细胞周期分析：利用CFSE染色和流式细胞术评估刺激后CD4和CD8 T细胞的增殖

1. 准备

1. 开始实验前，戴上实验室手套并穿上适当的防护服。
2. 用去污剂对所有解剖工具进行初步消毒，然后用70%乙醇处理，最后彻底擦干。
3. 配制含有2%胎牛血清（FCS）的50 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）。

2. 解剖

1. 使用二氧化碳输送系统，通过缺氧法处死小鼠。将已处死的小鼠仰卧位固定在解剖板上，用剪刀和镊子进行纵向腹腔切开。
2. 用镊子将肠道和胃向腹部右侧移动，以暴露胃和脾脏。脾脏与胃相连。
3. 用镊子小心地将脾脏从胃部分离，并将其放入含有 5 mL HBSS 2% FCS 的培养皿中。

3. 免疫细胞分离

1. 将脾脏置于同一培养皿上的40 µm细胞筛网上，用研磨杵碾压脾脏以使其解离。
2. 将解离后的脾脏组织和液体转移至15 mL离心管中。
3. 在10°C条件下以370 × g 离心7分钟，弃去上清液，注意保留沉淀。
4. 用2 mL醋酸钾重悬沉淀以裂解红细胞。静置2分钟后，加入HBSS 2% FCS至总体积达15 mL。
5. 再次在10°C条件下以370 × g 离心7分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL HBSS 2% FCS中。
6. 使用台盼蓝染色法计数细胞，并用适量体积的HBSS 2% FCS调整细胞终浓度至10⁷ 个细胞/mL。

4. CFSE 标记与T细胞刺激

1. 将分离的脾细胞以每管10⁷个的密度分装至4个15 mL离心管中（标记为1至4号管）
2. 向每管中加入3 mL含2% FCS的HBSS。
3. 向每管中加入1 µL的CFSE（终浓度为5 µM）。
4. 将各管置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育10分钟。
5. 在3号和4号管中加入12 mL含2% FCS的HBSS，并加入抗CD3抗体，使其终浓度为2.5 µg/mL。3号和4号管通过抗CD3抗体进行刺激，以观察其对细胞周期的影响。
6. 向1号和2号管中加入12 mL含2% FCS的HBSS。1号和2号管中的细胞不进行刺激处理。
7. 将所有离心管在10°C下以370 × g离心7分钟，弃去上清液。
8. 用2 mL含2% FCS的HBSS重悬各管中的细胞沉淀。
9. 将所得悬液分别转移至6孔板中的不同孔内。
10. 将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育3天。

5. 细胞染色

1. 第3天，在1号和3号孔中各加入2 mL HBSS 2%FCS。
2. 用力吹打并转移样品至5 mL流式管中。
3. 将2-4号孔中剩余的细胞继续在37°C、5% CO₂条件下培养。这些细胞将在第5天进行分析，以研究刺激对细胞周期的长期影响。
4. 在10°C下以370 × g离心7分钟，弃去上清液。
5. 向每根管中加入100 µL抗体混合液（见表1）。

抗体	荧光染料	稀释比例
CD3	Pacific Blue	1/100
CD4	BV786	1/1600
CD8	PE	1/400
Thy1.2	BV605	1/400

表1： 抗体混合物组成。使用浓缩的抗体-荧光偶联物和HBSS配制的四种抗体鸡尾酒溶液。

6. 将试管置于冰上避光孵育 20 分钟。
7. 加入 1 mL HBSS 2%FCS，于 10°C 下以 370 × g 离心 7 分钟。
8. 弃去上清液，将沉淀物重悬于 200 µL HBSS 2% FCS 中。
9. 将重悬的沉淀物转移至新的、已标记的 FACS 管中。
10. 使用 FACS 检测 T 细胞增殖情况。
11. 在第 5 天，对 6 孔板中剩余两个孔的细胞重复细胞染色步骤。

6. 数据分析

1. 打开“FlowJo”软件，将文件拖入“所有样本”窗口。
2. 双击第3天采集的未刺激细胞文件，以显示点图，其中纵轴为前向散射光，横轴为侧向散射光。
3. 点击“多边形门控”，建立设门策略，用于选择淋巴细胞、Thy1.2⁺ CD3⁺ 细胞，并区分 CD4⁺ 和 CD8⁺ 细胞（见图1）。

图 1：分选策略。 首先根据细胞形态学特征进行分选（左图：FSC-A，SSC-A）。然后对T细胞进行分选（中图：CD3，Thy1.2），并进一步划分为CD4⁺ T细胞（橙色）和CD8⁺ T细胞（蓝色）（右图：CD4，CD8）。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 对其他文件重复上述步骤。
5. 为确定分裂细胞与非分裂细胞的频率，首先点击“Layout editor”以可视化细胞群体。
6. 将四个管中的 CD4 T 细胞和 CD8 T 细胞拖动至“All sample window”中。
7. 每个细胞群体对应的图表将显示出来。
8. 使用直方图展示结果，并选择“CFSE”作为参数，用于比较不同管之间及不同细胞群体之间的差异。
9. 非分裂细胞维持较高水平的 CFSE，而增殖细胞则将 CFSE 内容分配给子代分裂细胞。
10. 在非分裂细胞上创建门控（gate），并将其应用于所有管。
11. 在分裂细胞上创建门控（gate），并将其应用于所有管。
12. 为分析 CD3+ 细胞中分裂细胞的频率，点击“Table editor”。
13. 将感兴趣的细胞群体——分裂的 CD8 T 细胞和分裂的 CD4 T 细胞——拖入“Table”中。
14. 在“Statistic”菜单中选择“frequency of T cells”，然后点击“Create table”，以在新表格中显示频率数据。
15. 点击“Create table”，频率数值将在新生成的表格中显示。