Summary
本プロトコルは、前臨床設定における新しい治療法の効率を評価するための心血管系の機能的能力を評価するための大型動物運動試験モデルを記載する。これは、臨床運動テストに匹敵します。
Abstract
治療の進歩にもかかわらず、心血管疾患は依然として世界中の死亡率と罹患率の最大の原因の1つです。遺伝子治療ベースの治療的血管新生は、最適な薬理学的療法および侵襲的処置にもかかわらず、重大な症状を有する患者を治療するための有望なアプローチである。しかし、多くの有望な心血管遺伝子治療技術は、臨床試験で期待を達成できませんでした。1つの説明は、有効性を測定するために使用される前臨床エンドポイントと臨床エンドポイントの不一致です。動物モデルでは、通常、組織学的切片から計算された毛細血管の数や面積など、簡単に定量化できるエンドポイントに重点が置かれてきました。死亡率と罹患率とは別に、臨床試験のエンドポイントは、運動耐容能や生活の質などの主観的なものです。ただし、前臨床エンドポイントと臨床エンドポイントは、適用された治療のさまざまな側面を測定する可能性があります。それにもかかわらず、両方のタイプのエンドポイントは、成功した治療アプローチを開発するために必要です。診療所では、主な目標は常に患者の症状を緩和し、予後と生活の質を改善することです。前臨床試験からより良い予測データを得るには、エンドポイント測定値を臨床試験の測定値とよりよく一致させる必要があります。ここでは、ブタにおける臨床的に関連するトレッドミル運動テストのプロトコルを紹介します。この研究は、(1)遺伝子治療やその他の新しい治療法の安全性と機能的有効性を評価するために使用できる豚の信頼性の高い運動テストを提供することを目的としています、および(2)前臨床試験と臨床試験の間のエンドポイントをよりよく一致させます。
Introduction
慢性心血管疾患は、世界中の死亡率と罹患率の重要な原因です1,2。現在の治療法は大多数の患者に効果的ですが、多くの患者は、例えばびまん性慢性疾患や併存疾患のために、現在の治療法の恩恵を受けることができません。また、一部の患者では、利用可能な治療法によって心臓症状が緩和されず、最適な内科的治療にもかかわらず心血管疾患が進行します3。したがって、重篤な心血管疾患に対する新しい治療選択肢を開発する必要があることは明らかです。
過去数年間で、新しい分子経路とこれらの標的を操作する方法が発見され、遺伝子治療、細胞治療、およびその他の新しい治療法が重篤な心血管疾患を治療するための現実的な選択肢となっています4。しかし、有望な前臨床結果の後、多くの心血管アプリケーションは臨床試験での期待に応えることができませんでした。臨床試験の有効性が低いにもかかわらず、いくつかの試験では、新規治療法の良好な安全性プロファイルが確立されています5、6、7、8、9。したがって、新しい心血管療法を患者に提供するには、臨床効果を予測できる前臨床試験における改善されたアプローチと、より良い前臨床モデル、研究設定、および前臨床試験のエンドポイントが必要になります。
動物モデルでは、通常、組織学的切片から計算された毛細血管の数と面積、または安静時および薬理学的ストレス下での左心室イメージングからのパラメーターなど、簡単に定量化できるエンドポイントに重点が置かれてきました。臨床試験では、運動耐容能や症状の緩和など、多くのエンドポイントがより主観的でした4。したがって、前臨床試験および臨床試験のエンドポイントは、適用された治療のさまざまな側面を測定する可能性があります。たとえば、血管量の増加は、灌流、心機能、または運動耐容能の向上と必ずしも相関するわけではありません。それにもかかわらず、両方のタイプのエンドポイントは、成功した治療アプローチを開発するために必要です10。それでも、主な目標は常に症状を緩和し、患者の予後と生活の質を改善することです。これを達成するには、エンドポイント測定値を前臨床試験と臨床試験の間でよりよく一致させる必要があります4。
心肺フィットネスは、持続的な身体活動中に酸素を供給する循環器系および呼吸器系の能力を反映しているため、個人の機能的能力を定量化します。機能的能力は、心血管および全死因死亡のリスクに対する強力な独立した予測因子であるため、重要な予後マーカーです11。心肺フィットネスの改善は、死亡リスクの低下と関連しています12。運動テストは、心血管疾患における有酸素運動能力と治療反応を評価するのに適しています。可用性に応じて、テストは自転車エルゴメーターまたはトレッドミルで実行されます。通常、1 分あたりのワークロードの段階的な増加が使用され、急激な増加は回避されます。これは線形生理学的反応をもたらす。運動テストで最も重要な変数には、総運動時間、達成された代謝当量(MET)、心拍数、およびQRS複合体(Q、R、およびS波)とT波(STセグメント)の間の心電図(ECG)ラインの変化が含まれます。臨床ストレステストは低コストで簡単にアクセスできます13.これらの理由から、6分間の歩行テストなどのストレステストは診療所で広く使用されており、新しい治療法の前臨床評価にも使用する必要があります。
私たちの知る限り、遺伝子治療やその他の新しい治療法の機能的有効性を評価するための十分に記述された大型動物モデルはありません。したがって、臨床的に関連する運動テストは、前臨床設定におけるこれらの新しい治療法の有効性を評価するための優れた視点を提供します。
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Protocol
すべての実験は、東フィンランド大学の動物実験委員会によって承認されています。このプロトコルは、心臓病の新しい治療法の安全性と有効性を評価するための豚の臨床的に関連するトレッドミル運動テストについて説明しています。本研究では、体重25〜80 kgの雌豚を使用しました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。
1.ランニングトラックのセットアップ
- 動物が一方向にしか移動できないようにランニングトラックを設定します。ゲートとハッチを使用して、動物が戻らないようにします。ランニングトラックの平面図を図 1に示し、ランニングトラックの例を 図2に示します。
- トレッドミル( 材料表を参照)に傾斜を変更できる十分なスペースがあることを確認してください。
- ランニング中に動物が回転しないように、トレッドミルの幅が調整可能であることを確認してください。
- 透明なプラスチックを使用して、トレッドミルの前壁を作ります。これにより、動物がトレッドミルから逃げるのを防ぎますが、それでも動物は壁を通して見ることができます。
注:私たちの経験では、壁の反対側に仲間の豚がいるのを見ると、豚は走る意欲が高まることが示唆されているため、動物が正面の壁を通して見ることができることが不可欠です。 - トレッドミルの隣にECGモニターと除細動器( 材料表を参照)を置きます。
注:致命的な不整脈は、特にブタが心筋虚血を患っている場合、ストレステスト中に発生する可能性があります14,15,16。 - ランニングトラックに、動物がランニング後に飲んだり涼んだりできる給水ポイントが含まれていることを確認してください。
2.試験前のブタの馴化期間
- 実験を開始する前に、動物を2週間収容します。
- 順応の最初の週に、動物がランニングトラックを除いて、ハンドラーと新しい住居環境に慣れていることを確認してください。
- 順応期間の第2週の間に、動物がランニングトラックに慣れていることを確認してください。
- 動物がランニングトラックに慣れるように慣れ始めます。まず、動物がトラック上を自由に歩き、環境を探索できるように、すべてのゲートを開いたままにします。
- 動物がトラックに慣れたら、トレッドミルをオンにして、動物を一度に7分などの短時間走らせます。実行時間の長さは毎日延長する必要があります。
注:順応期間中に動物に報酬を与えることを忘れないでください。たとえば、豚には無塩ポップコーンが与えられました。
3.運動テスト
注:豚は、運動テストの少なくとも2時間前に絶食するか、実行前にごく一部の食物のみを与える必要があります。
- トレッドミルの電源を入れ、傾斜を5%〜10%に設定します。
- 動物がトレッドミルに乗ったらすぐに、時速2kmの開始速度でトレッドミルを始動します。
- 5 km/h に達するまで、60 秒ごとに速度を 0.5 km/h ずつ上げます。総実行時間は15分です。
- 動物が最高速度でずっと走ることができない場合は、以下の手順を実行してください。
- 豚が選択した速度ほど速く走っていない場合は、速度を落とさずに速く走る必要があるという感覚を動物に与える可能性があるため、後ろからそっと押します。
- 動物を最大3回そっと押してみてください。その後、豚が速度を処理できるようになるまで、一度に0.5 km / h速度を落とします。時速2km未満まで減速しないでください。
- 動物が低速でも走ることを拒否した場合は、トレッドミルの電源を切り、テストを中止してください。
4.運動テスト中のECGモニタリング
- ECG電極( 材料表を参照)を、肩甲骨や胸部など、ランニング中の動きが最小限の解剖学的場所に配置します。
注意: 運動テスト用に設計されたECG電極を使用して、皮膚への接着性を向上させます。ECG電極が配置される領域から髪を剃ることを忘れないでください。 - ランニング中の心拍数の変化を記録します。
注:私たちの経験では、STセグメント分析は、動きやその他のアーチファクトのために複雑になることがよくあります。リズムモニタリングは、埋め込み型ループレコーダーまたはペースメーカーを使用して行うこともできます。
5. データ収集
- 速度が変更されるたびに、走行距離、合計時間、速度を記録します。
注意: 最新のトレッドミルは他の多くのデータを収集する可能性があるため、機器の可能性を最大限に活用するには、トレッドミルのマニュアルをよく理解することが不可欠です。 - 足を引きずるなど、動物の行動に起こりうる変化に注意してください。
注:必要に応じて、獣医師に連絡して、動物が必要な鎮痛を受けていることを確認してください。完全に回復するまで、将来の運動から動物を取り除きます。
6.手続き後のケア
- 動物が給水ポイントにアクセスできることを確認してください。
- たとえば、おやつやおもちゃで動物に報酬を与えます。
- 可能性のある悪影響について、実行後30分間動物を監視します。
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Representative Results
このプロトコルで成功するには、大型動物を使った経験が必要です。研究者は、動物が倦怠感ややる気の欠如のために走るのをやめるかどうかを評価できる必要があります。速度と距離を記録することは、通常、モチベーションのない動物が完全に走るのをやめるのに対し、疲れた動物は速度を落とした後も走り続けるので、これを評価するのに役立つかもしれません(図3)。必要に応じて、結果が信頼できないと思われる場合は、翌日にプロトコルを繰り返すことができます。
アデノ随伴ウイルス(AAV)処理動物の代表的なタイムラインを 図4に示します。タイムラインは、特に犠牲の時点に関して、研究の設定によって異なる場合があります。実験を計画するときは、順応期間に注意してください。
結果は、心臓エコーなどの他の臓器構造および機能測定値と比較して、運動耐容能がこれらの他の測定値とどのように関連しているかを確認できます。例えば、走行距離の変化は駆出率の変化と相関する。駆出率が低いと、動物は運動テスト中ずっと全速力で走ることができません(図5)。分析された変数は、試験設定によって異なる場合があります。このプロトコルにより、総走行距離、速度変動、MET、心拍数変動、および不整脈の比較が可能になります。
ECGは運動テスト中に記録されます(図6)。STセグメントの解析はアーチファクトにより困難である。心拍数間隔の変化は、運動テスト全体を通してECGから測定できます。
図1:ランニングトラックの平面図。走っていない動物の場所は(A)でマークされています。一度に1匹の動物が廊下(B)を通ってトレッドミル[ゾーン(C)]に案内されます。ゾーン(A)と(B)の間のゲートは、一度に1匹の動物だけがランニングトラックに行き、他の動物がゾーン(A)にとどまるように閉じられています。トレッドミルの動物はゾーン(A)の他の動物を見ることができ、それが彼らが走る動機となるので、他の動物がゾーン(A)にとどまることが不可欠です。トレッドミルとゾーン(B)の間のゲートは、動物がトレッドミルから後退できないように閉じられています。トレッドミルはゾーン(D)から操作され、動物は実行後にゾーン(D)を介してゾーン(A)に戻されます。この場合、ゾーン(A)には、動物が飲んで走った後に涼むことができる給水ポイントが設置されています。記号:黒い矢印は回転方向を示し、四分円はゲートを示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ランニングトラックの代表的な画像 。 (A)動物にとって利用可能なルートが1つだけであることの重要性。(B)トレッドミルは、ランニング中に動物が回転するのを防ぐために幅を調整できる必要があります。(C)走っている動物に加えて、別の動物のための閉鎖空間。動物は、自分の種のメンバーを見ると、走る意欲が高まります。(D)ストレステスト後に動物が涼んで飲むことができる動物の給水ポイントの例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:走行距離と速度 。 (A)健康な豚4頭の総走行距離からの代表的なデータ。試験動物の平均総走行距離は970mであり、総距離の標準偏差は80mであった。 (B)ブタ間の速度変動に関するデータ。豚が速度を処理できるようになるまで、速度は0.5 km / h間隔で減速されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:代表的なタイムライン。 時点は研究によって異なる場合があることに注意してください。しかし、馴化期間があるため、実験開始の3週間前に動物が実験動物センターに到着する必要があることは注目に値します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:走行距離と突出率の変化との相関。 走行距離の変化と突出率の変化との相関。静止時の駆出率は、複葉機シンポン法により測定した。ベースラインからの駆出率の変化は、ペースメーカー誘発性心不全のブタの走行距離の変化と相関しており、r = 0.2831、p = 0.0284、およびR2 = 0.0801です。rおよびR2が低いにもかかわらず、左室駆出率(LVEF%)の変化は走行距離に影響を与える傾向がある。いくつかの要因が測定変数に影響を与え、結果に影響を与えることに注意することが重要です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:健康なブタの代表的なECGテープ。 上部のECGパネルには、運動テストの開始から3分後のECGが表示されます。下のECGストリップは、10分間走った後のECGを示しています。ECGは、試験動物の心拍数の違いを評価するために使用することができる。上部のECGパネルの心拍数は毎分176拍で、下部のECGストリップの心拍数は毎分250拍です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この大型動物運動試験は、診療所で使用される試験を模倣し、前臨床試験と臨床試験の間のエンドポイントのギャップを縮小します。閉塞性動脈硬化症、心不全、虚血性心疾患などの重篤な循環器疾患に対する新規治療法の有効性評価に応用できます。このプロトコルで適用される時点は、テストされた治療によって異なる場合があります。このプロトコルは、大型動物での長年の経験に基づいて標準化されており、心血管遺伝子治療やその他の新しい治療アプローチの安全性と有効性を評価するために使用できます。
豚の心臓と心血管系は、人間の生理学、解剖学、および機能に似ています。したがって、ブタは、心血管疾患のメカニズムおよび治療手順をモデル化するためにしばしば使用されてきた17。私たちのブタ研究の追跡期間は最大12か月でした18;しかし、動物が長い追跡期間中に成長するにつれて、動物の取り扱いはますます困難になります。
この方法は、テストの成功に不可欠であり、後で修正することは不可能です。まず、豚は走るモチベーションに個人差があります。動物に走るように動機付けさせ、テスト全体を通して十分なモチベーションを維持することが不可欠です。これにより、すべての時点が比較可能であることが保証されます。豚のランニングモチベーションを維持するには、個々の行動特性に関する特定の知識が必要です。動物は、運動テストの前にトレッドミルとテスト環境に慣れる必要があります。豚はトレッドミルに行くように教えられ、彼らの成功したパフォーマンスは報われます。ランニングのモチベーションを高める別の方法は、他の実験動物をランナーの視野に入れておくことです。
さまざまな脚の問題など、典型的な解剖学的欠陥を回避することが重要です。最も一般的な解剖学的欠陥は、蹄病、先天性四肢奇形、および裂傷、肩甲骨損傷、骨折、創傷などの事故によって引き起こされる問題です。これらは主に生息地、事故、遺伝的要因、および摂食の異常によるものです19。足の衰弱は協調性のない歩行につながり、運動テストへの参加を不可能にします。また、研究中に脚の脱力感が現れた場合は、動物を試験から除外する必要があります。脚の問題は、無傷の脚構造を持つ豚を選ぶことで回避できます。研究中、豚舎の状態を良好にすることで脚の怪我を防ぐことができます。硬くて腐食性のある表面は避け、一般的な衛生状態を維持する必要があります。豚は足に負担をかけるため、体重が急激に増えないように適度に給餌する必要があります。さらに、豚は事故を避けるために慎重に囲いに入れなければならず、咀嚼が他の豚に向けられないように、おもちゃなどの十分な刺激を受ける必要があります。
運動テスト中、ECGは3誘導ECGまたは埋め込み型ループレコーダーで記録されました。12誘導ECGほど正確ではありませんが、不整脈や心拍数などの複数の変数を評価できます。いくつかの種類のエラーや障害がECGを改ざんする可能性があります。たとえば、電極が正しく接続されていない、皮膚と電極の接触不良、骨格筋の収縮がエラーを引き起こす可能性があります。電極は、テスト全体を通してしっかりと固定されている必要があります。ランニング中に皮膚が熱くなり、汗をかくため、これは困難です。皮膚と電極との接触は、髪を剃り、消毒し、死んだ皮膚細胞を取り除くことによって改善することができます。また、筋肉の動きは、ECGに影響を与えるアーティファクトを引き起こします13。これは、STセグメントの解釈に挑戦する可能性があります。さらに、ECGリードはランニングを妨げる可能性があります。ただし、これらの問題は、ECGリードを皮膚にしっかりと叩くことで軽減できます。ECGは、埋め込み型ループレコーダーまたはペースメーカーに登録することもできます。埋め込み型ループレコーダーを使用すると、3誘導ECGの使用に伴う多くの問題が解決されます。ただし、埋め込み型ループレコーダーの設置は、感染などのリスクを伴う侵襲的な操作です。
研究者は、手順の全体的な安全性を確保するために、テスト全体を通して動物の行動を観察する必要があります。たとえば、倦怠感、重度の倦怠感、吐き気、意識喪失、重度の呼吸困難、またはチアノーゼ皮膚は、運動テストを終了する理由です。また、研究者は不整脈などのECGの変化を観察する必要があります。しかし、十分な訓練を受けた人員と大型動物での十分な経験により、現在の運動プロトコルを前臨床試験で日常的に利用して、患者への臨床的利益に関する新しい治療アプローチの臨床的移行をより成功させる臨床的に関連するデータを生成することができます。
Pooleら20 は、心血管研究のための動物の運動とトレーニングプロトコルのガイドラインを公開しています。これらのプロトコルでは、豚はウォームアップ後約30分間トレッドミルで運動します。この30分間の間、試験動物の目標心拍数ゾーンは、最大心拍数の65%〜75%である。心拍数は、トレッドミルの速度または傾斜を変更することによって変更されます。この原稿で提示されたPooleらのプロトコルと15分間の運動テストには、順応期間、トレッドミルの要件、選択された試験動物の体重、運動後の動物への報酬による積極的な強化など、複数の類似点があります。どちらのプロトコルでも、試験動物はトレッドミルの容量を超えて成長し、追跡時間を制限する可能性があります。
Pooleらによって記述されたプロトコルとこの原稿で提示された運動テストの主な違いは、テストの目的です。Pooleらによって記述されたプロトコルは、ヒトで認められた古典的なトレーニング適応を引き出すように設計されています。したがって、中程度の強度の運動に焦点を当てていますが、15分間の運動テスト方法は、心肺フィットネスをより適切に評価するためにほぼ最大限の努力をすることを目的としています。これは、主観的な運動レベルが最大心拍数13の約90%である場合に達成される。15分間の運動テストは、最大に近づくまで運動レベルを徐々に上げることにより、クリニックで使用されるテストを模倣します。プロトコールの目的の違いにより、試験動物の運動頻度は異なります。Pooleらは、ブタが週に4回まで走って、運動によって引き起こされるより良い心血管適応を達成することができると説明しています。15分間の運動テストは、遺伝子治療やその他の新しい治療法の機能的有効性を評価するため、必要な頻度が大幅に低く、治療の要件によって異なります。これらの要件の例を 図 4 に示します。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者は、動物作業への協力について、国立実験動物センターのMinna Törrönen、Riikka Venäläinen、Heikki Karhunen、Inkeri Niemiに感謝します。この研究は、Finnish Academy、ERC、およびCardioReGenix EU Horizon助成金の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Defibrillator | Zoll M series | TO9K116790 | All portable defribrillators will work |
| Defibrillator pads | Philips | M3713A | All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator |
| ECG electrodes | Several providers | Prefer ECG electrodes designed for exercise tests | |
| Loop recorder | Abbott Oy | DM3500 | Optional for rhythm monitoring |
| Patient monitor | Schiller Argus LCM Plus | 7,80,05,935 | All portable ecg monitors will work |
| Pigs | Emolandia Oy | ||
| Treadmill | NordicTrack | All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test. The treadmill should be as long and wide as possible. | |
| Ultrasound system | Philips EPIQ 7 ultrasound | ||
| Various building materials | Several providers | For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2 | |
| Various treats for the animals |
References
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