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研究人类皮下脂肪组织中脂肪内皮细胞与脂肪细胞的相互作用

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DOI：

10.3791/66608

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2024年4月5日

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1Leeds Institute of Cardiovascular and Metabolic Medicine, University of Leeds

本文内容

摘要

本文介绍了一种从人皮下脂肪组织中分离、培养和表型鉴定微血管内皮细胞（hSATMVECs）的实验方案。此外，还描述了一种hSATMVECs与脂肪细胞相互作用的实验模型。

摘要

微血管内皮细胞（MVECs）具有多种关键功能，包括调控血管张力、调节血栓形成以及血管生成。内皮细胞（EC）的基因型和表型存在显著异质性，这取决于其所在的血管床及宿主的疾病状态。从特定组织血管床和不同患者群体中分离MVECs的能力，为直接比较不同疾病状态下MVEC功能提供了可能。本文中，我们利用植入心脏植入式电子设备（CIED）时获取的皮下脂肪组织（SAT），描述了一种分离功能性人皮下脂肪组织微血管内皮细胞（hSATMVEC）纯群体的方法，并建立了一种hSATMVEC-脂肪细胞相互作用的实验模型。

通过使用抗CD31抗体包被的磁珠对SAT进行酶消化，并经磁柱分离，获得hSATMVEC。hSATMVEC在明胶包被的培养板上进行培养和传代。实验使用第2至第4代的细胞。细胞至少在第5代之前均保持内皮细胞典型的形态学特征。流式细胞术分析显示，分离得到的hSATMVEC纯度达99.5%，表型定义为CD31+/CD144+/CD45-。对照组来源的hSATMVEC群体倍增时间约为57小时，并使用细胞增殖成像试剂盒确认其具有活跃的增殖能力。通过检测hSATMVEC对胰岛素刺激的反应及其血管生成管状结构形成潜能，评估其功能。随后，我们建立了hSATMVEC与皮下脂肪细胞的共培养模型，用于研究细胞间的相互作用，并证实hSATMVEC对脂肪细胞功能具有下游调控作用。

可在植入CIED时获取SAT，并从中分离出hSATMVEC，其纯度足以用于实验性表型分析以及hSATMVEC与脂肪细胞相互作用的研究。

引言

内皮细胞（ECs）是呈单层排列、覆盖于血管壁内表面的扁平细胞。它们具有多种重要功能，包括调控血管张力、调节血栓形成、调节炎症反应以及参与血管生成1。鉴于内皮细胞在心血管代谢生理中的重要性，实验中常利用它们来深入理解病理生理机制，并探索心血管代谢疾病的新药治疗方案。

然而，内皮细胞在形态、功能、基因表达以及抗原组成方面存在巨大的异质性，这种异质性取决于其来源血管床的部位2。大动脉来源的内皮细胞最适合用于动脉粥样硬化研究，而来自小血管的内皮细胞，即微血管内皮细胞（MVECs），则更适用于血管生成研究2。理解内皮细胞异质性的分子基础，可能为血管床特异性治疗提供有价值的见解。在多种疾病中，微血管内皮功能也存在显著差异，包括糖尿病、心血管疾病和全身性感染3,4。因此，能够从特定患者群体中分离内皮细胞，使得对其内皮细胞功能及细胞间相互作用进行直接比较成为可能5。

本文介绍一种从心脏植入式电子器械（CIED）植入术时获取的皮下脂肪组织（hSATMVEC）中分离人微血管内皮细胞（MVECs）的新方法。通过酶消化法处理皮下脂肪组织（SAT）后，分离获得的hSATMVEC在明胶包被的培养板上进行培养和传代。随后，我们描述了一系列已成功应用于hSATMVEC的表型鉴定实验方法，以验证其表型特征，并展示其在常规内皮细胞实验中的应用。最后，我们介绍了一种hSATMVEC在hSATMVEC-脂肪细胞相互作用实验模型中的应用。

方案

本技术中使用的人体组织样本取自根据利兹教学医院NHS信托基金（英国利兹）常规临床实践，因符合指南指征而接受CIED植入的患者。研究方案及所有相关文件在受试者入组前已获得当地伦理委员会（11/YH/0291）批准。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。

1. 患者人群

  1. 在植入CIED期间，从覆盖胸大肌的皮下脂肪组织（SAT）获取新鲜的皮下脂肪组织（SAT）。
  2. 在无菌条件下分离SAT样本，并在收集后于超净工作台内严格遵循无菌操作处理组织样本，以防止细菌污染。

2. 内皮细胞的分离与培养

注意：人源脂肪组织微血管内皮细胞（hSATMVEC）分离的示意图见图1。

  1. 对于人皮下脂肪微血管内皮细胞（hSATMVEC）的分离，应使用在CIED植入术中获取的、覆盖胸大肌的皮下脂肪组织（SAT），至少250 mg新鲜组织（参见 图1).
    注意：在分离过程中使用较大量的新鲜SAT可提高hSATMVEC的得率，并最大程度地保证分离及hSATMVEC培养的成功率。
  2. 立即将SAT放入含有冰冻磁激活细胞分选（MACS）组织保存液的1.5 mL微量离心管中，随后转移至实验室。
    注意：为获得最高的成功分离几率 hSATMVEC的分离应尽快进行。然而，如有需要，SAT可在冰上保存最多24小时后再进行分离。
  3. 按如下方法配制1 mg/mL的胶原酶/分散酶工作液。
    1. 首先，将500 mg胶原酶/分散酶冻干粉溶于5 mL无菌水中，配制成浓度为100 mg/mL的胶原酶/分散酶储存液。
    2. 每次分离人滑膜微血管内皮细胞（hSATMVEC）时，将100 µL胶原酶/分散酶储备液加入10 mL冷的Hanks′平衡盐溶液中，稀释成终浓度为1 mg/mL的工作液。
  4. 在超净工作台中，使用两把手术刀将组织切碎至约 1 mm3 将组织块置于培养皿盖内含500 µL 1 mg/mL胶原酶/分散酶溶液中，吹打消化后转移至洁净的50 mL离心管中。
  5. 用 4.5 mL 新鲜的 1 mg/mL 胶原酶/分散酶溶液冲洗培养皿盖，加入 50 mL 离心管中。置于 37 °C、20 rpm 的管式旋转仪中消化 30 分钟。加入 10 mL 完全内皮细胞生长培养基 MV 终止消化反应。
  6. 将消化后的混合物进行吹打混匀，并通过70 µm细胞筛过滤。用10 mL含0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS-BSA）冲洗细胞筛。将样品在300 x g 室温孵育10分钟，弃上清液。再用5 mL 0.5% PBS-BSA重复此步骤一次。
  7. 然后，使用死细胞去除试剂盒去除死细胞。具体操作为：将细胞沉淀重悬于200 µL死细胞去除磁珠中（使用前涡旋振荡），在室温（RT）下于1.5 mL微量离心管中孵育15分钟。
  8. 将配备30 µm滤膜的LS柱连接至分离磁铁下方，并在柱底放置一支15 mL离心管。在加入样品/磁珠悬液前，先用1 mL死细胞去除结合缓冲液冲洗磁柱一次，使其在重力作用下自然流过。
  9. 接下来，加入0.5 mL结合缓冲液洗涤柱子，使其自然流过。重复此洗涤步骤四次。
  10. 收集洗脱液作为活细胞组分，在室温下以300 × g离心10分钟，然后将所得沉淀用400 µL含0.5% BSA的PBS洗涤并重悬。
  11. 向悬浮细胞中加入 20 µL CD31 抗体包被的磁珠，4 °C 孵育 20 分钟。孵育结束后，将样品在 300 x g 在室温下孵育5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于500 µL含0.5% BSA的PBS中。
  12. 将带有30 µm滤膜的MS柱连接至分离磁铁，并在下方放置一个15 mL离心管。用500 µL含0.5% BSA的PBS预洗柱子，重复此步骤两次。
  13. 加入细胞-微珠悬液，使其在重力作用下自然流过柱子。用500 µL含0.5% BSA的PBS溶液洗涤柱子三次。收集柱子下方离心管中的穿流液，其中含有CD31- 组分
  14. 收集CD31+ 组分（即含有hSATMVECs的组分）从分离磁铁上取下MS柱，转移至新的15 mL离心管中。加入1 mL 0.5% PBS-BSA，并用柱塞一次性平稳操作，释放捕获的hSATMVECs。
  15. 将样品在 300 x g 室温孵育5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1 mL完全EC生长培养基MV中，并将1 mL细胞悬液分至一个或两个（根据沉淀大小）经2%明胶包被的24孔板孔中（第0代）。
    注意：分离后的最初几天内贴壁细胞较少时，无需担心。
  16. 每3天更换一次培养基。在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。2待分离的细胞达到约80%融合度（2-4周）后，将其传代至六孔板中的一个孔（第1代）。
    注意：后续操作可将一个汇合的供体孔中的细胞重新接种至受体孔中。实验在细胞传代2-4代且细胞表现出稳定生长特性后进行 >使用流式细胞术检测纯度达99%（见第3节）。细胞在至少传代至第5代前均保持典型的内皮细胞形态。

3. 流式细胞术

  1. 在进行流式细胞术之前，通过肉眼检查人浅表动脉化真皮微血管内皮细胞（hSATMVECs），确保其形态融合且具有代表性。使用6孔板中单个孔的细胞，在第2代时对hSATMVECs进行流式细胞术分析。
  2. 用 PBS 洗涤细胞两次，每次向孔中加入 500 µL PBS，洗涤后吸弃。然后每孔加入 300 µL 温热的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液。置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 2 分钟。
  3. 脱离后，加入700 µL完全EC生长培养基MV以中和胰蛋白酶/EDTA溶液，并转移至1.5 mL微量离心管中。
  4. 将细胞悬液在400 x g 室温孵育8分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。随后，将细胞沉淀重悬于1 mL MACS缓冲液中，并分装至两个已标记为“未染色对照”和“染色样本”的1.5 mL微量离心管中（每管500 µL）。
  5. 向每个微量离心管中额外加入 500 µL MACS 缓冲液，然后再次在 400 x g 室温下持续 8 分钟。
  6. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 µL MACS缓冲液（用于未染色对照）或100 µL染色混合液中（补充表1对染色样本进行检测。使用CD45-FITC（泛白细胞标志物）、CD144-PE和CD31-PerCP（内皮细胞表达的标志物）对细胞进行染色。
  7. 短暂涡旋振荡悬浮细胞5秒，然后在4 °C孵育10分钟。接着向每管中加入1 mL MACS缓冲液，再次在400 x g 室温孵育8分钟，弃去上清液。
  8. 最后，将细胞沉淀重悬于500 µL MACS缓冲液中，并转移至新的1.5 mL离心管中。将标记好的离心管放入带盖的冰盒中，置于冰上待分析。
    注意：所有包含的流式细胞术分析均在贝克曼库尔特Cytoflex四激光流式细胞仪系统上进行（仅使用488 nm激发激光）。
  9. 为每种荧光染料设置最大发射波长和滤光片参数如下：CD45-FITC - 最大发射波长 520 nm，滤光片 525/50；CD144-PE - 最大发射波长 578 nm，滤光片 585/40；CD31-PerCP - 最大发射波长 675 nm，滤光片 655-730。
  10. 如图所示 图2，每个样本在单细胞门控（P2）中记录10,000个细胞的数据。检查P1是否包围主要的细胞簇，并确认其中大多数细胞位于P2单细胞门控内。确保未染色对照样本中CD45信号极弱。-CD144+CD31+ 细胞占单细胞的比例（%）
  11. 记录染色样本中CD45-CD144+CD31+细胞单细胞群的百分比。

4. 内皮细胞倍增时间与细胞增殖（图3）

  1. 在第2代和第3代时，使用血细胞计数板对每个样本的活hSATMVECs数量进行计数。记录每次细胞计数的日期和时间。
  2. 根据以下公式计算这两个时间点之间的群体倍增次数：倍增时间 = (持续时间 × log(2)) / (log(终浓度) - log(初始浓度))。
    注：可使用在线计算器，网址为 https://doubling-time.com/compute.php。
  3. 使用 commercially available 的细胞增殖成像试剂盒评估hSATMVECs的增殖能力。将hSATMVECs以每孔20,000个细胞的密度接种于24孔板中，并在完全EC生长培养基MV中过夜培养，使其恢复。
  4. 次日，将5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）用完全EC生长培养基MV稀释至终浓度10 µM，加入各孔中。在37 °C（5% CO2）条件下孵育2小时。
  5. 移除含EdU的培养基，每孔用PBS洗涤两次。在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。再次用PBS洗涤每孔两次，然后每孔加入500 µL含0.5% Triton X-100的Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液，在室温下孵育20分钟。
    注：此步骤可通透细胞膜，使Alexa Fluor 488标记的叠氮化物进入细胞。
  6. 根据制造商说明书配制Alexa Fluor 488标记的叠氮化物反应液（具体见6）。在加入100 µL该反应液前，先用PBS洗涤每孔两次，然后在避光条件下于室温孵育30分钟。
    注：Alexa Fluor 488标记的叠氮化物反应液通过“点击化学”反应与EdU结合。
  7. 移除Alexa Fluor 488标记的叠氮化物反应液，用PBS洗涤两次。每孔加入500 µL碘化丙啶，室温孵育20分钟。
    注：此步骤将所有细胞核（包括增殖和非增殖细胞）染成红色。
    移除碘化丙啶溶液，用PBS洗涤两次，每孔保留500 µL PBS用于成像。
  8. 在10倍物镜下，对每孔选取4个高倍视野进行成像，检测488 nm叠氮化物的激发/发射波长为495/519 nm（见图3C）。
    注：图中所示图像使用活细胞分析系统在10倍放大、曝光时间800 ms的条件下采集。
  9. 统计每个高倍视野中增殖细胞（绿色）的数量，并以占总细胞数的百分比（%）表示（每孔取4个区域的平均值）。

5. 内皮细胞管状结构形成

  1. 将Matrigel（基底膜基质；BMM）置于冰上过夜解冻。次日，在冰上操作，根据需要向24孔板的每孔中加入160 µL BMM。倾斜培养板，使BMM完全覆盖每孔表面。将培养板放入37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育，同时准备细胞。
  2. 每孔接种100,000个hSATMVECs细胞（溶于1 mL培养基中）。加样时沿孔壁缓慢吹打，避免冲击导致基质脱落。将培养板置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育4小时。
    注意：此时培养板已可用于成像。以下结果和图示采用活细胞分析系统在10倍放大倍数下对5个不同孔区域进行的相差成像（见图3D）。
  3. 计数每个高倍视野中的完整管状结构数量，并计算每个样本的平均值。

6. 胰岛素对 hSATMVEC 的刺激作用

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，将hSATMVEC接种于6孔板中培养。待细胞融合后，弃去完全内皮细胞生长培养基MV，并用PBS洗涤两次。
  2. 每孔加入500 µL无血清饥饿培养基（即不含添加剂的内皮细胞生长培养基MV），在37 °C、5% CO2条件下孵育4小时。在此期间，用无血清饥饿培养基配制一系列浓度递增的胰岛素溶液（0–150 µM），每份500 µL。
  3. 细胞饥饿处理4小时后，吸去孔中培养基，每孔加入1 mL含不同浓度胰岛素的培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续孵育10分钟。
  4. 用预冷的PBS洗涤两次，然后每孔加入100 µL含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解缓冲液，裂解细胞以提取蛋白。使用BCA法测定蛋白浓度。
    注意：在下述实验中，细胞裂解物在冰浴中孵育30分钟，随后在20,000 × g离心15分钟。电泳前，蛋白样品在95 °C加热5分钟以变性。蛋白在NuPAGE 4–12% Bis-Tris凝胶上分离后，转移至硝酸纤维素膜。根据标准操作流程，使用相应的磷酸化蛋白抗体和总蛋白抗体进行免疫印迹分析（遵循生产商说明书）。选用合适的Ig/HRP二抗检测一抗（遵循生产商说明书）。通过密度测定法，根据各样品条带强度定量蛋白水平。必要时以ß-actin作为上样对照。

7. hSATMVEC-脂肪细胞共培养体系的建立 (图4)

注意：在以下结果中，所有脂肪细胞检测均使用来自单一高加索男性供体、第2代的市售人白色皮下前脂肪细胞。前脂肪细胞最初由供应商提供的冻存管（第0代）扩增至十二个含有冷冻-SFM冻存培养基的冻存管中（第1代）。

  1. 每个24孔共培养板需要一管前脂肪细胞（第1代）。快速解冻每管细胞，并接种至含有12–15 mL温热PGM-2培养基（含10%胎牛血清、30 µg/mL L-谷氨酰胺和15 ng/mL GA-1000 SingleQuots）的T75培养瓶中。每3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到90%。
  2. 当细胞融合度达到90%时，用PBS洗涤人白色皮下前脂肪细胞，然后加入1 mL胰蛋白酶/EDTA溶液（0.25%）。室温孵育2分钟，并通过光学显微镜确认细胞脱落。加入23 mL PGM-2培养基以中和胰蛋白酶/EDTA，制成24 mL的悬浮前脂肪细胞溶液。
  3. 将1 mL悬浮的人白色皮下前脂肪细胞溶液加入24孔共培养配套板的每个孔中，培养至完全融合（通常需2–3天）。
  4. 在细胞生长至融合的过程中，准备前脂肪细胞分化培养基（PDM）。配制PDM时，将胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和异丁基甲基黄嘌呤的专有混合物加入PGM基础培养基中，制成2倍浓度的PDM储备液。再将2倍浓度PDM与PGM按1:1比例稀释，得到1倍浓度PDM。
  5. 细胞融合后，通过更换为每孔1 mL的1倍浓度PDM培养基启动人白色皮下前脂肪细胞的分化（第0天）。将人白色皮下前脂肪细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育10天（期间不更换培养基），以完成完全分化。使用相差显微镜监测分化过程（见图4B）。
    注意：已分化的脂肪细胞无法传代，可用于第10至第12天的功能检测。脂肪细胞分化可通过扩增瘦素、脂联素和PPAR-γ的mRNA进行评估。
  6. 在分化第6天，以每孔5 × 104个细胞的密度，将hSATMVECs接种于Transwell小室（0.4 µm膜）中，每孔加入500 µL完整的内皮细胞生长培养基MV。将Transwell小室放入含有500 µL完整内皮细胞生长培养基MV的24孔板孔中，在37 °C、5% CO2条件下培养至细胞融合。
  7. 第10天，当脂肪细胞已完全分化时，移除每个孔中一半的PDM培养基，并将含有融合hSATMVECs及其自身培养基（ECGM-MV）的Transwell小室转移至各孔中（见图4A）。
  8. 共培养24小时后，移除Transwell小室，对脂肪细胞功能进行检测。
    注意：在此时间点，如需进行蛋白或RNA提取，也可对脂肪细胞进行裂解。

8. 脂肪细胞 2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖（2-NBD-葡萄糖）摄取

  1. 共培养24小时后，移除含有hSATMVEC的细胞小室。随后，在每孔培养基中加入2-NBD-葡萄糖，使其终浓度为20 µM。避光，于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。
  2. 用PBS洗涤细胞两次，然后加入500 µL的4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定脂肪细胞15分钟。再次用PBS洗涤细胞三次，最后保留100 µL PBS于孔中。
    注意：此时脂肪细胞已准备好进行成像。在附带的图示中，使用活细胞分析系统在10倍放大倍数下，于四个高倍视野中获取了相差图像和绿色荧光图像（激发波长440–480 nm，发射波长504–544 nm）（见图4C）。
  3. 使用ImageJ（或其他类似软件）通过设定阈值分析总区域中绿色部分的百分比，以定量葡萄糖摄取水平。

结果

hSATMVEC 的纯度和表型
来自对照组患者（即无心脑血管代谢性疾病病史者）的分离 hSATMVEC 在流式细胞术检测中 CD31+CD144+CD45- 的比例为 99.5%（图 2）。分离得到的 hSATMVEC 呈典型的内皮细胞（ECs）鹅卵石样形态（图 3A）。hSATMVEC 的平均群体倍增时间为 56.6 h ± 8.1 h（均值 ± 标准误，n = 10）（图 3B），并通过细胞增殖成像试剂盒证实了 hSATMVEC 中活跃的 DNA 复制（图 3C）。

hSATMVEC 的行为类似于功能性 MVEC，并在 Matrigel 中形成管状结构（图 3D）。胰岛素信号通路 Akt-eNOS 中关键蛋白的相对表达水平如 图 3E 所示。eNOS 和 Akt 均表现出胰岛素诱导的磷酸化水平升高，以磷酸化蛋白/总蛋白的比值相对于 ß-actin 进行标准化表示（图 3E）。

人皮下脂肪微血管内皮细胞与脂肪细胞共培养
可在图4A中看到人皮下脂肪微血管内皮细胞与脂肪细胞共培养的示意图。随着人皮下白色前脂肪细胞的分化程度提高，可观察到脂质空泡的形成（图4B），并通过油红O染色进行定量分析（图4B）。

分化后的脂肪细胞经 20 µM 2-NBD 葡萄糖孵育 30 分钟后，明示的相差显微镜与荧光成像（激发波长 440–480 nm/发射波长 504–544 nm）如图所示 图4C通过测量绿色区域占细胞总面积的百分比，可定量葡萄糖的摄取量。

皮下脂肪组织分离，使用磁珠分离CD31+细胞，内皮细胞培养示意图
图1：人皮下脂肪组织微血管内皮细胞（hSATMVECs）的分离与处理流程示意图 请点击此处查看该图的放大版本。

使用散点图和直方图进行流式细胞术数据分析；细胞群体区分。
图 2：培养的人皮下脂肪组织微血管内皮细胞（hSATMVECs）流式细胞术分析的典型结果。 （A）侧向散射面积（SSC-A）与前向散射面积（FSC-A）的散点图，显示在特定细胞群密度周围对培养的 hSATMVECs 进行设门（红框）。（B）前向散射宽度（FSC-Width）与 FSC-A 的散点图，显示在特定细胞群密度周围对培养的 hSATMVECs 进行设门（红框）。（C）门控细胞 CD45-FITC 荧光的直方图。（D）CD144-PE（x 轴）与 CD31-PerCP（y 轴）荧光强度的散点图。（E）门控细胞 CD144-PE 荧光的直方图。（F）门控细胞 CD31-PerCP 荧光的直方图。 请点击此处查看该图的放大版本。

hSATMVEC 细胞；鹅卵石样外观、倍增时间、增殖、成管、胰岛素信号传导。
图 3：hSATMVEC 表型。（A）接近汇合的 hSATMVEC 光学显微镜图像，显示鹅卵石样外观。（B）hSATMVEC 倍增时间——相隔 24 小时拍摄的 HATEC 光学显微镜图像，显示细胞增殖程度。（C）hSATMVEC 增殖。来自对照受试者的 hSATMVEC 细胞经碘化丙啶和 EdU/Alexa-fluor 488 染色后的荧光显微镜图像。（D）来自对照受试者的 hSATMVEC 成管能力（图像以 4 倍放大倍数拍摄）。（E）HATEC 的胰岛素刺激——显示在胰岛素浓度递增条件下，磷酸化 Akt（丝氨酸 473）与总 Akt 的相对表达量（左图），以及磷酸化 eNOS（丝氨酸 1177）与总 eNOS 的相对表达量（右图），下方为经 β-actin 标准化的代表性 Western 印迹图。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。各样本量标注于各图下方。缩写：5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）、人皮下脂肪组织微血管内皮细胞（hSATMVEC）、标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

hSATMVEC/脂肪细胞共培养示意图、脂肪细胞分化结果、葡萄糖摄取分析。
图4：hSATMVEC-脂肪细胞共培养。（A）hSATMVEC-脂肪细胞共培养示意图。（B）脂肪细胞的分化。左图显示第0天的前脂肪细胞，右图显示添加PDM后第10天分化的脂肪细胞。下方图像显示经油红O染色后前脂肪细胞和脂肪细胞中储存的脂质含量。（C）葡萄糖摄取实验。左图显示共培养后，与20 µM 2-NBD葡萄糖孵育30分钟的脂肪细胞的相差图像。右图显示绿色荧光图像，据此可定量葡萄糖摄取量（以绿色面积占总面积的百分比表示）。数据以均值±标准误表示。缩写：第10天（D10）、人皮下脂肪组织微血管内皮细胞（hSATMVEC）、前脂肪细胞分化培养基（PDM）请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：流式细胞术染色试剂混合物。 请点击此处下载该文件。

讨论

本研究描述了一种从常规植入CIED期间获取的SAT组织中分离人内脏脂肪组织微血管内皮细胞（hSATMVEC）的技术。我们证明，所分离的hSATMVEC纯度高，表达内皮细胞特异性跨膜蛋白CD144和CD31，且不表达白细胞标志物CD45。进一步研究表明，分离得到的hSATMVEC能够以可重复且可靠的方式增殖，可用于实验研究胰岛素信号转导和血管生成过程中涉及的细胞内机制。除了可进行单独培养外，这些细胞还可用于共培养体系，以研究hSATMVEC与脂肪细胞之间的相互作用。

基础研究和转化研究中使用的内皮细胞通常来源于大血管（如主动脉和人脐静脉）或微血管。这些来源各自存在一定的局限性7,8：大血管来源的内皮细胞要么难以获取（如主动脉组织），要么来源于新生儿组织，其生理特征和环境暴露情况可能存在差异9。利用从植入心血管植入型电子器械（CIED）手术过程中获取的组织分离出的内皮细胞，可针对特定真实患者群体的细胞生理学进行研究和实验。CIED的植入适应证多种多样，包括用于治疗心动过缓性心律失常、心力衰竭以及室性快速性心律失常的原发性和继发性预防10。这些患者常合并多种共病，如糖尿病、肥胖和冠状动脉疾病，而这些疾病正是当前全球心血管研究的重点11,12,13。此外，尽管本文中的示例数据来自对照患者，但我们已将这些技术应用于从多种患者（包括患有重度心力衰竭和/或2型糖尿病患者）中分离并研究皮下脂肪微血管内皮细胞（SATMVEC）。

在尝试分离细胞后，我们时常遇到人内脏脂肪微血管内皮细胞（hSATMVEC）得率较低的问题。通过使用更大体积的内脏脂肪组织（SAT）作为起始材料来分离hSATMVEC，可显著降低这一风险。此外，我们在患有 cardiometabolic 疾病（尤其是糖尿病）个体的SAT中更常遇到此类问题。

该技术的一个局限性在于，分离得到的人肺小动脉内皮细胞（hSATMVEC）只能进行有限次数的传代。根据我们的经验，无论患者表型如何，hSATMVEC在第5代之后增殖速度显著减慢。此外，采用该技术分离的hSATMVEC在密度过低时增殖效果不佳；因此，我们建议传代时比例不要超过1:6，如第1页所述。我们已成功复苏保存于液氮中长达4年的hSATMVEC，根据我们的经验，在较低代次进行冻存时，细胞复苏成功率更高（我们通常在第2代时对hSATMVEC进行冻存）。

在植入CIED时获取的组织可自由获得，且采集过程对患者无任何损害。因此，从这些患者群体中获取易于接近、相对非侵入性的内皮细胞来源，对于开展靶向研究具有重要意义。尽管本文中的代表性图像来自“对照组”患者（即无心力衰竭或糖尿病诊断，但有CIED植入指征的患者），我们已成功从心力衰竭、糖尿病以及同时患有这两种疾病的患者中分离、培养并共培养了SATMVECs。此外，这些技术也可应用于其他微血管床，包括骨骼肌，目前我们正在优化骨骼肌MVEC-肌细胞间的相互作用模型。

可在植入CIED时从人体组织中分离出hSATMVECs，其纯度足以用于实验研究，以探讨患有和未患 cardiometabolic 疾病人群中微血管功能障碍及内皮细胞与脂肪细胞之间的相互作用。

披露

SS 已从阿斯利康获得非经济支持、演讲者费用和酬金。RC 已从强生肿瘤学部门获得演讲者费用。OIB 已从诺华获得演讲者费用。

致谢

我们非常感谢利兹大学（英国）生物科学学院生物成像部门提供流式细胞术实验平台的支持，该平台获得了生物技术和生物科学研究理事会资助（BBSRC BB/R000352/1）。SS 获得了英国心脏基金会临床研究培训奖学金（FS/CRTF/20/24071）的支持。CL 获得了英国心脏基金会博士生奖学金（FS/19/59/34896）的支持。LDR 获得了英国糖尿病学会 RD Lawrence 奖学金（16/0005382）的支持。RMC 获得了英国心脏基金会中级临床研究奖学金（FS/12/80/29821）的支持。MTK 是英国心脏基金会心血管与糖尿病研究教授（CH/13/1/30086），并持有英国心脏基金会项目资助（RG/F/22/110076）

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
170L CO2 培养箱GS Biotech170G-014
2-NBDG（2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖）InvitrogenN13195
4% PARAFIX 缓冲组织固定液VWR ChemicalsPRC/R/38/1
Akt（tAkt）兔  1:1000细胞信号技术9272
BD Venflon Pro Safety 14 号 × 45 毫米，橙色，50 个/包Medisave393230
7.5% 牛血清白蛋白溶液默克A8412-100ML
CD144 （血管内皮钙黏蛋白）抗体，抗人，PE，REAfinityMiltenyi Biotec130-118-495
CD31 抗体，抗人，PerCP-Vio 700，REAfinityMiltenyi Biotec130-110-811
CD31 MicroBead 试剂盒，人，1 套Miltenyi Biotec130-091-935
CD45 抗体，抗人，FITC，REAfinityMiltenyi Biotec130-110-769
细胞提取缓冲液InvitrogenFNN0011
Centrifuge 5804 REppendorf5805000060
Click-iT EdU细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 488染料InvitrogenC10337细胞增殖成像试剂盒
胶原酶/分散酶，500 mg罗氏/默克11097113001
康宁基质胶生长因子减少型（GFR）基底膜基质康宁 354230基底膜基质
康宁 100 毫米经组织培养处理的培养皿康宁 430167
Corning 24孔透明组织培养处理多孔板，独立包装，无菌康宁 3526
Corning 6孔透明组织培养处理板，独立包装，无菌康宁 3516
CytoFLEX S – 4激光流式细胞仪贝克曼
死细胞去除试剂盒Miltenyi Biotec130-090-101
杜尔贝科′磷酸盐缓冲液默克D8537-500ML
用于50 mL离心管的EASYstrainer细胞筛，孔径70 μm µm 网格，蓝色，无菌，50 个/包Greiner Bio-One542070
内皮细胞生长培养基 MVPromoCellC-22020
Eppendorf Safe-Lock 微量离心管默克EP0030120094
乙二胺四乙酸溶液默克E8008-100ML
Falcon 24孔TC处理细胞培养聚苯乙烯通透性支持板，带盖，无菌，1个/包，50个/箱阿普尔顿伍兹CF537
24孔板用Falcon可渗透支持膜，孔径0.4 µm 透明 PET 膜，无菌，1 片/包，48 包/箱阿普尔顿树林CF521
冷冻保存液 Cryo-SFMPromoCellC-29912
2% 明胶水溶液默克G1393-100ML
Gibco 抗生素-抗真菌素（100倍浓度），100 mLFisher Scientific11570486
Gibco TrypLE Select 酶（1x），无酚红Fisher Scientific12563029
汉克斯′ 平衡盐溶液默克H6648-500ML
人皮下前脂肪细胞LonzaPT-5020
Incucyte ZOOMEssen BioScience活细胞分析系统
人胰岛素溶液默克I9278-5ML
LS 柱，25 个/包Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MACS 组织保存液Miltenyi Biotec130-100-008
MACSmix 管式旋转混匀仪Miltenyi Biotec130-090-753试管旋转仪
MS色谱柱，每包25根Miltenyi Biotec130-042-201
NuPAGE 4–12% Bis-Tris 凝胶InvitrogenNP0322BOX
OctoMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-109
PGM-2 前脂肪细胞生长培养基-2 BulletKitLonzaPT-8002
磷酸化（Ser1177）eNOS 兔单克隆抗体 1:1000细胞信号技术公司9570
磷酸化 Akt（Ser473）兔多克隆抗体  1:1000细胞信号技术公司4060
预分离滤器 30 µ米，50个/包Miltenyi Biotec130-041-407
碘化丙啶（PI）/RNase 染色液Cell Signalling Technology4087
QuadroMACS 分选仪Miltenyi Biotec130-090-976
一次性无菌手术刀，型号10VWRI501
螺口盖离心管，15 ml，(LxØ）：120 × 17 mm，聚丙烯材质，带印刷Sarstetd62.554.502
50 ml 螺口管，(LxØ）：114 × 28 毫米，聚丙烯材质，带印刷Sarstedt62.547.254
50 ml 螺口管 (LxØ）：114 × 28 毫米，聚丙烯材质，带印刷Sarstetd62.547.254
总eNOS小鼠 1:1000BD 生物科学610297
Triton X-100，BioUltra，用于分子生物学默克93443-500ML
β-肌动蛋白 (C4) 小鼠 1:5000Santa Cruz Biotechnology Sc-47778

参考文献

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