Summary
En procedur för att studera dynamiken i mitokondriellt DNA (mtDNA) metabolism i celler med hjälp av ett multi-well plattformat och automatiserad immunofluorescensavbildning för att detektera och kvantifiera mtDNA-syntes och distribution beskrivs. Detta kan vidare användas för att undersöka effekterna av olika hämmare, cellulära påfrestningar och gendämpning på mtDNA-metabolism.
Abstract
De allra flesta cellulära processer kräver en kontinuerlig tillförsel av energi, vars vanligaste bärare är ATP-molekylen. Eukaryota celler producerar det mesta av sin ATP i mitokondrierna genom oxidativ fosforylering. Mitokondrier är unika organeller eftersom de har sitt eget genom som replikeras och överförs till nästa generation av celler. I motsats till kärngenomet finns det flera kopior av mitokondriellt genom i cellen. Den detaljerade studien av mekanismerna som är ansvariga för replikation, reparation och underhåll av mitokondriellt genom är avgörande för att förstå hur mitokondrier och hela celler fungerar korrekt under både normala och sjukdomsförhållanden. Här presenteras en metod som möjliggör kvantifiering av syntes och distribution av mitokondriellt DNA (mtDNA) i humana celler odlade in vitro . Detta tillvägagångssätt är baserat på immunofluorescensdetektion av aktivt syntetiserade DNA-molekyler märkta med 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) inkorporering och samtidig detektion av alla mtDNA-molekyler med anti-DNA-antikroppar. Dessutom visualiseras mitokondrierna med specifika färgämnen eller antikroppar. Odlingen av celler i ett flerbrunnsformat och användningen av ett automatiserat fluorescensmikroskop gör det lättare att studera dynamiken i mtDNA och mitokondriernas morfologi under olika experimentella förhållanden på relativt kort tid.
Introduction
För de flesta eukaryota celler är mitokondrier viktiga organeller, eftersom de spelar en avgörande roll i många cellulära processer. Först och främst är mitokondrier de viktigaste energileverantörerna av celler1. Mitokondrier är också involverade i reglering av cellulär homeostas (till exempel intracellulär redox2 och kalciumbalansen3), cellsignalering 4,5, apoptos6, syntesen av olika biokemiska föreningar 7,8 och det medfödda immunsvaret9. Mitokondriell dysfunktion är förknippad med olika patologiska tillstånd och mänskliga sjukdomar10.
Mitokondriernas funktion beror på den genetiska informationen som finns i två separata genomer: kärn- och mitokondriella genomer. Det mitokondriella genomet kodar för ett litet antal gener jämfört med kärngenomet, men alla mtDNA-kodade gener är väsentliga för mänskligt liv. Det mitokondriella proteinmaskineri som krävs för att upprätthålla mtDNA kodas av nDNA. De grundläggande komponenterna i mitokondriell replisom, liksom vissa mitokondriella biogenesfaktorer, har redan identifierats (granskad i tidigare forskning11,12). Mitokondriell DNA-replikation och underhållsmekanismer är dock fortfarande långt ifrån förstådda. Till skillnad från nDNA finns det mitokondriella genomet i flera kopior, vilket ger ett extra lager för att reglera mitokondriellt genuttryck. Mycket mindre är för närvarande känt om distribution och segregering av mtDNA inom organeller, i vilken utsträckning dessa processer regleras, och om de är, vilka proteiner som är involverade13. Segregationsmönstret är avgörande när celler innehåller en blandad population av vildtyp och muterat mtDNA. Deras ojämna fördelning kan leda till generering av celler med en skadlig mängd muterat mtDNA.
Hittills har de proteinfaktorer som är nödvändiga för underhåll av mtDNA identifierats huvudsakligen genom biokemiska metoder, bioinformatiska analyser eller genom sjukdomsassocierade studier. För att säkerställa en hög chans att identifiera faktorer som tidigare undgått identifiering beskrivs i detta arbete en annan strategi. Metoden är baserad på märkning av mtDNA under replikation eller reparation med 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU), en nukleosidanalog av tymidin. BrdU införlivas lätt i begynnande DNA-strängar under DNA-syntesen och används i allmänhet för att övervaka replikationen av kärn-DNA14. Proceduren som utvecklats här har dock optimerats för att detektera BrdU införlivad i mtDNA med hjälp av immunofluorescens av anti-BrdU-antikroppar.
Tillvägagångssättet möjliggör kvantifiering med hög genomströmning av mtDNA-syntes och distribution i humana celler odlade in vitro. En strategi med hög genomströmning är nödvändig för att genomföra tester under olika experimentella förhållanden på relativt kort tid; Därför föreslås det i protokollet att använda ett flerbrunnsformat för cellodling och automatiserad fluorescensmikroskopi för avbildning. Protokollet inkluderar transfektion av humana HeLa-celler med ett siRNA-bibliotek och efterföljande övervakning av mtDNA-replikation eller reparation med hjälp av metabolisk märkning av nyligen syntetiserat DNA med BrdU. Detta tillvägagångssätt kombineras med immunfärgning av DNA med hjälp av anti-DNA-antikroppar. Båda parametrarna analyseras med kvantitativ fluorescensmikroskopi. Dessutom visualiseras mitokondrier med ett specifikt färgämne. För att demonstrera protokollets specificitet testades BrdU-färgning på celler utan mtDNA (rho0-celler), på HeLa-celler vid nedtystning av välkända mtDNA-underhållsfaktorer och på HeLa-celler efter behandling med en mtDNA-replikationshämmare. mtDNA-nivåerna mättes också med en oberoende metod, nämligen qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av siRNA-blandningen
- En dag före experimentets början, fröceller (t.ex. HeLa) på en 100 mm skål så att de når 70% -90% sammanflöde nästa dag.
Anmärkning: Alla operationer måste utföras under sterila förhållanden i en laminär flödeskammare. - Bered lämplig mängd siRNA utspätt till en koncentration av 140 nM i Opti-MEM-medium (se materialtabell). En 96-brunnsplatta kan användas som reservoar.
- Tillsätt 5 μL av siRNA-lösningen (eller Opti-MEM-mediet för kontrollproverna) till varje brunn i en svart 384-brunns cellodlingsmikroplatta.
OBS: Beroende på antalet testade siRNA-prover kan en elektronisk eller flerkanalig pipett användas. - Bered lämplig mängd RNAiMAX-transfektionsreagenslösning (se materialtabell) i Opti-MEM-medium. Tillsätt 1 μl RNAiMAX för varje 100 μl medium.
- Tillsätt 10 μl transfektionsreagenslösning till varje brunn på 384-brunnsplattan. Det bekvämaste och snabbaste sättet att göra detta är med en reagensdispenser.
- Inkubera siRNA med transfektionsreagenset i 30 minuter vid rumstemperatur.
2. Beredning av celler för transfektion
- Under inkubationen (steg 1.6), aspirera mediet med hjälp av en suganordning (se materialförteckning) och tvätta cellerna med 3 ml PBS.
- Tillsätt 1,5 ml trypsin utspätt 1:2 i PBS och inkubera cellerna vid 37 °C i 10 minuter.
- Kontrollera om cellerna har lossnat; om så är fallet, tillsätt 3 ml DMEM-medium med 10% FBS. Suspendera cellerna noggrant och överför dem till ett 15 ml rör. Ta minst 150 μl av suspensionen och räkna cellerna i en cellräkningskammare (se Materialförteckning).
- Bered en cellsuspension i lämplig koncentration (35 000/ml för HeLa-linjen) i DMEM-medium med 10 % FBS, penicillin och streptomycin.
3. Celltransfektion
- Tillsätt 20 μl cellsuspension till varje brunn på 384-brunnsplattan med hjälp av reagensdispensern. Detta kommer att resultera i 700 celler sådda per brunn.
- Inkubera cellerna i 1 timme vid rumstemperatur och placera dem sedan i inkubatorn i 72 timmar (37 °C och 5 %CO2).
4. BrdU-införlivande
- Bered en 90 μM lösning av BrdU (se materialförteckning) i DMEM-medium med 10% FBS.
- Vid 56 timmar efter siRNA-transfektionen (16 timmar före cellfixering), tillsätt 10 μL 90 μM BrdU-lösning till varje brunn på 384-brunnsplattan (den slutliga BrdU-koncentrationen är 20 μM).
OBS: Åtgärden bör utföras så snabbt som möjligt; Därför är det bäst att använda en reagensdispenser, elektronisk pipett eller pipett med flera dispenser. Kom ihåg att förbereda kontrollbrunnar utan tillsats av BrdU. - Inkubera cellerna i 16 timmar (37 °C och 5 %CO2).
5. Märkning av mitokondrier
- Bered en 20 μM lösning av BrdU i DMEM med 10% FBS och tillsätt den mitokondrier som spårar färglösningen (se materialtabell) till en koncentration av 1,1 μM.
- Vid 15 timmar efter starten av BrdU-inkorporering (1 h före cellfixering), tillsätt 10 μL av mitokondriernas spårningsfärglösning (se materialtabell) till varje brunn på 384-brunnsplattan (den slutliga färgämneskoncentrationen är 200 nM).
OBS: Använd en reagensdispenser, elektronisk pipett eller pipett med flera dispensrar. Kom ihåg att behålla kontrollbrunnar utan tillsats av BrdU men med tillsats av mitokondriernas spårningsfärgämne. - Inkubera cellerna i 1 timme (37 °C och 5 %CO2).
6. Cellfixering
OBS: All tvätt utförs mest bekvämt med en mikroplattbricka, medan tillsatsen av reagens utförs snabbast med en reagensdispenser.
- Använd brickan på mikroplattan (se Materialtabell) och skölj varje brunn två gånger med 100 μL PBS. Efter den andra tvätten, lämna 25 μL PBS i brunnen.
OBS: Att lämna PBS i brunnen minskar sannolikheten för cellavlossning under tillsats av vätska i nästa steg. Alla tvättar är färdiga med PBS kvar i; därför bör lösningen som tillsätts i nästa steg alltid beredas vid en 2x koncentration eftersom den kommer att tillsättas i samma volym som den återstående PBS. - Fixera cellerna genom att tillsätta 25 μL av en 8% formaldehydlösning i PBS med 0,4% Triton X-100 och Hoechst 33342 i en koncentration av 4 μg / ml (de slutliga koncentrationerna av enskilda reagens är 4%, 0,2% respektive 2 μg / ml) (se materialtabell).
- Inkubera plattan i mörker vid rumstemperatur i 30 minuter.
7. Blockering
- Skölj varje brunn fyra gånger med 100 μL PBS. Efter den sista tvätten, lämna 25 μL PBS i brunnen.
- Tillsätt 25 μL 6% BSA i PBS (den slutliga BSA-koncentrationen är 3%) till varje brunn.
- Inkubera plattan i mörker vid rumstemperatur i 30 minuter.
8. Tillsats av primära antikroppar
- Aspirera BSA med en bricka med mikroplattor och lämna 10 μl lösning i brunnen.
- Tillsätt 10 μl av den primära antikroppslösningen beredd i 3% BSA i PBS. Använd anti-BrdU vid 0,8 μg/ml och anti-DNA vid 0,4 μg/ml (de slutliga koncentrationerna av antikroppar är 0,4 μg/ml respektive 0,2 μg/ml) (se materialtabell).
- Inkubera plattan i mörker vid 4 °C över natten.
9. Tillsats av sekundära antikroppar
- Skölj varje brunn fyra gånger med 100 μL PBS. Efter den sista tvätten, lämna 10 μL PBS i brunnen.
- Tillsätt 10 μl av den sekundära antikroppslösningen på 4 μg/ml beredd i 6 % BSA i PBS (den slutliga koncentrationen är 2 μg/ml). Använd isotypspecifika antikroppar (anti-mus IgG1 och anti-mus IgM) konjugerade till fluorokromer som Alexa Fluor 488 och Alexa Fluor 555 (se materialtabell).
- Inkubera plattan i mörker vid rumstemperatur i 1 timme.
- Skölj varje brunn fyra gånger med 100 μL PBS. Efter den sista tvätten, lämna 50 μL PBS i brunnen.
- Försegla plattan med en självhäftande förseglingsfilm (se Materialförteckning) och förvara den i mörker vid 4 °C. Avbildning måste utföras inom 2 veckor.
10. Bildbehandling
OBS: Avbildning måste utföras med ett automatiserat bredfältsmikroskop; Mikroskopet skall vara utrustat med ett motorsteg som förses med manöverdon för automatisk avbildning av enskilda delar av plattan.
- Kontrollera autofokusinställningarna i plattans hörnområden (brunnar A1, A24, P24, P1) och i mitten.
OBS: För avbildning rekommenderas att du använder ett 20x kort arbetsavståndsmål (se materialtabell) med högsta möjliga numeriska bländare. - Baserat på intensitetshistogrammen som genereras av bildåtergivningsprogrammet i livevisningsläge, välj en tillräckligt lång exponeringstid för de enskilda fluorescenskanalerna så att den resulterande bilden inte övermättas.
- Ställ in lämpligt antal plan för avbildning på z-axeln.
OBS: Synfältet vid 20x förstoring är tillräckligt stort för att inte alla celler är i samma fokusplan, så z-sektionering måste utföras för att se alla celler i rätt fokusplan. Vanligtvis räcker det med fem plan. Beroende på tillgången på diskutrymme kan enskilda z-stackar eller endast projektioner med maximal intensitet sparas. Bildanalysen som visas i avsnittet representativa resultat baseras på prognoser för maximal intensitet. - Välj lämpligt antal synfält som ska visas per brunn.
OBS: Beroende på sammanflödet kan cirka 60-300 celler avbildas i ett synfält. För HeLa-celler med ett sammanflöde på 60% -90% kommer avbildning av fem synfält vanligtvis att göra det möjligt att analysera från 500 celler till över 1000 celler. - Välj de brunnar som ska avbildas och börja avbilda.
11. Kvantitativ bildanalys
OBS: Den kvantitativa analysen av förvärvade bilder kan utföras med hjälp av en programvara med öppen källkod som Cell Profiler15. För den aktuella studien utfördes analysen med hjälp av programvaran ScanR 3.0.0 (se Materialförteckning).
- Starta analysen genom att utföra bakgrundskorrigering för alla bilder från alla fluorescenskanaler. Beroende på storleken på de analyserade objekten väljer du lämplig filterstorlek: 80 pixlar för cellkärnor och 4 pixlar för BrdU- och mtDNA-fläckar.
- Börja segmentera bilden genom att skapa en mask av huvudobjektet baserat på förhållandet mellan fluorescenssignalens intensitet och bakgrunden för kanalen som motsvarar cellkärnorna.
- Skapa masker för underobjekten som representerar BrdU- respektive mtDNA-fläckarna med hjälp av fluorescenskanalerna som är lämpliga för de givna strukturerna.
Varje delobjekt tilldelas det närmaste huvudobjektet (cellkärnan). - Ställ in parametrarna som ska mätas under analysen och mät intensiteten hos de enskilda pixlarna inom varje mask för alla fluorescenskanaler.
OBS: Det är också nödvändigt att beräkna antalet delobjekt som tilldelats en given cellkärna och arean för varje delobjekt. - Definiera de härledda parametrar som ska beräknas baserat på erhållna data. För att erhålla de totala fluorescensintensiteterna för BrdU- eller mtDNA-kanalen, summera intensiteterna för alla delobjekt som tilldelats en given cellkärna. För att erhålla den genomsnittliga fluorescensintensiteten, dela den totala fluorescensintensiteten med summan av arean av de delobjekt som tilldelats en given cellkärna.
OBS: För att säkerställa att det skapade delobjektet (BrdU eller mtDNA-fläck) faktiskt ligger i mitokondrierna, är det nödvändigt att grinda dem baserat på fluorescensintensiteten från mitokondriernas spårningsfärgämne. - Utföra ytterligare analys av data som erhållits med ScanR-programvaran med hjälp av R 4.2.2 statistisk programvara16 tillsammans med följande paket: dplyr 17, data.table 18, ggplot219 och ggpubr 20. Det här steget är valfritt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett schema för proceduren för high-throughput-studien av dynamiken i mtDNA-syntes och distribution visas i figur 1. Användningen av ett flerbrunnsplattformat möjliggör samtidig analys av många olika experimentella förhållanden, såsom tystning av olika gener med hjälp av ett siRNA-bibliotek. De förhållanden som används för märkning av nyligen syntetiserade DNA-molekyler med BrdU möjliggör detektion av BrdU-märkt DNA i mitokondrierna i HeLa-celler (figur 2A) men kan också användas som startvillkor för att ställa in analysen för andra celltyper. Inkubationstiden med BrdU bör väljas för enskilda cellinjer på grundval av ett tidsförloppsexperiment (kompletterande figur 1). I den aktuella studien användes HeLa-celler, eftersom screening av siRNA kräver celler som kan transfekteras med hög effektivitet. Det är viktigt att signalen erhållen med anti-BrdU-antikroppar är specifik, eftersom den endast kan observeras i celler behandlade med BrdU (figur 2). Specificiteterna för anti-BrdU och anti-DNA-märkning bekräftades ytterligare med användning av rho0-celler som saknar mitokondriellt DNA21 (kompletterande figur 2). Som förväntat detekterades ingen signal i mitokondrierna för både anti-BrdU eller för anti-DNA-antikroppar i dessa celler, oavsett BrdU-behandling (figur 2B). Kvantifiering av den fluorescerande signalen från anti-BrdU-antikropparna indikerade att rho0-celler behandlade med BrdU visade samma låga fluorescensnivå som de BrdU-obehandlade cellerna, medan signalen för föräldralinjerna A549 och HeLa i genomsnitt var 50 gånger högre (figur 2C).
För att visa användbarheten av metoden som presenteras här i studien av mitokondriell DNA-syntes och distribution genomfördes ett experiment där HeLa-celler behandlades med 2′,3′-dideoxicytidin (ddC), en hämmare av mtDNA-syntes22, och uttrycket av gener som är kända för att vara väsentliga för mtDNA-replikation tystades med siRNA (figur 3). Behandlingen av celler med ddC ledde till fullständig hämning av BrdU-inkorporering, medan de använda siRNA hade varierande effekter. Nedregleringen av Twinkle helicase (TWNK)23 ledde till den mest potenta hämningen av BrdU-inkorporering; en svagare effekt observerades för TFAM-proteinet24, medan nedtystningen av mitokondriellt DNA-polymeras gamma (POLG)25 ledde till en måttlig minskning av BrdU-inkorporering jämfört med celler behandlade med negativt kontroll-siRNA (figur 3A,B). Användningen av anti-DNA-antikroppar i förfarandet möjliggör övervakning av mtDNA-fördelningen i cellen under de givna experimentella betingelserna. Nedregleringen av TFAM ledde till drastiska förändringar i mtDNA-distributionen; färre mtDNA-fläckar detekterades jämfört med kontrollceller, men de som var kvar hade en mycket hög fluorescensintensitet (figur 3A). Kvantifiering av den genomsnittliga fluorescenssignalen från anti-DNA-antikroppen visade en flerfaldig ökning vid TFAM-ljuddämpning jämfört med de andra testade förhållandena (figur 3C).
Bildresultatens specificitet verifierades genom att mäta mtDNA och genuttrycksnivåer med hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) (figur 4). Metoden har beskrivits i detalj på annan plats26. Behandling med ddC resulterade i en mycket kraftig minskning av nivåerna av mtDNA; en svagare effekt observerades vid TFAM- och TWNK-tystnad, medan transfektionen av celler med POLG-siRNA hade en mycket blygsam effekt på mtDNA-kopieringsnumret (figur 4A). Kvantifiering av TFAM- och TWNK-uttrycket bekräftade en effektiv minskning av deras uttryck till ~ 15% -20% av kontrollnivåerna, i motsats till POLG, vars uttryck vid mRNA-nivån reducerades till 30% (figur 4B).
Figur 1: Schematisk representation av protokollstegen. Skalstrecken för de mikroskopiska bilderna är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Specifik detektion av BrdU-inkorporering i mtDNA med anti-BrdU-antikroppar. Exempelbilder av (A) HeLa och (B) A549 och A549 rho0 celler utsatta för immunofluorescensfärgning med anti-BrdU (grön) och anti-DNA (röd) antikroppar. Cellerna behandlades eller behandlades inte med BrdU-lösningen. Nukleärt DNA (blått) märktes med Hoechst, och mitokondrierna (cyan) visualiserades med ett mitokondrispårningsfärgämne. En sammanslagen bild av alla fyra fluorescenskanalerna visas. Skalstapeln representerar 10 μm. (C) Resultatet av kvantifieringen av signalen från anti-BrdU-antikropparna. Analysen utfördes för fyra oberoende biologiska replikat; varje gång analyserades 100 slumpmässigt utvalda celler för varje experimentellt tillstånd (N = 400 celler). I genomsnitt detekterades 18 BrdU-foci per cell. Rutorna representerar den första och tredje kvartilen i interkvartilområdet (IQR), medianen representeras av en horisontell linje, morrhåren definierar minimum och maximum och extremvärdena definieras som 1,5 x IQR. Ett Kruskal-Wallis statistiskt test utfördes. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Resultat av hämning av mtDNA-syntes, inklusive minskning av effektiviteten av BrdU-inkorporering och påverkan på fördelningen av nukleoider. (A) Provfluorescensbilder av HeLa-celler behandlade i 72 timmar med ddC eller siRNA, som nedreglerar de proteiner som är involverade i mtDNA-replikation. Cellerna behandlades med BrdU i 16 timmar före fixering. Nukleärt DNA (blått) färgades med Hoechst, anti-BrdU (grön) och anti-DNA (röd) antikroppar användes och mitokondrierna märktes med ett mitokondrispårningsfärgämne. En sammanslagen bild av alla fyra fluorescenskanalerna visas. Skalstapeln representerar 10 μm. (B,C) Kvantifiering av fluorescenssignalerna från (B) anti-BrdU och (C) anti-DNA-antikroppar. Analysen utfördes för fyra oberoende biologiska replikat; varje gång analyserades 650 slumpmässigt utvalda celler för varje experimentellt tillstånd (N = 2 600 celler). I genomsnitt detekterades 18 BrdU-foci och 46 mtDNA-foci per cell. Rutorna representerar den första och tredje kvartilen i interkvartilområdet (IQR), medianen representeras av en horisontell linje, morrhåren definierar minimum och maximum och extremvärdena definieras som 1,5 x IQR. Ett Kruskal-Wallis statistiskt test utfördes. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Validering av effektiviteten av hämningen av mtDNA-syntes och effektiviteten av de testade siRNA. HeLa-celler behandlades i 72 timmar med ddC eller de indikerade siRNA och utsattes sedan för DNA- och RNA-isolering. (A) Resultat av mtDNA-nivåanalys med qPCR. b) qPCR-analys av förändringar i genuttrycket under angivna betingelser. Staplarna representerar medelvärdena för fyra oberoende biologiska replikat; felstaplarna representerar SEM; ett statistiskt test från ANOVA utfördes; ett t-test utfördes för parvis jämförelse mot Untr (obehandlade) prover. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Dynamik för BrdU-inkorporering i mtDNA i HeLa-celler. Resultaten av ett tidsförloppsexperiment där cellerna inkuberades med 20 μM BrdU under en given tid visas. Medelvärdet för fyra oberoende replikat för varje tidpunkt visas. 900 slumpmässigt utvalda celler analyserades i varje replikat. Staplarna representerar medelvärdet av fyra replikat; ett statistiskt test från ANOVA utfördes. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Validering av A549 rho0-cellerna. (A) Elektroforetisk analys av qPCR-produkterna från amplifierande DNA-fragment av mtDNA-kodade ND1 - och kärn-DNA-kodade B2M-gener . Totalt DNA från A549 eller A549 rho0 celler användes som mallar i reaktionen. (B) Resultat av mtDNA-nivåanalys med qPCR. Staplarna representerar medelvärdena för fyra oberoende biologiska replikat; felstaplarna representerar SEM; Ett T-test utfördes. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historiskt sett har DNA-märkning genom BrdU-inkorporering och antikroppsdetektion använts i kärn-DNA-replikation och cellcykelforskning 14,27,28. Hittills har alla protokoll för att detektera BrdU-märkt DNA inkluderat ett DNA-denatureringssteg (surt eller termiskt) eller enzymnedbrytning (DNas eller proteinas) för att möjliggöra epitopexponering och underlätta antikroppspenetration. Dessa protokoll utvecklades för tätt packat kärn-DNA. Den annorlunda organisationen av mtDNA möjliggjorde emellertid utvecklingen av ett förfarande utan denatureringssteget; Detta har förenklat proceduren och gjort den mer lämplig för applikationer med hög genomströmning. Detta tillvägagångssätt har gett utmärkta resultat eftersom utelämnandet av denatureringssteget resulterar i detektion av BrdU-märkt DNA endast utanför kärnan (figur 2 och figur 3). Följaktligen kan den starka signalen från kärn-DNA, som alltid är närvarande när ett denatureringssteg ingår och som kan orsaka ett allvarligt problem genom att maskera signalen från BrdU-märkt mtDNA29, undvikas med detta protokoll. Dessutom säkerställer bristen på hård denaturering bättre bevarande av cellulära strukturer och påverkar inte effektiviteten av färgning av fluorescerande fläckar såsom Hoechst eller mitokondrier spårningsfärg (figur 2 och figur 3).
Dynamiken i BrdU-införlivandet i mtDNA är cellinjeberoende. Att göra ett tidsförloppsexperiment på BrdU-inkorporering rekommenderas när du använder en ny cellinje. Denna studie har fastställt 16 timmar som en optimal BrdU-inkubationstid för HeLa-cellinjer. På grund av den biologiska variationen i HeLa-linjer från olika laboratorier30 föreslås det dock att man utför ett BrdU-tidsförloppsexperiment på den specifika HeLa-varianten man planerar att arbeta med.
Kombinationen av anti-BrdU och anti-DNA-märkning i detta protokoll möjliggör övervakning av mtDNA-syntes och samtidig studie av mtDNA-fördelningen i cellen. Detta kan ses mycket bra i TFAM-tystade celler (figur 3). Minskande nivå av TFAM leder till en minskning av mtDNA-syntesen (en minskad total anti-BrdU-signal) och till kluster av mitokondriella nukleoider, vilket manifesteras av en betydande ökning av den genomsnittliga mtDNA-fluorescenssignalen (figur 3). Det bör noteras att i detta fall orsakas ökningen av den genomsnittliga mtDNA-fluorescensintensiteten av den förändrade fördelningen av mitokondriella nukleoider och återspeglar inte uppregleringen av mtDNA-nivåer; i själva verket reduceras mtDNA-nivåerna, vilket avslöjas av kvantitativ PCR-analys (figur 4A). Överraskande resultat erhölls för cellerna transfekterade med POLG siRNA (figur 3). Man kan förvänta sig att transfektion av celler med siRNA-riktad POLG, som är replikativ DNA-polymeras i mitokondrier, avsevärt skulle minska BrdU-införlivandet i mtDNA. I denna studie var dock effekten på BrdU-inkorporering försumbar (figur 3), vilket ytterligare bekräftades genom att mäta mtDNA-nivåerna med qPCR (figur 4A). Den dåliga nedregleringen av POLG-uttryck kan förklara detta till synes motsägelsefulla resultat vid transfektion av celler med det applicerade siRNA (figur 4B). Detta belyser en potentiell nackdel med att använda siRNA för funktionella studier och tyder på att det finns ett behov av gendämpande validering.
Sammantaget har en analys för att studera dynamiken i mtDNA-metabolism i odlade celler utvecklats som använder ett multi-well plattformat och immunofluorescensavbildning för att detektera och kvantifiera mtDNA-replikation, reparation och distribution. Metoden möjliggör samtidig studie av många olika experimentella betingelser. Det kan användas för att undersöka effekterna av olika hämmare, cellulära påfrestningar och nedtystning av gener på mtDNA-metabolism. Medan analysen har en hög potential för användning vid studier av mtDNA-metabolism i olika fysiologiska och patologiska sammanhang, bör det noteras att analysen inte tillåter replikation och reparationskopplad mtDNA-syntes att särskiljas. Detta bör beaktas vid tolkning av resultaten och planering av efterföljande funktionella experiment. I synnerhet har analysen ytterligare utvecklingspotential. Till exempel detekteras replikationsinaktiva (eller reparationsinaktiva) mitokondriella nukleoider inte med anti-BrdU-antikroppar. Därför möjliggör appliceringen av anti-DNA-antikroppar kvantifiering av mtDNA-tillståndsnivåerna, antalet replikationstysta nukleoider och fördelningen av nukleoider i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Centre, Polen (bidrag/tilldelningsnummer: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
