击此处查看该图的高清版本。
图13：动物死亡率曲线。 接受LMB002治疗的动物与接受对照溶剂治疗的动物比较（C57BL/6NCrl小鼠皮下LLC同种移植模型，化合物剂量为7 mg/kg，静脉注射，孵育2小时40分钟，随后在650 nm波长、100 mW/cm2功率密度下照射20分钟）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
光控化合物在药物开发中尚属前所未有；然而，目前尚未建立针对其临床前和临床评价的方法。最接近的单药治疗类似物——光动力疗法（PDT）——已被许多国家采用作为癌症治疗的临床手段，并正在开发用于其他适应症19,20。与光药理学类似，PDT同样依赖光来激活生物活性物质（单线态氧）。因此，PDT中用于临床前和临床研究的一些实验方法可被光药理学借鉴采用。例如，用于PDT的光源、光递送方式及医疗器械均已发展成熟并获得批准，可直接用于光控药物的评价。然而，PDT与光药理学之间存在诸多差异4，这说明有必要为后者建立专门的方法体系。
首先，光动力疗法（PDT）中未激活的物质（氧气）在活体组织中始终以 无毒浓度存在。相比之下，未激活的光控生物活性化合物可能具有残余活性和非预期的毒性。因此，理想的光药理学药物在其给药形式下应具有尽可能低的生物活性，而在光照激活形式下则必须具有高度活性，其"光治疗窗口"21应尽可能宽。发现苗头化合物并进行苗头到先导化合物的优化，需要在药物研发的早期阶段就筛选出合适的化合物，并对相对大规模的化合物库进行筛选。本文中，我们提出采用自动化的高通量共聚焦荧光显微镜技术，用于识别高效的光可切换化合物。
所选的细胞毒性评价方法能够轻松满足最关键的条件——维持PSS或可见光敏感型光异构体的稳定性。这是因为该方法在实施过程中可将光照暴露降至最低。因此，若选择其他替代方法，应优先考虑自动化方法。该方法可靠且信息丰富。在此阶段使用三维细胞培养（球状体）可更真实地模拟组织微环境，从而全面理解细胞对治疗的响应。此外，通过显微镜这一直接方法，还可获得有关化合物作用机制的宝贵信息。采用适当的染色方案进行共聚焦荧光显微镜观察，可直观评估细胞和球状体的形态，并检测到细胞死亡及细胞内部变化的重要细节。
其次，光照射的应用需要谨慎选择光剂量。在光动力疗法中，过量的光照对组织极为有害。22光药理学治疗在强光照射条件下可能具有优势。激活态物质的上限由非激活态物质的给药剂量及其药代动力学决定。然而，光照剂量仍是光药理学中的一个问题。需注意确保照射功率密度和暴露时间不会 较少 高于治疗所需剂量。原则上，可对活化物质的生成进行监测 体内然而，出于生物伦理学的考虑，我们设计了一项使用模型组织（新鲜绞肉）与非活化化合物混合的实验15该实验操作简单，可修改以使用不同的光源。此外，该实验还可适用于光物理剂量的估算以及热效应的测量。同样，通过使用模型组织，可实现光照射剂量的最小化，相较于在更精确的光开关效率测定中所采用的方法，例如， 体内 条件，一种可能始终值得考虑的替代方案。
最后，那些在测试中表现出优异特性的化合物 体外 毒性筛选，并可高效光控切换，至少在模型组织深达1-1.5 cm处有效，方可进入后续昂贵、耗时且费力的步骤 在体 研究中。在本方案中，我们使用了相同的细胞系（LLC） 体外 评估以构建同种异体移植癌症模型。肿瘤生长动态、死亡率和转移灶数量是评估抗癌效果最合适的参数。与传统化疗相比，光药理学治疗额外引入了一个因素——光。因此，需要设置两个对照动物组：一组仅接受载体处理，另一组接受载体并进行光照。该设计可评估光对所测参数的影响。在本实验中，两个实验组动物均给予未激活的化合物，其中一组小鼠的肿瘤接受光照。对照组与治疗组的光照方案保持一致。此阶段无需与标准化疗进行比较，因为实验主要目的是验证光照与化合物联用的协同效应。表现出最佳协同效应的化合物可被筛选出来，用于后续深入研究 体内 毒性和与基准的比较，以对其开发做出关键的决策。从技术上讲， 体内 我们所描述的实验可轻松适用于药代动力学或药效动力学研究，例如针对已选定作为候选药物的化合物。
披露
IVK、OB、SA 和 ASU 是已授权专利家族“具有光控生物活性的肽模拟物”（WO2014127919 [A1]、EP2958934 [B1]、US9481712 [B2]、UA113685 [C2]）的发明人，该专利已授权给 Lumobiotics GmbH。IVK、OB、TS 和 SA 是 Lumobiotics GmbH 的创始人及股东。IVK 是 Enamine LLC 的科学顾问，HK、TM、IP 和 PB 是 Enamine LLC 的员工。除上述披露外，作者与任何组织或实体均无其他相关隶属关系或经济利益，亦不存在与本出版物所讨论主题或材料相关的经济利益冲突。
致谢
作者感谢欧盟通过 H2020-MSCA-RISE 项目 PELICO（#690973）和 ALISE（#101007256）提供的资助。本研究得到了德国研究基金会 DFG-GRK 2039（SA、TS 和 ASU）、亥姆霍兹学会 NACIP 项目（SA 和 ASU）以及德国联邦教育与研究部 BMBF 的 VIP+ 项目（OB 和 ASU）的支持。我们感谢卡尔斯鲁厄理工学院的 Serhii Koniev 博士合成了化合物 LMB002，并对其进行了纯化，且慷慨提供了本研究所需的该化合物。作者还感谢 Maksym Chupryna 在乌克兰完成了本视频的拍摄与剪辑工作，并向所有勇敢的乌克兰保卫者致以敬意，正是他们的努力使得本论文的实验工作、撰写和视频拍摄得以完成。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Agilent 1100 系列毛细管液相色谱系统 | ALSI-Chrom（Agilent 分销商） | - | |
| ATCC CRL-1642，LL/2（LLC1）Lewis 肺癌细胞系 | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl 小鼠，雌性，近交系 | Charles River | 品系编号：027 | |
| CelCulture，CO2 培养箱 | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel 基底膜基质 | Merck | CLS354234 | |
| Corning，384 孔球状体微孔板 | Merck | CLS3830 | |
| 胎牛血清 | Merck | F7524 | |
| Gibco，DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| 短杆菌肽 S | Lumobiotics | 定制合成 | |
| HyClone，DMEM/高糖 | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS 成像系统 | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen，Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| 异氟烷麻醉机 | ASA | 序列号：ASA 1305 | |
| L-谷氨酰胺，200 mM 溶液 | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon 半导体手术激光器 | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | 定制合成 | |
| 青霉素–链霉素稳定溶液 | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate，96 孔板 | PerkinElmer | 6055302 | |
| 光度计 PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific，Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific，碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| 台盼蓝，0.4% 溶液 | Merck | T8154 | |
| 胰蛋白酶–EDTA，10 倍溶液 | Merck | T4174 | |
| UltraCruz 带通气盖细胞培养瓶，75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz 瓶顶滤器，PES，0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP，C18 HPLC 色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm） | Altmann Analytik（Avantor 分销商） | GR5103827 |
参考文献
- Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
- Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L. Molecular photoswitches in aqueous environments. Chemical Society Reviews. 50, 12377-12449 (2021).
- Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
- Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D. In Vivo Photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
- Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
- Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682(2023).
- Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
- Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28(2020).
- Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C. Components of successful lead generation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (4), 421-439 (2005).
- Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
- Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
- Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
- Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536(2020).
- Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
- De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124(2022).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19(2017).
- Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
- Hull, K., Morstein, J., Trauner, D. In vivo photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
- Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
- Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).
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