Summary
In questo protocollo, è stato preparato un modello di osteoartrite del ginocchio utilizzando il metodo Videman modificato e sono dettagliate le procedure operative e le precauzioni dell'agopotomia. L'efficacia dell'acupotomia è stata dimostrata testando le proprietà meccaniche del quadricipite femorale e del tendine e le proprietà meccaniche e morfologiche della cartilagine.
Abstract
L'artrosi del ginocchio (KOA) è una delle malattie più frequenti nel reparto ortopedico, che riduce seriamente la qualità della vita delle persone con KOA. Tra i diversi fattori patogeni, lo squilibrio biomeccanico dell'articolazione del ginocchio è una delle principali cause di KOA. L'agopotomologia ritiene che il ripristino dell'equilibrio meccanico dell'articolazione del ginocchio sia la chiave per il trattamento della KOA. Studi clinici hanno dimostrato che l'agopotomia può ridurre efficacemente il dolore e migliorare la mobilità del ginocchio riducendo l'adesione, la contrattura dei tessuti molli e i punti di concentrazione dello stress nei muscoli e nei tendini intorno all'articolazione del ginocchio.
In questo protocollo, abbiamo utilizzato il metodo Videman modificato per stabilire un modello KOA immobilizzando l'arto posteriore sinistro in posizione diritta. Abbiamo delineato in dettaglio il metodo di intervento e le precauzioni relative all'agopotomia e valutato l'efficacia dell'agopotomia in combinazione con la teoria di "Modulare Muscoli e Tendini per Trattare i Disturbi Ossei" attraverso la rilevazione delle proprietà meccaniche del quadricipite femorale e del tendine, nonché della meccanica e della morfologia della cartilagine. I risultati mostrano che l'agopotomia ha un effetto protettivo sulla cartilagine regolando le proprietà meccaniche dei tessuti molli intorno all'articolazione del ginocchio, migliorando l'ambiente di stress della cartilagine e ritardando la degenerazione della cartilagine.
Introduction
L'artrosi del ginocchio (KOA) è la forma più frequente di osteoartrite, spesso riconosciuta come una malattia dell'intera articolazione caratterizzata da degenerazione della cartilagine articolare, che si manifesta clinicamente con dolore, gonfiore e movimento limitato delle articolazioni colpite1. Secondo recenti statistiche epidemiologiche, nel 2020 la KOA avrebbe colpito 654,1 milioni di persone in tutto il mondo di età pari o superiore a 40 anni. La prevalenza e l'incidenza di KOA aumentano con l'età, sono più alte negli adulti di mezza età e negli anziani e colpiscono più donne che uomini2. È probabile che la prevalenza di KOA aumenti a causa dell'invecchiamento della popolazione e dell'epidemia di obesità in tutto il mondo, rappresentando una crescente minaccia per la salute pubblica globale. L'età, il sesso, l'obesità, i traumi e altri complicati fattori di rischio associati alla KOA hanno tutti un impatto diretto sull'instabilità del ginocchio, rendendo uno squilibrio biomeccanico nelle articolazioni del ginocchio una delle cause principali della KOA3.
In condizioni fisiologiche normali, l'articolazione del ginocchio si trova in uno stato di equilibrio meccanico, assicurando che i carichi meccanici nell'articolazione siano distribuiti uniformemente sulla cartilagine. Qualsiasi squilibrio meccanico nell'articolazione del ginocchio può portare a uno stress anomalo nella cartilagine, con conseguente degenerazione della cartilagine e l'insorgenza di KOA4. Il sistema muscolo-tendineo è il principale sistema dinamico che mantiene l'equilibrio meccanico dell'articolazione del ginocchio. Il movimento coordinato del sistema muscolo-tendineo estensore e flessore è in grado di distribuire uniformemente il carico generato dal movimento sulla superficie della cartilagine, evitando lo squilibrio metabolico delle sollecitazioni cartilaginee locali oltre il suo carico fisiologico che si traduce in perdita di cartilagine5. La diminuzione della forza muscolare è la causa principale del disturbo del movimento intramuscolare e del danno alla cartilagine, che può verificarsi prima della KOA sintomatica.
Il KOA può anche indurre l'inibizione muscolare artrosa (IMA), che si manifesta con debolezza muscolare e diminuzione della forza muscolare intorno al ginocchio6. Tra questi muscoli, il gruppo del quadricipite femorale funziona come l'unico estensore del ginocchio, una struttura importante per mantenere la stabilità dell'articolazione del ginocchio. Gli studi hanno dimostrato che una diminuzione dell'area della sezione trasversale del quadricipite e della forza muscolare è significativamente e positivamente correlata con la progressione del KOA7. Il declino della forza del quadricipite influisce sul modello di andatura, sulla stabilità del ginocchio, sui modelli di movimento e su molte altre funzioni. Inoltre, il declino della forza muscolare compromette la funzione tendinea, che si manifesta come una diminuzione della rigidità tendinea, del modulo elastico e di altre proprietà biomeccaniche8. Nella riparazione a lungo termine, possono verificarsi cambiamenti come l'adesione e la contrattura nei muscoli e nei tendini dell'articolazione del ginocchio, danneggiando le loro proprietà meccaniche, causando instabilità articolare e, infine, formando un circolo vizioso di cambiamenti patologici di KOA. È quindi fondamentale che il trattamento con KOA migliori le proprietà meccaniche del sistema muscolo-tendineo e ripristini l'equilibrio meccanico articolare.
Tra le cause di KOA, lo squilibrio biomeccanico è il principale fattore che induce il dolore al ginocchio, la disfunzione, le lesioni infiammatorie e la degenerazione della cartilagine9. Pertanto, la chiave per il trattamento della KOA è ripristinare l'equilibrio biomeccanico dell'articolazione del ginocchio. L'acupotomologia ritiene che l'eziologia e la patogenesi del KOA siano "squilibri meccanici". Quando le caratteristiche meccaniche dei tessuti molli intorno al ginocchio cambiano in modo anomalo, l'articolazione del ginocchio perde il suo equilibrio meccanico e l'ambiente di stress meccanico anomalo dell'articolazione accelera la degenerazione, causando una stimolazione infiammatoria che aggrava ulteriormente le aderenze dei tessuti molli, le contratture e l'ulteriore declino della stabilità articolare. Questo circolo vizioso alla fine si sviluppa in KOA. Allentando le aderenze e le contratture dei tessuti molli, oltre a ridurre la concentrazione di stress nei muscoli e nei tendini, l'agopotomia in combinazione con la teoria della "modulazione di muscoli e tendini per trattare i disturbi ossei" migliora la meccanica dei tessuti molli e "modula muscoli e tendini", bilanciando lo stress meccanico dell'articolazione, alleviando efficacemente la degenerazione della cartilagine e "trattando i disturbi ossei"10. In termini di selezione del modello animale, in base allo scopo di questo studio, abbiamo preparato il modello KOA con il metodo Videman modificato di immobilizzazione dell'estensione dell'arto posteriore sinistro.
Questo documento descrive in dettaglio la creazione del modello KOA utilizzando il metodo Videman modificato per l'immobilizzazione dell'estensione dell'arto posteriore sinistro e il metodo di funzionamento e le precauzioni dell'agopotomia. Dimostriamo l'efficacia dell'agopotomia testando le proprietà meccaniche del quadricipite, del femore e del tendine e rilevando i cambiamenti nello stress e nella morfologia della cartilagine articolare.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (No. BUCM-4-2022010101-1097). In questo protocollo, 24 conigli neozelandesi maschi di 6 settimane sono stati ospitati in una condizione specifica, vale a dire 20-25 °C, 50-60% di umidità e un ciclo circadiano di 12 ore di luce/12 ore di buio, con libero accesso a una dieta regolare. I conigli sono stati anestetizzati e sacrificati combinando l'anestesia profonda e l'embolizzazione aerea. Il dolore è una delle caratteristiche patologiche tipiche della KOA ed è anche uno degli indicatori chiave utilizzati per valutare i modelli animali di KOA e i metodi di intervento, quindi non vengono utilizzati analgesici durante la preparazione del modello.
1. Il modello di coniglio KOA
- Anestetizzare i conigli con pentobarbital sodico al 3% (30 mg/kg) per via endovenosa al margine dell'orecchio. Per confermare il livello appropriato di anestesia, cercare un riflesso corneale significativamente indebolito o assente e l'assenza di dolore quando si blocca la pelle con una pinza emostatica. Durante l'anestesia, aggiungere 2-3 gocce di lubrificante sugli occhi dei conigli ogni 15 minuti per evitare che gli occhi dei conigli si secchino.
- Dopo l'anestesia, fissare ogni coniglio in posizione supina, tirando l'arto posteriore sinistro in una posizione completamente estesa.
- Fissare l'arto posteriore sinistro di ogni coniglio in posizione estesa.
- Come primo strato, usa del nastro adesivo per coprire la pelle del coniglio dall'inguine all'articolazione della caviglia.
- Come secondo strato, avvolgere un nastro biadesivo in schiuma largo 36 mm sopra il nastro medico e poi avvolgere una benda polimerica dall'inguine all'articolazione della caviglia. Assicurarsi che l'articolazione del ginocchio sia dritta a 180° e che l'articolazione della caviglia sia dorsiflessa di 60°.
- Come terzo strato, immobilizza le articolazioni con piccole stecche nella parte anteriore e posteriore delle articolazioni del ginocchio e della caviglia e avvolgi una rete d'acciaio attorno allo strato più esterno per proteggerti dai morsi. Esporre le dita dei conigli per osservare se la circolazione sanguigna è normale.
- Immobilizzare gli animali per 6 settimane per stabilire il modello KOA (Figura 1).
NOTA: 1) Durante la preparazione del modello, ispezionare gli stampi a giorni alterni. Se alcuni stampi sono allentati o staccati, anestetizzare i conigli e immobilizzare nuovamente gli arti posteriori sinistri in posizione estesa. 2) Stendere dei tappetini protettivi sul fondo delle gabbie per evitare che gli arti dei conigli si incastrino e causino lesioni.
2. Intervento di agopotomia
NOTA: Prima di iniziare l'intervento di agopotomia, anestetizzare i conigli con pentobarbital sodico al 3% (30 mg/kg) mediante iniezione endovenosa del margine auricolare.
- Determinare i punti di trattamento.
- Radere il pelo dell'articolazione del ginocchio dell'arto posteriore sinistro del coniglio.
- Palpare l'inserimento del tendine del muscolo femorale mediale dell'articolazione del ginocchio del coniglio, l'inserimento del tendine del retto femorale, l'inserimento del tendine del bicipite femorale e la borsa a zampa d'oca. Contrassegnare gli indurimenti patologici dei muscoli locali con un marcatore cutaneo sterile. Disinfettare l'articolazione del ginocchio tre volte con cicli alternati di iodoforo medico e alcol medico al 75%.
- Operazione di agopotomia
- Mantenere la lama per agopotomia parallela alla direzione di marcia parallela al tendine e all'asse longitudinale dell'arto.
- Usa il pollice della mano sinistra per premere sulla pelle entrando nel punto di marcatura e spostati lateralmente in modo che i vasi sanguigni e i nervi siano separati sul lato ventrale del pollice.
- Con l'impugnatura per agopotomia nella mano destra, premere rapidamente verso il basso con una piccola forza in modo che la lama per agopotomia passi istantaneamente attraverso la pelle. Far avanzare lentamente la lama per agopotomia fino agli indurimenti muscolari locali ed eseguire tagli longitudinali e oscillazioni laterali.
- Al termine dell'operazione di agopotomia, disinfettare nuovamente l'articolazione del ginocchio e applicare un cerotto.
- Eseguire questa operazione una volta alla settimana per 4 settimane (Figura 2).
NOTA: 1) Se non c'è indurimento o tessuto simile a un cordone ombelicale toccato all'inserzione del tendine del vasto mediale, del vasto laterale, del retto femorale, del bicipite femorale o della borsa anserina, l'ago per acupotomia deve essere utilizzato per rilasciare direttamente le loro inserzioni tendinee. 2) Durante l'intervento di agopotomia, non immobilizzare gli arti posteriori sinistri dei conigli nel gruppo di agopotomia e nel gruppo modello in posizione di estensione.
3. Modulo elastico del quadricipite femorale
NOTA: 1) Questo esperimento ha utilizzato lo strumento diagnostico ecografico con elastografia ad onde trasversali (SWE) in tempo reale per misurare il modulo elastico del quadricipite femorale in vivo in ciascun gruppo di conigli. 2) Il tester deve essere un ecografista esperto nel rilevamento degli ultrasuoni. Durante la misurazione, la sonda a ultrasuoni deve essere posizionata delicatamente sulla superficie cutanea del quadricipite per evitare tensioni muscolari locali. Le misurazioni devono essere effettuate quando l'animale è in uno stato tranquillo, senza lotte o attività. Se l'animale è attivo, attendere che si calmi prima di eseguire il test.
- Radere il pelo per esporre la pelle nella regione del quadricipite dell'arto posteriore sinistro.
- Utilizzare l'ecografia bidimensionale convenzionale per localizzare il quadricipite muscolo-addominale e determinare la regione di interesse (ROI), impostata a una profondità di 1-2 cm.
- Avviare la modalità SWE per l'ispezione.
- Impostare l'area di interesse in modo uniforme su un'area circolare con un diametro di 2 mm e l'area di interesse a ~0,5-1 cm di profondità dalla superficie della pelle.
- Utilizzare lo strumento diagnostico ad ultrasuoni per generare un impulso di forza di radiazione acustica per stimolare il tessuto muscolare e ottenere l'elastografia tissutale.
- Attendere 2-3 secondi affinché l'immagine si stabilizzi, quindi bloccarla. Attivare la funzione Q-BOX dello strumento per misurare il modulo di Young del muscolo quadricipite.
- Attendere che il sistema calcoli automaticamente i valori massimo, minimo e medio (unità: KPa) del modulo di Young del ROI. Seleziona tre ROI alla stessa profondità per tre misurazioni e prendi il valore medio per l'analisi statistica.
NOTA: Il tester deve essere un ecografista esperto nel rilevamento di ultrasuoni. Durante la misurazione, la sonda a ultrasuoni deve essere posizionata delicatamente sulla superficie cutanea del quadricipite per evitare tensioni muscolari locali. Le misurazioni devono essere effettuate quando l'animale è in uno stato tranquillo, senza lotte o attività. Se l'animale è attivo, attendere che si calmi prima di eseguire il test.
4. Misurare la forza di contrazione del quadricipite femorale
NOTA: Dopo la misurazione della forza di contrazione del quadricipite femorale, i conigli sono stati sottoposti a eutanasia mediante embolia gassosa in anestesia.
- Anestetizzare i conigli con pentobarbital sodico al 3% (30 mg/kg) per via endovenosa sul margine dell'orecchio. Per confermare che è stato raggiunto il livello appropriato di anestesia, cercare un riflesso corneale significativamente indebolito o assente e l'assenza di dolore quando si blocca la pelle con una pinza emostatica. Durante l'anestesia, aggiungere 2-3 gocce di lubrificante sugli occhi dei conigli ogni 15 minuti per evitare che gli occhi dei conigli si secchino.
- Esporre i muscoli quadricipiti e collegare il trasduttore di tensione.
- Tagliare la pelle sotto la rotula, lungo l'asse longitudinale dell'arto verso l'alto fino alla base della coscia, e continuare a tagliare la pelle verso l'alto di 3-4 cm. Staccare con cura la pelle e la fascia ed esporre il muscolo. Tagliare il legamento rotuleo e separare con cura i quadricipiti dalla giunzione iliaca, mantenendo i quadricipiti in connessione con l'iliacio.
- Legare le suture chirurgiche alla giunzione tendinea tra la rotula e il muscolo quadricipite. Allunga il muscolo per tutta la sua lunghezza nel suo stato naturale e poi attaccalo al trasduttore di tensione. Mantenere la linea di legatura sul muscolo in linea retta con la linea di legatura sul trasduttore di forza.
- Fissare il trasduttore di tensione alla staffa. Collegare la linea di acquisizione del segnale sul trasduttore di tensione al processore del sistema di acquisizione del biosegnale.
- Misura le prestazioni contrattili del muscolo quadricipite.
- Inserire gli elettrodi parallelamente all'addome del quadricipite ed evitare qualsiasi contatto tra gli elettrodi.
- Premere il pulsante dell'oscilloscopio. Regolare la posizione del trasduttore di forza sulla staffa per mantenere la linea di base a zero. Selezionare i parametri di stimolazione dello stimolatore con un'ampiezza d'onda di 5 ms e un ritardo di 10 ms.
- Utilizzare prima un singolo stimolo e regolare gradualmente l'intensità dello stimolo da zero con un incremento di 0,1 V ogni volta. Osservare i cambiamenti nella curva di contrazione muscolare e nell'ampiezza di contrazione fino a determinare l'ampiezza massima di contrazione singola (Pt) del quadricipite. Registralo per le statistiche successive.
- Usa uno stimolo a grappolo e usa l'ampiezza dello stimolo che induce la massima ampiezza di contrazione singola come linea di base per stimolare continuamente il muscolo e aumentare gradualmente la frequenza dello stimolo. Osservare i cambiamenti nella curva di contrazione muscolare fino a determinare l'ampiezza massima di contrazione (Pt) del quadricipite. Registralo per le statistiche successive.
NOTA: 1) Dopo ogni contrazione muscolare, il muscolo deve essere dato 30 secondi per rilassarsi con la soluzione tampone muscolare che gocciola continuamente sul muscolo. 2) Durante l'operazione, giudicare lo stato dell'anestesia monitorando il riflesso palpebrale, il ritmo respiratorio, il rilassamento muscolare e la risposta al pizzicamento della pelle dei conigli.
5. Le prestazioni meccaniche del tendine del quadricipite
- Pre-elaborazione: il giorno del test, misurare la lunghezza, la larghezza e lo spessore del tendine del quadricipite con un calibro a corsoio e installare uno speciale morsetto antiscivolo nella macchina per prove di fatica. Ripetere il carico e lo scarico 15 volte per la pre-elaborazione.
- Test di rilassamento da sforzo: utilizzare il sensore da 0 N a 100 N, allungarlo a una velocità di 5 mm/min fino a raggiungere la lunghezza richiesta, quindi iniziare a raccogliere dati. Impostare il tempo di acquisizione dei dati del computer da t (0), raccogliendo dati ogni 0,1 s, della durata di 1.800 s. Dopo aver raggiunto il tempo impostato, registrare i dati e le curve.
- Prova di trazione: utilizzare il sensore da 0 N a 100 N e allungarlo a una velocità di 5 mm/min fino al carico massimo fino a quando il provino non viene staccato. Dopo il test, calcolare lo spostamento massimo, il carico massimo e la rigidità del provino.
6. Pressione superficiale di contatto dell'articolazione e pressione per unità di area della cartilagine
- Fissare i campioni di femore e tibia su entrambi i lati in posizione diritta sull'apparecchio ed eseguire un test di precarico. Misura l'intervallo approssimativo dell'articolazione del ginocchio, taglia la carta sensibile alla pressione nella stessa forma e sigillala con pellicola trasparente.
- Posizionare la carta sensibile alla pressione sigillata tra le articolazioni della tibia e del femore ed eseguire un test di pressione sull'articolazione del ginocchio con una pressione di 5 mm/min e una pressione massima di 50 N. Mantenere la pressione per 2 minuti fino a raggiungere i 50 N quando la carta sensibile alla pressione è colorata in modo stabile.
- Dopo 2 minuti, rimuovere la carta sensibile alla pressione, fissare la superficie colorata su un foglio di carta formato A4 e acquisire le immagini con la scala da parte.
- Carica l'immagine sul computer. Utilizzare il software di riferimento per la misurazione dell'area e la misurazione multisegmento per le figure irregolari. Misurare la pressione all'interno e all'esterno delle articolazioni del femore e della tibia e registrare i risultati.
7. Colorazione Safranina O/Fast Green della cartilagine dell'articolazione del ginocchio
- Dopo la fine dell'intervento di agopotomia, prelevare i tessuti del complesso osseo cartilagine-subcondrale e incorporarli in paraffina. Affettare i blocchi di cera tissutale preparati e preparare i vetrini. Deparaffinare i vetrini di tessuto preparati con una soluzione di deceratura ambientale (I) e una soluzione di deceratura ambientale (II) per 15 minuti ciascuno; quindi, immergerli successivamente in xilene ed etanolo anidro (1:1), etanolo anidro (I), etanolo al 95%, etanolo all'85% ed etanolo al 75%, 2-5 minuti ogni passaggio; e infine, immergeteli in acqua distillata per 15 min.
- Eseguire la colorazione.
- Colorare i vetrini con la soluzione Fast Green per 1 min. Durante questo processo, estrarre i vetrini dalla soluzione e osservarli al microscopio fino a quando il tessuto non si colora di verde scuro.
- Separazione del colore: Sciacquare la soluzione Fast Green in eccesso con acqua ultrapura. Immergere rapidamente i vetrini in una soluzione di acido acetico all'1% per 5-10 secondi. Anche in questo caso, sciacquare il vetrino con acqua ultrapura.
- Colorare i vetrini in soluzione di Safranina O per 10-15 minuti fino a quando la cartilagine non si colora di rosso.
- Disidratare e chiarire il tessuto, sigillare i vetrini e osservarli al microscopio.
- Immergere i vetrini in etanolo al 75%, etanolo all'85%, etanolo al 95% ed etanolo al 100% per 3-5 secondi consecutivi.
- Immergere i vetrini in una soluzione decerante ambientale (I) e in una soluzione decerante ambientale (II) per 10 minuti consecutivi. Estrarre i vetrini e far cadere il mezzo resinoso neutro sulla parte anteriore dei vetrini, evitando il tessuto. Posiziona il bordo del vetro di copertura sul vetrino e poi appoggialo lentamente per coprire il balsamo neutro. Rimuovere l'aria ed evitare bolle d'aria. Pulisci lo xilene in eccesso e il balsamo neutro e lascialo riposare per una notte a temperatura ambiente.
- Osservare i vetrini al microscopio e acquisire le immagini. Per ogni gruppo, selezionare sei campioni di cartilagine del ginocchio di coniglio e selezionare in modo casuale quattro diversi campi di visualizzazione per ciascun campione da valutare. Valutare l'istologia della cartilagine di ciascun gruppo secondo il metodo Mankin (Tabella 1).
8. Analisi statistica
- Esprimere i dati come media ± deviazione standard (
± s). - Eseguire l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e il test dell'LSD per determinare la significatività statistica di confronti tra più gruppi.
- Si considerino le differenze statisticamente significative quando P < 0,05.
± s).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Risultati sperimentali delle proprietà meccaniche del quadricipite femorale e del tendine
Per valutare l'effetto dell'acupotomologia sulle proprietà meccaniche del quadricipite femorale nei conigli con KOA, abbiamo utilizzato rispettivamente l'ecografia elastica a onde trasversali in tempo reale e un trasduttore di tensione muscolare. Rispetto al gruppo di controllo, il modulo di Young del quadricipite femorale nel gruppo KOA è risultato diminuito (P < 0,05). Rispetto al gruppo KOA, il modulo di Young del gruppo di agopotomia è risultato aumentato (P < 0,05, Figura 3A). In termini di capacità di contrazione del quadricipite femorale, rispetto al gruppo di controllo, l'ampiezza della contrazione singola e l'ampiezza della contrazione tetanica del quadricipite femorale sono risultate significativamente ridotte nel gruppo KOA (P < 0,05, P < 0,01). Rispetto al gruppo KOA, l'ampiezza della contrazione singola e l'ampiezza della contrazione tetanica del quadricipite femorale nel gruppo di agopotomia sono risultate significativamente aumentate (P < 0,05, P < 0,01, Figura 3B,C). Questi risultati mostrano che l'agopotomia potrebbe migliorare il modulo di Young e la contrattilità muscolare del quadricipite femorale nei conigli con KOA.
Per valutare l'effetto dell'agopotomia sulle proprietà meccaniche del tendine del quadricipite nei conigli con KOA, abbiamo condotto un test di trazione e un test di rilassamento da sforzo sul tendine del quadricipite. In termini di caratteristiche di trazione del tendine del quadricipite, rispetto al gruppo di controllo, il carico finale e lo spostamento massimo del tendine del quadricipite nel gruppo KOA sono stati significativamente ridotti (P < 0,01, P < 0,01), mentre la rigidità del tendine del quadricipite nel gruppo KOA ha mostrato una tendenza al ribasso (P > 0,05). Rispetto al gruppo KOA, il carico finale e lo spostamento massimo del tendine del quadricipite nel gruppo di agopotomia sono stati significativamente ridotti (P < 0,01, P < 0,01) e la rigidità del tendine del quadricipite nel gruppo di agopotomia ha mostrato una tendenza al rialzo (P > 0,05, Figura 4A-C). In termini di tasso di rilassamento dello stress, rispetto al gruppo di controllo, il tasso di rilassamento dello stress del tendine del quadricipite nel gruppo KOA è diminuito (P < 0,05). Rispetto al gruppo KOA, il tasso di rilassamento dello stress del tendine del quadricipite nel gruppo di agopotomia è aumentato (P < 0,05, Figura 4D). Questi risultati mostrano che l'agopotomia potrebbe migliorare le caratteristiche di rilassamento della trazione e dello stress del tendine del quadricipite nei conigli con KOA.
Risultati sperimentali della pressione e della pressione per unità di superficie sulla superficie di contatto della cartilagine e sulla morfologia della cartilagine
In termini di pressione massima sulla superficie di contatto della cartilagine, rispetto al gruppo di controllo, non c'è stata alcuna differenza significativa nella pressione massima sulla superficie di contatto della cartilagine nel gruppo KOA (P > 0,05), ma c'è stata una tendenza al ribasso. Rispetto al gruppo KOA, non c'è stata alcuna differenza significativa nella pressione massima sulla superficie di contatto della cartilagine nel gruppo di agopotomia (P > 0,05), ma c'è stata una tendenza al rialzo (Figura 5A). In termini di pressione per unità di superficie della superficie di contatto della cartilagine, rispetto al gruppo di controllo, non c'è stata alcuna differenza significativa nella pressione massima per unità di area nel gruppo KOA (P > 0,05), ma c'è stata una tendenza al ribasso. Rispetto al gruppo di controllo, non c'è stata alcuna differenza significativa nella pressione massima per unità di area nel gruppo di agopotomia (P > 0,05), ma c'è stata una tendenza al rialzo (Figura 5B). Questi risultati mostrano che l'intervento di agopotomia ha avuto la tendenza ad aumentare la pressione massima e la pressione per unità di area della superficie di contatto della cartilagine, indicando effetti positivi sull'ambiente di stress della cartilagine.
Per valutare l'effetto dell'agopotomia sulla morfologia della cartilagine, abbiamo utilizzato la colorazione Safranina O-Fast Green. Nel gruppo di controllo, la superficie della cartilagine era liscia; i condrociti in tutti gli strati erano disposti in modo ordinato e ordinato; i condrociti superficiali erano disposti a forma di fuso; gli strati intermedi e profondi dei condrociti erano disposti in una disposizione colonnare; la linea di marea era chiara e completa; e non c'è stata formazione di pannus (Figura 6A). Nel gruppo KOA, la superficie della cartilagine era ruvida o c'erano difetti di desquamazione; il numero di condrociti superficiali è stato ridotto; la gerarchia e la disposizione dei condrociti erano disordinate; i condrociti dello strato intermedio mostravano segni di disidratazione, contrazione e necrosi; è stato osservato il raggruppamento dei condrociti; le linee di marea erano sfocate o si vedeva una frattura distorta; In alcune zone si potevano vedere ripetute linee di marea; i vasi sanguigni possono essere passati attraverso la linea di marea nella cartilagine dello strato non calcificato; o c'è stata formazione di pannus (Figura 6B). Nel gruppo di agopotomia, lo strato superficiale della cartilagine era relativamente liscio; la struttura dei condrociti era normale; la disposizione dei condrociti in tutti gli strati era relativamente ordinata; la linea di marea era chiara o, occasionalmente, c'erano linee di marea ripetute; non c'è stata formazione di pannus (Figura 6C). In termini di punteggi morfologici della cartilagine, rispetto al gruppo di controllo, il punteggio Markin della cartilagine del gruppo KOA è stato significativamente aumentato (P < 0,01). Rispetto al gruppo KOA, il punteggio Markin della cartilagine del gruppo di agopotomia è stato significativamente ridotto (P < 0,01, Figura 6D). Questi risultati mostrano che l'integrità della cartilagine dei conigli con KOA è stata danneggiata e che l'intervento di agopotomia potrebbe ritardare la degenerazione della cartilagine e avere un effetto protettivo sulla cartilagine.
Figura 1: Metodo Videman modificato per stabilire un modello di osteoartrite del ginocchio. (A) Materiali necessari per la creazione del modello KOA. (B) Utilizzare del nastro adesivo medico sensibile alla pressione per coprire l'arto posteriore sinistro dei conigli. (C) Avvolgere bende polimeriche attorno all'arto posteriore sinistro dei conigli. (D,E) Usa le stecche per immobilizzare le articolazioni del ginocchio e della caviglia del coniglio. (F) Avvolgere la rete metallica per evitare che i conigli rosicchiano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Metodo di intervento di agopotomia. (A) Preparazione della pelle all'articolazione del ginocchio dell'arto posteriore sinistro di un coniglio. (B) Selezionare i punti di inserimento e utilizzare un marcatore cutaneo chirurgico per contrassegnare le posizioni. (C) Utilizzare iodoforo medico per disinfettare. (D) Pressurizzare e separare per evitare nervi e vasi sanguigni. (E) Perforare l'agopotomia e operare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Proprietà meccaniche del quadricipite femorale. (A) Analisi del modulo di Young del quadricipite femorale; (B) analisi dell'ampiezza della singola contrazione del quadricipite femorale; (C) analisi dell'ampiezza della contrazione tetanica del quadricipite femorale. I valori sono espressi ± SD. N = 6 per gruppo. Rispetto al corrispondente gruppo di controllo: *P < 0,05 e **P < 0,01; rispetto al gruppo di modelli corrispondente: #P < 0,05 e ##P < 0,01. Abbreviazione: KOA = artrosi del ginocchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Proprietà meccaniche del tendine del quadricipite. (A) Analisi del carico a rottura del tendine del quadricipite; (B) analisi dello spostamento massimo del tendine del quadricipite; (C) analisi della rigidezza del tendine del quadricipite; (D) rilassamento da sforzo del tendine del quadricipite. I valori sono espressi ± SD. N = 6 per gruppo. Rispetto al corrispondente gruppo di controllo: *P < 0,05 e **P < 0,01; rispetto al gruppo di modelli corrispondente: #P < 0,05 e ##P < 0,01. Abbreviazione: KOA = artrosi del ginocchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Pressione sulla superficie di contatto della cartilagine. (A) Analisi della pressione massima sulla superficie di contatto della cartilagine; (B) analisi della pressione per unità di superficie della superficie di contatto della cartilagine. I valori sono espressi ± SD. N = 6 per gruppo. Abbreviazione: KOA = artrosi del ginocchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Colorazione della cartilagine con Safranina O-Fast verde e punteggio markin della cartilagine. (A) gruppo di controllo, (B) gruppo modello, (C) gruppo di agopotomia, (D) analisi del punteggio markin della cartilagine. I valori sono espressi ± SD. N = 6 per gruppo. Rispetto al gruppo di controllo corrispondente: **P < 0,01; rispetto al gruppo di modelli corrispondente: ##P < 0,01. Barre di scala = 50 μm (A-C). Abbreviazione: KOA = artrosi del ginocchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Io. Struttura | III. Colorazione | ||
| un. Normale | 0 | un. Normale | 0 |
| b. Irregolarità superficiali | 1 | b. Leggera riduzione | 1 |
| c. Pannus e irregolarità superficiali | 2 | c. Riduzione moderata | 2 |
| d. Fessurazioni nella zona di transizione | 3 | d. Riduzione severa | 3 |
| e. Fessurazioni nella zona radiale | 4 | e. Nessun colorante notato | 4 |
| f. Fessurazioni nella zona calcificata | 5 | ||
| g. Disorganizzazione completa | 6 | ||
| II. Cellule | IV. Integrità del marchio di marea | ||
| un. Normale | 0 | un. Intatto | 0 |
| b. Ipercellularità diffusa | 1 | b. Attraversato da vasi sanguigni | 1 |
| c.Clonazione | 2 | ||
| d. Ipocellularità | 3 | ||
Tabella 1: Punteggio Mankin modificato.
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Discussion
Un modello animale appropriato è uno dei fattori chiave per raggiungere gli obiettivi sperimentali e chiarire una specifica questione scientifica. Questo studio si basava sulle teorie di "Zongjin che controlla le ossa e lubrifica le articolazioni" e "squilibrio meccanico" in acupotologia, con l'obiettivo di spiegare la connotazione scientifica dietro il trattamento della KOA "modulando muscoli e tendini per trattare i disturbi ossei" nella terapia di agopotomia. In altre parole, l'agopotomia migliora l'ambiente meccanico anomalo della cartilagine regolando le caratteristiche meccaniche dei tessuti molli intorno al ginocchio per ritardare la degenerazione e proteggere la cartilagine. I modelli animali KOA sono generalmente classificati in due categorie: modelli spontanei e indotti. I modelli KOA spontanei sono meno utilizzati a causa della durata relativamente lunga della modellazione e delle maggiori limitazioni. I modelli di KOA indotti possono essere stabiliti mediante approcci chirurgici (ad esempio, metodo di Hulth modificato, meniscectomia, rottura del legamento crociato anteriore, iniezione intra-articolare e immobilizzazione articolare). I metodi chirurgici, tra cui il taglio del legamento collaterale mediale, del legamento crociato anteriore, la rimozione del menisco mediale e di altre strutture, vengono utilizzati per destabilizzare l'articolazione del ginocchio, il che porterà a uno squilibrio meccanico interno e all'attrito diretto tra le superfici articolari, inducendo così KOA11. Questo tipo di modello è più adatto per lo studio dell'artrite traumatica. L'iniezione intra-articolare fornisce il farmaco alla cavità dell'articolazione del ginocchio per indurre l'infiammazione, i disturbi metabolici dei condrociti e le reazioni tossiche dei condrociti nella cavità articolare, sviluppando così KOA e avendo scarso effetto sullo stress articolare12. L'immobilizzazione articolare sviluppa ed esacerba la degenerazione della cartilagine articolare limitando il movimento dell'articolazione del ginocchio causando atrofia dei muscoli e dei legamenti intorno al ginocchio, con conseguenti cambiamenti nello stress articolare, stabilendo così un modello KOA12.
Il metodo Videman modificato è un metodo di immobilizzazione articolare, che è più in linea con il processo patologico di KOA causato dalla debolezza dei muscoli del ginocchio umano, come si vede nell'atrofia in disuso dei muscoli e dei legamenti del ginocchio immobilizzando il ginocchio in una posizione troppo estesa, con conseguenti cambiamenti nello stress articolare e nella degenerazione della cartilagine. Rispetto ai metodi chirurgici che causano instabilità articolare con conseguente KOA, il metodo Videman modificato è più in linea con la patogenesi naturale del KOA in cui la lesione tendinea è la prima fase, seguita dalla malattia tendinea e ossea; È, quindi, più adatto a questo studio13. Poiché l'effetto dell'acupotomia nel trattamento della KOA in fase iniziale o intermedia è più evidente, il tempo di stampaggio è di 6 settimane, il che è coerente con i cambiamenti patologici della KOA in fase intermedia. Nel processo di induzione del modello, la frenata prolungata in sovraestensione può portare all'atrofia in disuso dei muscoli intorno all'articolazione del ginocchio e il disagio all'arto posteriore sinistro spesso fa sì che i conigli rosicchiano gli apparecchi modello. Poiché gli apparecchi modello possono essere allentati, è necessario controllare regolarmente la tenuta del dispositivo di tipo coniglio e rinforzarli in tempo. Inoltre, è necessario prestare sempre attenzione all'afflusso di sangue agli arti del coniglio, al gonfiore, alle lesioni cutanee e ai sintomi del tratto digestivo e, se necessario, rimuovere gli apparecchi modello. Poiché i conigli sono in uno stato di anestesia durante questo processo, è necessario tenere i conigli al caldo e prestare attenzione allo stato dei conigli in tempo reale fino a quando i conigli non si svegliano.
L'agopotomia comporta una funzione di bisturi in aggiunta all'ago di agopuntura esistente, utilizzando il concetto di agopuntura per penetrare nel corpo, con effetti di taglio e separazione superiori a un ago per agopuntura mentre porta molto meno trauma al corpo umano rispetto a un bisturi14. L'acupotomologia ritiene che la causa principale del KOA sia lo squilibrio meccanico dovuto al danno ai tessuti molli intorno all'articolazione del ginocchio. Pertanto, la chiave per trattare la KOA con l'agopotomia è ripristinare l'equilibrio meccanico dell'articolazione del ginocchio. Per quanto riguarda la selezione dei punti di trattamento, da un lato, l'agopotomia si basa sulla teoria dei meridiani e dei tendini e assume come punto di agopuntura la località dolorosa. D'altra parte, l'agopotomia è guidata dall'anatomia e dalla biomeccanica moderne e ritiene che il danno ai tessuti molli intorno all'articolazione del ginocchio causi adesione e contrazione, che distrugge l'equilibrio meccanico dell'articolazione del ginocchio e produce punti di stress elevati nell'articolazione. Pertanto, l'adesione tissutale, la contrazione e i punti di stress elevato sono spesso considerati come punti di trattamento15,16.
L'analisi biomeccanica dei tessuti molli mostra che i punti di attacco dei tendini e delle ossa sono per lo più quelli in cui si concentrano le sollecitazioni dei tessuti molli, chiamata anche concentrazione dello stress, e dove si producono facilmente prodotti patologici come aderenze, contratture e noduli simili a corde17. Inoltre, la pratica clinica ha dimostrato che i punti dolenti riscontrati dalla palpazione spesso si sovrappongono ai punti di attacco dei tendini e delle ossa. Pertanto, questo studio ha scelto l'inserzione tendinea del vasto mediale, del vasto laterale, del retto femorale, del bicipite femorale e della borsa anserina. Sebbene l'agopotomia causi meno traumi ai tessuti, è comunque un metodo di intervento invasivo. Durante l'intervento, è necessario seguire rigorosamente la procedura in quattro fasi dell'acupotomia: posizione, direzione, pressatura-rilascio e puntura. Inoltre, gli utenti devono prestare attenzione al grado di rilassamento e alla frequenza del trattamento di ogni intervento. Si consiglia di rilasciare ogni punto di trattamento 2-3 volte una volta alla settimana per evitare danni eccessivi ai tessuti. Al termine dell'intervento di agopotomia, l'articolazione del ginocchio dell'arto posteriore sinistro del coniglio viene nuovamente disinfettata e vengono applicati dei cerotti al punto di ingresso dell'agopotomia.
La stabilità delle articolazioni del ginocchio è un prerequisito per mantenere l'equilibrio meccanico e per eseguire i normali movimenti fisiologici18. I muscoli e i tendini - fattori importanti per il mantenimento della stabilità dell'articolazione del ginocchio - sono strutture tissutali viscoelastiche che determinano le diverse proprietà meccaniche dei muscoli in contrazione e trazione passiva, che sono componenti importanti delle proprietà meccaniche dei muscoli e garantiscono la normale funzione motoria dei muscoli. Il modulo di elasticità, indicatore delle proprietà meccaniche dei tessuti molli, è correlato positivamente con i cambiamenti nella funzione meccanica del quadricipite femorale19. Fisiologicamente, la contrazione del muscolo scheletrico comprende due forme: contrazione singola e contrazione tetanica. Il primo è l'unità di base dell'attività muscolare, mentre il secondo produce principalmente un movimento fluido dei muscoli scheletrici. Pertanto, l'ampiezza massima della contrazione singola e tetanica è comunemente utilizzata per valutare la funzione contrattile muscolare.
L'atrofia del muscolo scheletrico da disuso porta a una riduzione della contrazione tetanica e a una contrazione volontaria massimale, indicando una diminuzione della capacità contrattile muscolare20. Il calo della forza muscolare può danneggiare la funzione dei tendini, manifestandosi come una diminuzione della viscoelasticità tendinea e una diminuzione della capacità dei tendini di resistere alla deformazione8. In condizioni patologiche, il rilassamento dello stress e le proprietà di trazione dei tendini possono diminuire, causando la perdita di equilibrio dell'articolazione del ginocchio e accelerando lo sviluppo di KOA. Pertanto, in questo studio, sono stati selezionati il modulo elastico, l'ampiezza della contrazione singola, l'ampiezza della contrazione tetanica del quadricipite, le caratteristiche di trazione del tendine del quadricipite come il carico massimo, lo spostamento massimo, la rigidità e il rilassamento da sforzo del tendine del quadricipite per valutare l'effetto dell'agopotomia sulle proprietà meccaniche del quadricipite. Il test da sforzo e pressione dell'area di appoggio della cartilagine e la colorazione Safranina O/Fast Green della cartilagine dell'articolazione del ginocchio sono stati utilizzati per valutare se la terapia di agopotomia migliorasse le proprietà meccaniche del quadricipite femorale ed esercitasse un effetto protettivo sulla cartilagine. I risultati sperimentali mostrano che l'agopotomia combinata con la teoria della "modulazione di muscoli e tendini per trattare i disturbi ossei" può migliorare l'ambiente di stress della cartilagine, ritardare la degenerazione della cartilagine e avere un effetto protettivo sulla cartilagine modulando le proprietà meccaniche dei muscoli e dei tendini dei quadricipiti.
Ci sono alcune limitazioni a questo esperimento. Da un lato, non abbiamo valutato il disallineamento del ginocchio e il suo effetto sugli squilibri biomeccanici del ginocchio. D'altra parte, questo studio ha scelto il metodo Videman modificato di immobilizzazione dell'estensione dell'arto posteriore sinistro per la modellazione KOA per chiarire il ruolo dell'agopotomia nel ritardare la degenerazione della cartilagine modulando le proprietà meccaniche dei tessuti molli intorno al ginocchio. Tuttavia, il ruolo dell'agopotomia nell'artrosi del ginocchio causata da fattori traumatici, come le lesioni legamentose e meniscali, non è stato studiato. Inoltre, l'intervento di agopotomia è una sorta di chirurgia chiusa e minimamente invasiva. In questo studio, sia gli interventi di palpazione che quelli di agopotomia sono stati eseguiti senza esporre il tessuto malato in condizioni di visione non diretta. Per ridurre l'impatto dei fattori soggettivi sui risultati sperimentali, sia l'intervento di palpazione che quello di agopotomia sono stati eseguiti dallo stesso personale. Pertanto, sebbene vi siano alcune limitazioni, esse non pregiudicano l'affidabilità delle conclusioni di questo studio.
In sintesi, questo articolo descrive in dettaglio l'induzione del modello KOA con il metodo Videman modificato (immobilizzazione dell'estensione dell'arto posteriore sinistro) e l'intervento di agopotomia. Mostra inoltre l'analisi del meccanismo del trattamento di agopotomia per KOA attraverso esperimenti sul modulo elastico e sulla funzione contrattile del quadricipite, le caratteristiche meccaniche del tendine del quadricipite, la forza e la pressione dell'area di appoggio della cartilagine articolare e la colorazione Safranina O/Fast Green della cartilagine dell'articolazione del ginocchio. Lo studio del meccanismo dell'acupotomia per migliorare le proprietà biomeccaniche dei tessuti molli può fornire nuove informazioni sul trattamento della KOA e di altre lesioni sistemiche legate allo sport.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (No.82074523,82104996).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0.4 x 40 mm | |
| Connect Cast Orthopedic Casting Tape | Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd. | KCP06 | 15.0 cm x 360 cm |
| Double-sided Foam Tape | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 mm x 5 yard x 2.5 mm |
| Environmental Dewaxing Solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1128 | |
| Ethanol absolute | Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fast Green solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma,America | 2353-45-9 | |
| Fatigue testing machine | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Four-channel physiological recorder | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japan | ||
| FPD-306E | Fuji, Japan | ||
| Hematoxylin solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1005 | |
| Medical iodophor disinfectant | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Medical Tape | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | 1.5 x 500 cm |
| Muscle tension transducer | Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | |
| Prescale | Fuji, Japan | ||
| Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument | SuperSonic Imagine SA,France | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | WG10004160 | |
| Safranine O | Sigma,America | 477-73-6 | |
| Safranine O solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1015 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) | IBM, America |
References
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