5.10: 细胞周期分析:使用CFSE染色和流细胞测定法评估刺激后CD4和CD8 T细胞增殖

1. 准备

1. 开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
2. 消毒所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后彻底擦干。
3. 准备 50 mL 的汉克平衡盐溶液 （HBSS） 含有 2% 胎儿小牛血清 （FCS）。

2. 解剖

1. 使用二氧化碳输送系统，用缺氧对小鼠实施安乐死。将安乐死小鼠固定在上部位置的解剖板上，并使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术。
2. 使用钳子，移动腹部右侧的肠道和胃，露出胃和脾脏。脾脏附着在胃上。
3. 使用钳子小心地从胃分离脾脏，并将其放入含有 5 mL 的 HBSS 2% FCS 的培养皿中。

3. 免疫细胞隔离

1. 将脾脏放在40μm细胞滤网上，放在同一个培养皿上。用柱塞压碎脾脏以将其分离。
2. 将分离的脾脏和液体转移到15 mL离心管中。
3. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
4. 将颗粒重新悬浮在2 mL的醋酸钾中，以赖解红细胞。等待 2 分钟，然后用 HBSS 2% FCS 将音量补至 15 mL。
5. 在 10°C 下，在 370 x g下再次将管离心 7 分钟。丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在 5 mL 的 HBSS 2% FCS 中。

对于大多数免疫学研究，测量免疫细胞的增殖是一个关键步骤，通常使用基于 CFSE 荧光染料的方法。适当的细胞分裂对免疫细胞很重要，因为它调节免疫反应的水平和特异性。例如，T 细胞增殖以识别和杀死癌细胞，而 B 细胞经过细胞分裂以产生特异性抗体。CSFE 检测的总体前提是用绿色荧光染料 CFSE 对细胞进行染色，CFSE 进入活细胞并与内部的蛋白质稳定结合，从而实现永久标记。因此，当含有染料的亲本细胞分裂时，每个子细胞都会从亲本细胞获得一半的荧光。

这个过程在随后的分裂中继续进行，染料强度随着每次分裂而逐渐降低。在所需的终点，通过流式细胞术测量每个细胞的荧光强度。然后使用这些数据来量化细胞经历的分裂次数和模式。如此处所示，具有最高荧光的细胞群来自亲代。第二高属于第二代，依此类推。峰的数量决定了细胞分裂的次数。

此外，如果使用原代免疫细胞，则可以用不同颜色的荧光染料和 CFSE 标记特定细胞群，例如 T 细胞，并同时使用多色流式细胞术进行鉴定。新数据可以绘制在同一张图上，现在显示了具有不同 CFSE 染色强度的 T 细胞亚群，通过该亚群可以特异性分析 T 细胞的增殖速率。该视频演示了小鼠脾细胞的 CFSE 染色方案，这些脾细胞用抗 CD3 抗体刺激。然后进行染色以标记 T 细胞和流式细胞术以跟踪其细胞增殖。

首先，穿上适当的防护服和实验室手套。接下来，先用清洁剂清洗一把镊子和解剖剪刀，然后用 70% 乙醇清洗，然后用干净的纸巾擦干。通过将 1 毫升 FCS 与 49 毫升 HBSS 混合在一个 50 毫升试管中，制备 50 毫升 Hank's 平衡盐溶液 （HBSS） 和 2% 浓度的胎牛血清 （FCS）。轻轻上下吹打溶液约 10 次，混匀。然后，如FACS分离脾B淋巴细胞的视频方案所示，分离小鼠脾细胞。

标记四个 15 毫升管 1 到 4 个，然后向第七个分离的脾细胞添加 1 乘以 10。接下来，向每个试管中加入 3 毫升 HBSS 2% FCS。然后，将 1 微升 5 微摩尔羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （CFSE） 移液到每个试管中。将试管在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育 10 分钟。管 1 和 2 中的细胞不会受到刺激。它们将用于揭示脾 CD4 和 CD8 T 细胞的基础增殖水平。

将 10 毫升 HBSS 2% FCS 移液到这些管中。第 3 管和第 4 管将受到抗 CD3 抗体的刺激，以观察对细胞周期的影响。将 10 毫升 HBSS、2% FCS 和终浓度为 2.5 μg/mL 的抗 CD3 抗体加入试管 3 和 4 中。接下来，将所有试管在 10 摄氏度下以 370 x g 离心 7 分钟。丢弃上清液。将沉淀重悬于两毫升 HBSS 2% FCS 中，并将所得溶液移液到六孔板上的单独孔中。仔细地从一到四标记板，以跟踪样品身份。将细胞在 37 摄氏度和 5% CO 2 下孵育三天。

第三天，向 1 号和 3 号孔中加入 2 毫升 HBSS 2% FCS，其中应包含来自试管 1 和 3 的细胞。用力上下移液，然后将样品转移到标记的 5 毫升 FACS 管中。将六孔板放回培养箱中。来自孔 2 和 4 的这些剩余细胞将在第 5 天进行分析，以研究刺激对细胞周期的长期影响。将试管在 10 °C 下以 370 x g 离心 7 分钟，然后弃去上清液。现在，向每个试管中加入 100 μL 抗体混合物。将试管在冰上避光孵育 20 分钟。接下来，向每个试管中加入 1 毫升 HBSS 2% FCS，并在 10 摄氏度下以 370 x g 的速度离心试管 7 分钟。丢弃上清液。将沉淀重悬于 200 毫升 HBSS 2% FCS 中并充分混合。将重悬的沉淀转移到新标记的 FACS 管中。

然后，使用 FACS 方案中所示的流式细胞术评估 T 细胞增殖。对细胞进行门控以选择淋巴 CD3 阳性细胞并区分 CD4 阳性和 CD8 阳性细胞，并记录试管 1 和 3 的数据。第 5 天，用来自 6 孔板其余两个孔的细胞重复细胞染色过程。

我们将分析 CD3 刺激对刺激后 3 天和 5 天 CD4 和 CD8 阳性细胞周期的影响。首先，单击 FlowJo 图标并将您的文件拖到 All Sample 窗口中。双击第 3 天收集的未刺激细胞的文件，以显示 y 轴上带有前向散射和 x 轴上侧向散射的点图。单击多边形以根据淋巴细胞群的形态圈出淋巴细胞群。在亚群识别窗口中，命名群体淋巴细胞，然后单击 OK。接下来，双击带圆圈的群体，然后在新窗口中，选择 y 轴上的 Thy1.2 和 x 轴上的 CD3。然后，单击多边形以圈出 CD3 和 Thy1.2 双阳性细胞。在新的亚群标识窗口中，将群体命名为 T 细胞，然后单击 OK。接下来，双击带圆圈的群体。在新窗口中，选择 y 轴上的 CD4 和 x 轴上的 CD8。然后，单击多边形以圈出 CD4 阳性群体。在新的亚群鉴定窗口中，将群体命名为 CD4 T 细胞，然后单击确定。现在，单击多边形以圈出 CD8 阳性种群。在新的亚群鉴定窗口中，将群体命名为 CD8 T 细胞，然后单击 OK。对其他文件重复这些步骤。

要确定分裂细胞和非分裂细胞的频率，首先，通过单击 Layout Editor 来可视化细胞群。然后，将 CD4 T 细胞和 CD8 T 细胞从四个试管中的每一个拖到 All Sample（所有样品）窗口中。将显示代表您的总体的图表。对于每个试管，双击 CD8 T 细胞的点图，然后在 Graph Definition 下选择 Histogram 以可视化结果。选择 CFSE 作为参数，以比较每个时间点受刺激和未刺激的细胞群。非分裂细胞保持较高水平的 CFSE，而增殖细胞将 CFSE 的含量分裂成分裂细胞。

现在，在按住 Shift 键的同时，双击直方图。在新窗口中，单击 range 并选择与最高峰对应的 CFSE 范围。在亚群识别窗口中，将群体命名为 Non-Dividing CD8 T-Cells 并标记群体 Dividing CD8 Cells。现在，重复选择每个试管中分裂和非分裂的 CD4 T 细胞。要检查 CD3 阳性细胞分裂的频率，请单击 Table Editor（表格编辑器）。然后，将感兴趣的群体 Dividing CD8 T-Cells 和 Dividing CD4 T-Cells 拖到表格中。在 Statistic （统计） 菜单上，选择 Frequency of T -cells （T 细胞频率）。然后，单击 Create Table （创建表） 以在新表中显示频率。