Summary
本プロトコルは、FeCl3媒介傷害を使用して動脈血栓症を誘発する方法、および電子顕微鏡分析のために血栓症の様々な段階で動脈損傷サンプルを収集して調製する方法を記載している。
Abstract
心血管疾患は、世界中の死亡率と罹患率の主な原因です。異常な血栓症は、糖尿病や肥満などの全身状態、およびアテローム性動脈硬化症、癌、自己免疫疾患などの慢性炎症性疾患の一般的な特徴です。血管損傷時には、通常、凝固系、血小板、および内皮が調整された方法で作用し、損傷部位に血餅を形成することによって出血を防ぎます。このプロセスの異常は、過度の出血または制御不能な血栓症/不十分な抗血栓活性のいずれかを引き起こし、血管閉塞とその後遺症につながります。FeCl3誘発頸動脈損傷モデルは、血栓症が in vivoでどのように開始および進行するかを調べる上で貴重なツールです。このモデルには、内皮の損傷/露出とそれに続く損傷部位での血餅形成が含まれます。これは、さまざまな程度の血管損傷に応答して血管損傷と血餅形成を監視するための高感度で定量的なアッセイを提供します。最適化されると、この標準的な手法を使用して、血栓症の根底にある分子メカニズム、および成長する血栓における血小板の微細構造変化を研究することができます。このアッセイは、抗血栓薬および抗血小板薬の有効性を研究するのにも有用である。この記事では、FeCl3誘発動脈血栓症を開始および監視する方法、および電子顕微鏡による分析のためにサンプルを収集する方法について説明します。
Introduction
血栓症は、血管を部分的または完全に遮断し、血液の自然な流れを妨げる血栓の形成です。これは、虚血性心疾患や脳卒中などの重度で致命的な心血管イベントにつながります。心血管疾患は罹患率と死亡率の主な原因であり、世界中で4人に1人が死亡しています1,2,3。血栓症は血管系の機能不全として現れますが、根本的な微生物またはウイルス感染、免疫障害、悪性腫瘍、または代謝状態の結果である可能性があります。血流は、内皮細胞、赤血球/白血球、血小板、凝固因子など、血管系の多様な構成要素間の複雑な相互作用によって維持されています4。血管損傷を受けると、血小板は内皮下マトリックス上の接着タンパク質と相互作用し、それらの顆粒内容物を放出し、より多くの血小板を動員します5。同時に、凝固カスケードが活性化され、フィブリンの形成と沈着につながります。最終的に、血餅が形成され、フィブリンメッシュ6内に閉じ込められた血小板および赤血球を含む。血栓症を調節するために抗血小板薬と抗凝固薬が利用可能であるが、偽の出血は依然としてこれらの治療法の主要な懸念事項であり、これらの薬の投与量と組み合わせの微調整が必要である。したがって、新しい抗血栓薬を発見することが依然として緊急に必要です7。
血栓症は、血管損傷を与えるために複数の方法を使用して研究されています:機械的(血管結紮)、熱的(レーザー損傷)、および化学的損傷(FeCl3 /ローズベンガルアプリケーション)。血栓症の性質は、損傷の場所(動脈対静脈)、方法、または程度によって異なります。これらすべてのタイプの中で、FeCl3誘発血管損傷が最も広く使用されている方法です。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ8、9、10、11、12に採用されています。この方法は比較的簡単で使いやすく、主要なパラメータが標準化されていれば、さまざまな血管系(動脈[頸動脈および大腿骨]、静脈[頸静脈]、細動脈[火葬場および腸間膜]など)で感度と再現性があります(補足表1)。
このモデルは、血餅形成の力学と形態の理解を深めるためにも使用できます。この技術は、血栓症が閉塞する前にプロセスの中間段階を研究するために、さまざまな流速ポイントで血栓症を止めるという独自の利点を提供します。血栓症研究における最近の進歩は、このモデルを使用して、血栓溶解の非薬理学的方法13または抗血栓薬および/または線維素溶解剤の非侵襲的送達に注意を向けている14,15。いくつかのグループは、血小板膜がこれらの治療薬でコーティングされている場合、標的凝血塊への熱刺激により薬物を活性化できることを示した16。ここで説明する手法は、単一血小板レベルでの所見の検証などの研究に役立ちます。この原稿では、プロトコル1は基本的なFeCl3媒介血管損傷手順を説明し、プロトコル2は電子顕微鏡によるさらなる分析のために血管損傷サンプルを収集して固定する方法を説明しています。
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Protocol
ここで議論されているすべての実験は、ケンタッキー大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認されました。
注意: 手術器具は 、図1 と 材料表に記載されています。C57BL / 6Jマウス、8〜10週齢、雄/雌または関連する遺伝子操作(ノックアウトまたはノックイン)株を使用した。
1. FeCl3誘発頸動脈損傷
- マウス麻酔誘導
- マウスの重量を量ります。
- 0.2 g / kgのトリブロモエタノール溶液を腹腔内(i.p.)に注射してマウスを麻酔します。注射する前に、麻酔液が室温(RT)にあることを確認してください。この用量は、マウスを約1時間鎮静させるのに十分である。
- 注射の5分後につま先をつまんでつま先の反射をチェックし、マウスが鎮静していることを確認します。マウスが鎮静されていない場合、つま先を引き離します。その場合は、5分待ってからもう一度確認してください。
- マウスがまだ完全に鎮静していない場合は、初期用量の1/4を投与し、5分間待ちます。
- 手順全体を通して、つま先ピンチを介してマウスの麻酔面を定期的に監視します。さらに、呼吸数と体温を監視して、最適な麻酔を維持することもできます。
- マウスを固定する
- マウスを仰臥位の加熱パッド(37°C)に置き、粘着テープを使用して四肢を固定します。
- 手術糸(0.1 mm)を使用してマウスの上部前歯をそっと引っ張り、頸部/頸部を拡張します。これは、手術領域のより良い視覚化とドップラープローブの安定性にとって重要です。糸のサイズは、動物の前歯を引っ張って首を伸ばすためにのみ使用されるため、重要ではありません。
- 切開
- 手術部位に70%エタノールをスプレーするか、アルコールワイプで拭きます。
- 綿棒を使用して、手術部位に少量の脱毛クリームを塗ります。1〜2分待ってから、濡れたペーパータオルまたはティッシュを使用してクリームを取り除きます。
注:このステップは、清潔な手術領域にとって重要です。 - はさみと鉗子(図1B11、1B13)を使用して、下顎骨から胸骨上ノッチまで正中線を切開します。皮膚を引っ込めて、領域をよりよく視覚化します(図2A)。
- 頸動脈露出
- 外科用鉗子と微小解剖鉗子を使用して、重なっている表在筋膜を鈍く解剖し、それを取り除くと左頸動脈が露出します(図1B12、1B13)。この段階では、この領域の他の血管系を傷つけないように、はさみを使用しないようにしてください。
- 頸動脈周囲の余分な組織を取り除きます。この領域には迷走神経と椎骨動脈があるため、周囲の組織の過度の解剖は避けてください。
- 頸動脈を外科的および縫合結鉗子で解剖することにより、頸動脈を周囲の組織から分離します(図1B12、1B15、2C)。動脈や周囲の血管系への機械的損傷を避けるために、動脈を伸ばしたり引っ張ったりしないように注意してください。
- 動脈の下にプラスチック片を置き、損傷の場所をマークします(図2D)。手術野で見やすくするために、色付きの透明シートを使用してください。
- フロープローブの配置
- ドップラー遷音速フロープローブを生理食塩水(dH2O中の0.9%NaCl)に約10分間入れます。プローブのもう一方の端を流量計のアタッチメントに挿入して、流量の読み取りを容易にします。流量計をコンピュータに接続します。
注意: 手術の合間には、ドップラー遷音速フロープローブを生理食塩水に入れる必要があります。手順全体を通して、プローブを湿らせて清潔に保ってください。 - 超音波ドップラー遷音速フロープローブをプラスチックの上流の動脈の周りに配置します(図2D)。プローブの容器ホルダー領域が伸びすぎていないことを確認してください(図1C、赤い矢印)。
注意: 必要に応じて、ガーゼパッド(図1B1)でプローブを支えてプローブの適切な高さを実現し、最適な読み取り位置を容易にします。 - この時点で手術部位が乾燥している場合は、RT生理食塩水を数滴加えて、その領域を湿らせます。フロープローブの読み取りを監視します。最適な測定値は動物ごとに異なり、0.6〜1.2 mL / minの間のどこでもかまいません。安定性が低いか安定していない場合は、フロープローブの位置を変更して最適な読み取り値を取得します。
注意: マウスの首が伸びすぎていないこと、および手術領域がきれいであることを確認してください。
- ドップラー遷音速フロープローブを生理食塩水(dH2O中の0.9%NaCl)に約10分間入れます。プローブのもう一方の端を流量計のアタッチメントに挿入して、流量の読み取りを容易にします。流量計をコンピュータに接続します。
- フローベースラインを記録する
- プローブを配置した後、血流を2分間監視して、流れが安定していることを確認します。次に、ベースラインとして2分間の流れを記録します(図3B)。流量計の詳細な説明については、Subramaniam et al.17を参照してください。
- 血流を記録するには、WinDAQソフトウェアを起動します。[ファイル]オプションをクリックし、[ 記録]をクリックします。新しいフォルダとファイルを作成し、録音を開始します。録音を停止するには、ファイルセクションの[ 停止 ]をクリックします。
メモ: WinDAQソフトウェアは、発行元から無料で入手できます https://www.dataq.com/products/windaq/。
- 怪我
- フローの記録を停止します。怪我の後も測定値が一貫しているように、プローブの位置を変更しないでください。
- ワイプ/ペーパータオルでその領域を完全に乾かします。
注:少量の残留液体でも、血管損傷を引き起こすために使用されるFeCl3溶液の濃度が変化する可能性があります。これは、結果が変動し、再現性に影響します。領域が完全に乾燥している場合、プローブは流量を測定できません。 - プラスチック製の計量ボートに、円形のろ紙(直径1 mm、直径1 mmのイヤーパンチでカット)を入れます。1 μLの6%FeCl3 溶液(dH2O製)をろ紙に加えます。
注意: ろ紙を使用する直前に、必ずFeCl3溶液を追加してください。紙を浸すのが早すぎると、FeCl3溶液が蒸発し、怪我の重症度が変わる可能性があります。 - 細かい鉗子を使用して、ろ紙を手に取り、プローブの上流の動脈、プラスチックでマークされた動脈の部分に置きます(図2D、E)。このプラスチックはマーカーとスペーサーとして機能します。負傷した領域に印を付け、周囲の湿った領域との接触を避けることでFeCl3 の偶発的な希釈を防ぎます。
注意: ろ紙がまっすぐで、挟まれたり、折りたたまれたりしていないことを確認してください。動脈に置いたら、ろ紙の位置を変えないでください。そうすることで、怪我の程度が変わります。 - ろ紙を置いた後、タイマーを起動して血流を記録します。3分後、紙を取り除き、損傷部位に生理食塩水を追加してFeCl3 を除去し、損傷プロセスを停止します。また、その領域をしっとりさせます。この段階で、血流は損傷前に記録されたベースラインレベルに戻るはずです。
- フローが元の記録の10%に減少するか、ゼロに達するまで、フローを監視および記録します。血栓が損傷部位に形成され始めると、着実に減少します(図3C)。この間のフローの大幅な変動に注意してください。
- 血栓の安定性を調べるには、有意かつ一貫した減少のたびに血流の急激な増加を記録します。これらのイベントは、不安定な血栓症による塞栓術として分類されます(図4D)。流量が一貫して減少した後、オペレーターは実験終了時に動脈の損傷を見ることができます(図2F、青い矢印/点線の楕円形)。
- 血管閉塞時間は、少なくとも1分間の血流の完全な停止として定義されます。閉塞性血栓が形成される時間を、ゼロ読み取り値または流量の有意な減少によって示されるように記録する。
- 30 分後に実験を終了します。モニタリングから30分以内に血栓が形成されない場合は、フローを記録し、記録を停止して、プローブを取り外します。
- 70%エタノールとブラシでプローブを洗浄し、残っている組織/髪の毛や破片を取り除きます。プローブを完全に乾かしてから、収納ボックスに入れてください。プローブを完全に乾かしてから、長期保管用の収納ボックスに入れてください。
- 頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。枝肉を枝肉廃棄袋に入れ、ラボの名前と日付のラベルを付けます。
2.FeCl3誘発損傷後のシリアルブロック顔面走査電子顕微鏡(SBF-SEM)研究のためのサンプルの収集と準備
注:提示されたEMプロトコルは、SBF-SEMのサンプル調製に適しています。このイメージング技術は、血餅中の血小板の三次元構造を研究する前例のない能力を提供します。この手法では、サンプルは一連の連続したブロックSEM画像として視覚化され、サンプルを進むにつれて生成されます。この調製の要点は、1)サンプルを重金属の事前埋め込みで染色する必要があります。2)プラスチックに埋め込まれたサンプルは、SEM内に取り付けるために適切にトリミングする必要があります(トリミングされたサンプルのビジュアルについては 図6 を参照してください)。埋め込み後の染色はSEM内では不可能です。EM分析のためにFeCl3誘発血管損傷からサンプルを収集する場合、手術を行う際には以下の変更を行う必要があります。提示されたFeCl3 手術プロトコルの変更は、あらゆる形態の電子顕微鏡にも適用可能である。麻酔条件と切開を行い、頸動脈を露出させる手順は、プロトコル1と同じです。
- 頸動脈を露出させた後、2本の手術糸(サイズ:0.1 mm)の間の領域を緩く囲んで損傷部位に印を付けます(図5A、B)。
- プローブを下糸から遠位の動脈の下に置きます(図5C)。
- プラスチック片を2本の糸の間の動脈の下に挿入して、FeCl3 損傷部位をマークします(図5C)。
- 怪我をする前に流量を測定して、基礎の流れに注意してください。これらの測定値は、サンプルを収集する段階を決定するために使用されます。
注:固定液(3%パラホルムアルデヒド/ PFA + 0.1%グルタルアルデヒド、どちらも1x PBSで製造)の準備ができており、RTになっていることを確認してください。 あるいは、生理食塩水バックグラウンドでの2.5%グルタルアルデヒドによる固定も使用できます。
注意: パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドはどちらも非常に有毒で刺激性があります。それらを取り扱うときは、手袋、アイシールド、およびマスクを使用して、露出から保護する必要があります。すべての固定液は有毒であり、固定手順はドラフト内で実行する必要があります。 - FeCl 3に浸したろ紙を動脈(8%FeCl 3を使用)に3分間置き、損傷を実行します(この時間も異なる場合があります)。3分後、ろ紙を取り除き、損傷部位に生理食塩水を加えて、余分な残留FeCl3を取り除きます。このステップは、損傷の程度が変動するのを防ぎ、プローブによる流量計数を容易にするために必要です(図5D)。
- フローの読み取り値を監視します。流量が初期値の50%を下回ったら、プローブを取り外します。その領域をすばやく乾かし、その領域に固定剤を追加して、損傷領域を外部に固定します。
- 速やかに損傷部位付近の動脈を鉗子で保持し、下糸の下流と上糸の上流を切断する。必要に応じて、他の人に片方の端を切るのを手伝ってもらってください。組織を採取したのと同じ向きでプラスチック組織培養皿に置き、固定液を数滴加えます。
注意: 動脈を切断するとすぐに広範囲の出血が発生するため、最初に切断する前に必ず動脈を保持してください。このシナリオでは、マウスは放血されています。マウスは放血と頸椎脱臼によって安楽死させます。 - メスを使用して、動脈の周りの余分な組織をきれいにします。血流の向きを記録するように注意してください。それをマークするには、一方の端を水平にカットし、もう一方の端を先細り/斜めにカットします(図5E)。
- サンプルを固定液(3%PFAおよび0.1%グルタルアルデヒド)でRTで1時間保持します。次に、サンプルを1%PFAで4°Cで保存し、湿氷上でEM分析のためにサンプル処理ラボに送ります。
注意: サンプルは凍結しないでください。 このサンプル収集方法の課題は次のとおりです。- 最初の読み取り値は最適ではないか、怪我の後に変動する可能性があります。これは、EM分析のために逮捕するために選択される傷害の程度に影響を与える可能性があります。この問題に対処するには、プローブを配置するさまざまな位置を試して最適な位置を決定した後、ベースラインの読み取り値を数分間記録してください。
- 分析のために動脈セクションの外部固定液と実際の切断を追加することによって損傷を阻止する時間は、血栓症の程度にばらつきを追加する可能性があります。外部で固定した後、サンプル収集中は迅速に行ってください。
- EM分析のために処理するサンプルを、湿った氷上で1%PFAで受け取ります。サンプルを氷上で0.1 Mのカコジル酸バッファーで3分間すすぎ、さらなる処理を開始します。
- サンプルを0.1 Mカコジル酸バッファー+ 2.5%グルタルアルデヒド+ 2 mM CaCl2で氷上で1時間固定します。
- 固定液を廃棄し、2 mM CaCl2 (5 x 3分)を含む冷たい0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーでサンプルを洗浄します(図6A)。
- サンプルをオスミウム溶液(3%フェロシアン化カリウム[K 4 C 6 N6Fe] + 0.3 Mカコジル酸緩衝液+ 4 mM CaCl 2を等量の4%四酸化オスミウム水溶液[OsO4;ddH2 O]と混合)で氷上で1時間固定します。
- サンプルが固定されている間に、ddH2O中の新鮮な1%トリクロロアセトアルデヒド水和物(TCH)溶液を作ります。 穏やかに混合しながら、溶液を60°Cで1時間インキュベートします。
- 固定後、サンプルをddH2OでRTで5 x 3分間洗浄します。
- サンプルをろ過した1%TCH溶液(ddH2O製)中でRTで20分間インキュベートします。
- RT(5 x 3分)でddH2Oでサンプルを洗浄します。
- サンプルをddH 2 O中の2%四酸化オスミウムにRTで30分間固定します。
- サンプルをddH2OでRTでそれぞれ5 x 3分間洗浄します。
- サンプルを1%酢酸ウラニル(水性)に入れ、4°Cで一晩インキュベートします。
- サンプルを室温でddH2Oでそれぞれ5 x 3分間洗浄し 、一括ウォル トンの鉛アスパラギン酸染色で処理します。
- 一括 ウォルトンの鉛アスパラギン酸染色3:
- ddH2O中の30 mM L-アスパラギン酸溶液を作る。
注意: アスパラギン酸は、pHを3.8に上げると、より早く溶解します。この原液は、冷蔵すれば1〜2ヶ月間安定です。 - アスパラギン酸ストック10 mLに20 mMの硝酸鉛溶液を作り、1 N KOHでpHを5.5に調整します。
- サンプルを60°Cの鉛アスパラギン酸溶液に30分間入れ、RTでddH2Oでそれぞれ3分間5回洗浄した後、サンプルを入れます。
- ddH2O中の30 mM L-アスパラギン酸溶液を作る。
- 段階的なエタノールシリーズで標本を脱水します。バルディビアプロトコル18による化学的脱水を使用してください。
- 次の各溶液でサンプルを洗浄して、サンプルを徐々に脱水します(図6B)。
25%エチルアルコールで3分間
50%エチルアルコールで3分間
75%エチルアルコールで3分間
95%エチルアルコールで3分間
100%エチルアルコールを10分間、この手順を2回繰り返します(合計3回の洗浄)。
- 次の各溶液でサンプルを洗浄して、サンプルを徐々に脱水します(図6B)。
- サンプルを100%プロピレンオキシド(PO)で10分間洗浄し、この手順を2回繰り返します(合計3回の洗浄)。
- DMP 30活性剤を含む50%/50%PO/樹脂中でRTで一晩インキュベートし、DMP30活性剤を含む100%アラルダイト502/埋め込み812/DDSAに48時間埋め込みます。
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Representative Results
データは一般に、閉塞までの時間、または完全に閉塞性の血栓を形成するのに必要な時間として提示されます。これらのデータは、Kaplan-Meier生存曲線(図4A)19、血流の停止時または実験終了時の終末血流を示すバー付きのドットプロット(図4B)、または折れ線グラフ(図4C)としてプロットできます。血栓安定性はこの技術を用いて研究することができる。ほとんどの場合、FeCl3損傷時に血栓が徐々に形成され、それが成長するにつれて血流は徐々に減少し、血管が完全に閉塞するとゼロに達する。場合によっては、数分間徐々に減少した後、血流が突然増加します。これは、成長する血栓の部分的な脱落として解釈され、塞栓術イベントと見なすことができます(図4D)。閉塞性血栓の形態(図7A)もこの方法を用いて研究することができる。
表1:FeCl3誘発血栓症モデルおよび溶液における潜在的な技術的課題。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図1:マウスでFeCl3誘発頸動脈血栓症を行うために必要な手術器具。 (a)1:ライカS8AP0顕微鏡及びスタンド。2:アルミホイルで覆われた小動物加熱パッド。(b)1:ガーゼスポンジ。2:26 G x 3/8針。3:1ミリリットルシリンジ。4:滅菌綿先端アプリケーター。5:黒編み絹縫合糸。6:外科用ブレード。7:ステンレス鋼のナイフのハンドル。8:市販の脱毛クリーム。9:イヤーパンチ。10:はさみを解剖する。11:細かいはさみ。12:外科用鉗子。13:マイクロ解剖鉗子。14:アイドレッシング鉗子。15:縫合糸結束鉗子。(C)可撓性領域(赤い矢印)と容器を保持するノッチ(黒い矢印)を備えた遷音速フロープローブ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:頸動脈の損傷を準備し、血管閉塞を測定するための外科的手順。 はさみと外科用鉗子を使用して、正中線セクションを作成し、組織をそっと引き離して(A)、その下の頸動脈を露出させます(B)。黒い矢印は血流の方向(B)を示す。頸動脈(C)を囲む周囲の組織をきれいにし、プラスチック紙(黒い矢印で示されている黄色のプラスチック)とプローブ(D)を置きます。FeCl3に浸したろ紙(赤い矢印で示す)を動脈(E)に置いて血管を傷つけます。用紙を取り除き、怪我を監視します。最後に、怪我は黄白色の縞として表示され、青い矢印(F)で示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:流量計を使用した血流読み出し。 頸動脈内の血流は、流量計(A)を用いて測定される。フローは、ファイルタブ(B)の記録機能を使用して記録されます。ベースラインフローは、損傷を行う前に比較的一定である必要があります(約0.8 mL / min、黒い矢印で示されています)(B)。.損傷後、血流は一様に減少し(開始値から約50%減少、約0.4 mL / min)、黒い矢印(C)で示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:FeCl3誘発頸動脈損傷モデルからの代表的なデータ提示。FeCl3誘発血管損傷からのデータを提示するために利用可能な様々な方法が示されている。Kaplan-Meier生存曲線は、各マウスの閉塞までの時間を示す。統計分析のためにログランクテストが実行されます。p ≤ 0.001 (A) である。実験終了時の血流は、棒グラフ(B)で表すこともできます。Bで表されるデータについて、対応のないt検定を0.001≤*** p実行した。誤差範囲はSD±平均値を表します。1匹の動物から損傷後に収集されたドップラーフローデータは、折れ線グラフ(C)で提示できます。様々な時点での1匹のマウスにおける血流の持続的な漸進的減少後の血流の突然の増加による潜在的な塞栓イベントの例(D)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:電子顕微鏡研究のためのFeCl3誘発傷害血餅の収集。 動脈を露出させた後(A)、糸を緩く結んで損傷部位に印を付け(B)、プラスチック紙を動脈の下に置き、その下流のプローブを置きます(C)。怪我をし、損傷を監視します(D)。本文で説明されているように組織を収集し、サンプルを片側をまっすぐに、反対側を斜めにきれいにして切断し、血流の方向を示します(黒い矢印は血流の方向を示し、赤い輪郭は損傷領域を示します)(E)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:電子顕微鏡用試料の固定後処理と実装。 サンプルは、処理ステップ(A)の間にマイクロ遠心チューブで洗浄され、エタノール濃度を上げて連続脱水されます(B)。加工後、樹脂(C)に埋め込まれ、ブロックに血流の方向(D)が印され、スライスに切断されてイメージングされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:FeCl3介在頸動脈損傷後の完全閉塞性血栓の近位および遠位領域の代表的な電子顕微鏡写真。 (A)閉塞した動脈の完全な横断面で、損傷部位の近位にあり、下に挿入図があり、より高い倍率で構造を示しています(a:2x、およびa':4x)。損傷領域は、A.スケールバー:100μmの矢印で示されています。 (B)閉塞した動脈の完全な横断面で、損傷部位の遠位にあり、下に挿入図があり、より高い倍率(b:2x、およびb':4x)で構造を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:動物モデル、FeCl3損傷部位、FeCl3濃度、損傷方法、および血栓症時間の変動の簡単な調査。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
血栓症を誘発するための血管系へのFeCl3の局所適用は広く使用されている技術であり、さまざまな血小板受容体、リガンドシグナル伝達経路、およびそれらの阻害剤の役割を確立するのに役立ちました20、21、22、23。FeCl3が血栓症を引き起こすメカニズムは多面的です。以前は、内皮露出が血栓症の原因と考えられていましたが、近年、このプロセスにおける赤血球と血漿タンパク質の役割が複数の報告で示唆されています24,25,26,27。
このプロトコルの最も重要なステップは、最適な流れを得るためのドップラープローブの配置、ろ紙の配置、およびサンプルを回収してすぐに固定するための怪我の迅速な終了です。これらの手順での事故の結果と対処方法を表 1 に示します。シンプルで感度は高いですが、動物モデル、動物の背景、血管損傷部位、FeCl 3の濃度、FeCl3の適用方法、適用期間、動物の年齢と性別、および使用する麻酔の種類によっては、採用が困難な場合があります。これらの違いは、文献で報告されているC57BL/6Jの血栓症時間の比較的広い範囲を説明している可能性があります(補足表1)27、28、29、30、31、32。このプロトコルは、血管系のサイズが視覚化および手術が容易であるため、実験に8〜10週齢のマウスを使用することを提案しています。一部のグループは、6週齢33の若いマウスを使用しています。さまざまな動物群間で一貫性のある再現性のある比較を行うために、マウスの年齢を一致させることが不可欠です。記載された麻酔は、トリブロモエタノールが、容易に入手可能であり、投与が容易であり、必要な期間麻酔面を維持し、そして必要な投与量が再現可能であるので好ましい。イソフルランや、トリブロモエタノールと3級アミルアルコールとキシラジンおよび/またはアセプロマジンとのさまざまな組み合わせなど、他の多くの麻酔オプションが利用可能です。動物の心拍数や血圧に悪影響を与えることなく鎮静を達成するために最適な用量を使用することが不可欠です。実験全体を通して同じ麻酔方法を使用すると、血栓症時間に対する潜在的な複合効果が防止されます。
この原稿では、データのばらつきを最小限に抑え、再現性を高めるための詳細な手順を示しています。この手術中に発生する可能性のあるいくつかの問題をトラブルシューティングするための表が提供されています(表1)。さらに、この原稿は、閉塞性血栓の構造と形態を研究するために、損傷の終わりにサンプルを収集する方法を提案しています(図7)。EMの解像度は、成長しているトンブス中の血小板の25 、およびそれらが血管損傷の近位および遠位の両方の他の血小板および内皮とどのように相互作用するかを以前に可能であったよりも優れた視覚化を提供します。また、損傷部位での血小板のさまざまな活性化段階を研究するためにも使用できます。
この技術のもう一つの重要な利点は、オペレータがベースライン測定値を使用して、血栓サンプルが収集される段階を決定できることです。これらはおおよそのタイミングであり、損傷/血栓症の正確な程度を示すものではないことに注意してください。基礎測定値はプローブの最適な配置に依存し、正しく配置されていない場合、測定値は部分的な流れのみを記録する可能性があります。これにより、終了時間の誤った解釈、ひいては収集されたサンプルの形態につながります。一貫した再現性のある結果を得るには、損傷プロセスの迅速な終了とサンプルの即時固定が必要です。
このプロトコルは、閉塞性血栓症の評価に必要な最小限の設定を提示します。顕微鏡法の進歩に伴い、いくつかのグループはこの技術を使用して、血小板/内皮細胞および/または血小板放出物(PF4、P-セレクチン、フィブリンなど)を蛍光標識し、in vivo血栓症の特定の側面を視覚化し、その動態を決定しました34,35。説明したように、ここでの方法は、血栓不安定性を示す塞栓術イベントについて報告することができる(図4D)。
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Disclosures
著者らは、この研究に関連する利益相反はありません。
ORCID プロファイル: SJ: 0000-0001-6925-2116;SWW:00000-0001-5577-0473。
Acknowledgments
著者は、この原稿を注意深く熟読してくれたホワイトハート研究所のメンバーに感謝します。この作業は、NIH、NHLBI(HL56652、HL138179、およびHL150818)からの助成金、およびSWWへの退役軍人省功労賞、BSへのR01HL 155519、およびR.D.L.へのNIBIB学内プログラム助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
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