Name: 在整个猴脑进行大规模蛋白质检测的批次免疫染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 了解批次免疫染色技术用于灵长类动物全脑大规模蛋白质检测的方法。本技术通过优化组织包埋、连续切片和批量处理流程，实现全脑范围内目标蛋白空间表达模式的高效分析，为神经科学研究提供重要工具。

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我们感谢 Frank Ervin、Roberta Palmour 以及位于西印度群岛圣基茨的行為科學基金會實驗室的工作人员，感谢他们对我们灵长类动物研究工作的持续支持。本研究得到了加拿大脆性 X 综合征研究基金会（FXRFC）向 SZ 提供的博士后奖学金，以及加拿大卫生研究院（AC）和加拿大国家自然科学与工程研究理事会（MP）提供的运营基金资助。

免疫组织化学是用于表征各种实验动物模型脑组织中蛋白质表达的最常用技术之一。对于大鼠及其他脑部大小相似的常见实验模型，系统性地开展免疫组织化学实验相对容易。然而，据我们所知，目前尚无已发表的研究全面介绍如何在整个猴脑范围内进行此类免疫检测操作。以下将详细描述如何对完整的猴脑进行处理，以实现多种靶蛋白的大规模免疫组织化学检测。本方法源于商业机构与学术研究的协作成果。因此，有关组织包埋和切片的具体细节仍属于NSA的专有技术信息。
第一部分：动物处理与组织制备
本方案使用成年绿猴（Cercopithecus aethiops）的大脑。所有操作均遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）关于生物医学研究中动物使用与护理的指南1。
<ol>
<li>动物通过肌内注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度镇静，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全放血。</li>
<li>接着用含4%多聚甲醛的PBS溶液灌注约5分钟（约1升）。</li>
<li>取出的大脑置于梯度PBS缓冲蔗糖溶液（依次为10%、20%和30%）中，溶液中含0.02%叠氮化钠，4˚C保存，直至脑组织沉入容器底部。每隔数天更换一次溶液，直至进行冰冻切片。</li>
<li>脑组织送至NeuroScience Associates（NSA；田纳西州诺克斯维尔）进行处理，采用其专有的MultiBrain™包埋与冰冻切片技术。</li>
<li>在包埋基质中放置七个（7）个定位标记，以确保切片方向正确（即左右方向）并在完成组织学处理后可重新对齐。</li>
<li>在连续切片采集过程中，每次切片前均对切面进行数字摄影。这些数字图像以及脑切片后续可用于分别构建解剖学和组织学图谱的三维重建。</li>
<li>从整个脑组织采集连续的游离冠状切片，每片厚度为50 µm。</li>
</ol>
第二部分：组织学处理
按照特定的空间间隔（例如，500 µm）选取切片，出于本实验目的，使用以下抗体进行处理：脆性X智力低下蛋白（FMRP；Chemicon；美国加利福尼亚州特梅库拉）、SMI32（Sternberger Monoclonals Inc.；美国马里兰州巴尔的摩）和 NeuN（Chemicon；美国加利福尼亚州特梅库拉）。FMRP 是一种细胞质蛋白，在正常个体及携带脆性X前突变个体脑组织的神经元中含量丰富2。NeuN（神经元核蛋白）可特异性识别一种DNA结合型神经元特异性蛋白NeuN，该蛋白存在于大多数神经元中，分布于神经元细胞核、胞体以及部分近端神经元突起中3。SMI-32 是一种单克隆抗体，可识别神经丝蛋白上非磷酸化的抗原表位4。
<ol>
<li>每隔 500 µm，每种抗体大约使用 140 个切片。</li>
<li>所有孵育、洗涤和染色步骤均在专用染色皿和染色篮（HistoTools；Knoxville, TN）中进行，并施加轻微振荡。</li>
<li>为减少抗体分子的非特异性结合及由此产生的背景染色，切片首先在含有 0.1 M PBS/0.3% Triton X-100（TX）/5% 正常马血清（NHS）的溶液中孵育 60 分钟。</li>
<li>标记用于 FMRP 免疫染色的切片需额外进行抗原修复步骤，使用抗原修复液（Vector Labs；Burlingame, CA），操作按照供应商说明书进行。</li>
<li>随后，切片在各自的一抗溶液（含 0.1 M PBS/0.3% TX/3% NHS）中分别于不同日期过夜孵育（FMRP 和 SMI-32 抗体稀释比例为 1/5,000，NeuN 抗体稀释比例为 1/2,000）。</li>
<li>次日，切片在洗涤液（0.1 M PBS/0.3% TX）中洗涤三次，每次 10 分钟，随后在室温下与生物素化马抗小鼠二抗（Vector Labs；1/1,000 稀释于 0.1 M PBS/0.3% TX/3% NHS）孵育 2 小时。</li>
<li>再经过三轮 10 分钟洗涤后，切片在亲和素-生物素连接的辣根过氧化物酶复合物溶液（Vector Labs）中室温孵育 1 小时。</li>
<li>最后，在另一轮洗涤后，切片进行 10 分钟镍增强型二氨基联苯胺（Ni-DAB）反应，使免疫阳性神经元呈现深蓝色染色。</li>
<li>组织学程序完成后，将切片贴附于明胶包被的玻璃载玻片上。</li>
<li>所有切片均在空气中干燥过夜，并按照标准程序封片。</li>
</ol>
第3部分：代表性结果：
该方法可获得目标蛋白在整个猴脑中的完整表达谱。本文展示了代表性冠状切片，提供了同一只猴脑中FMRP、NeuN和SMI32表达情况的快照。
<img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig1.png" alt="用于实验室实验中样品分析的培养皿显微镜装置，比较透明底部与网格底部。" data-altupdatedat="1787630408000">
图1： 用于大规模批量处理游离切片进行免疫检测的染色皿（A）和篮框（B）。
<img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig2.png" alt="脑部横截面；组织学图示；比较解剖学研究；结构分析。" data-altupdatedat="1787630408000">
图2： 用于FMRP（A）、NeuN（B）和SMI32（C）抗体染色的绿猴脑代表性冠状切片。

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+to+the+Care+and+Use+of+Experimental+Animals%22">Guide to the Care and Use of Experimental Animals</a>. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).</li>
<li>Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FMR-1+protein+is+cytoplasmic%2C+most+abundant+in+neurons+and+appears+normal+in+carriers+of+a+fragile+X+premutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation.</a> Nat Genet. 4, 335-340 (1993).</li>
<li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuN%2C+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116, 201-211 (1992).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该流程中有两个关键步骤，使得在整个猴脑范围内大规模检测蛋白质成为可能。其一是由NSA持有的专有技术——包埋与切片方案。其二是使用HistoTools公司提供的染色皿和染色篮。后者能够在同一时间方便快捷地处理大量（约40张）脑切片，同时确保全脑各切片处理条件的一致性，从而实现科学严谨的组织学处理。此外，通过使用嵌入式解剖标志物，还可进一步实现对干燥并加盖玻片的切片进行染色模式的数字化采集，并对所得数字图像文件进行多种分析。尽管本文仅展示了三种抗体的应用实例，但该方法同样适用于多种其他靶蛋白以及组织学染色技术，尤其是那些能够显示大脑皮层不同区域细胞构筑特征、因而可用于脑区定位与图谱绘制的染色方法。

<table><tbody><tr><td>抗FMRP单克隆抗体</td><td>Chemicon International</td><td>MAB2160</td><td>在固定组织中使用需进行抗原修复。</td></tr><tr><td>抗NeuN单克隆抗体</td><td>Chemicon International</td><td>MAB377</td><td>不适用</td></tr><tr><td>抗神经丝蛋白H单克隆抗体</td><td>Sternberger Monoclonals Inc.</td><td>SMI32</td><td>不适用</td></tr><tr><td>抗原修复液</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>不适用</td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠IgG（H+L），马来源</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC试剂盒（标准型）</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>1.5 mg</td></tr><tr><td>用于漂浮切片的染色皿</td><td>HistoTools</td><td>10009</td><td>12 x 65 mm</td></tr><tr><td>染色运输篮</td><td>HistoTools</td><td>10012</td><td>大号&lt;br/&gt;（适配12 x 65 mm染色皿）</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>P8514B</td><td>不适用</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC11209-0050</td><td>不适用</td></tr></tbody></table>

大规模猴脑全脑蛋白质检测的批量免疫染色

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

免疫组织化学（IHC）是最常用的实验室技术之一，用于检测目标蛋白质in situ. 在使用免疫组化（IHC）研究小脑（如啮齿类动物脑）时，回答目标蛋白在整个脑区表达模式的问题相对容易。然而，在较大且结构复杂的脑组织（如灵长类动物脑）中回答相同问题则面临诸多挑战。本文介绍一种在成年猴脑中进行目标蛋白免疫检测的系统性方法。该方法基于神经科学协会（NeuroScience Associates, NSA）的组织包埋与切片技术，并结合专为游离漂浮切片批量染色而开发的工具。该方法可实现一组切片的均匀染色，这些切片以特定间隔覆盖整个脑组织。所得染色切片可进一步用于多种分析流程，以定量检测蛋白表达水平或表达特定蛋白的神经元群体。

通过采用新型的组织包埋和切片方法，并结合创新装置对多个游离脑片进行批量染色，可以在整个灵长类动物大脑范围内大规模检测目标蛋白。

免疫组织化学（IHC）是原位检测目标蛋白最常用的实验室技术之一。有关……

此操作流程始于收到经4% PFA灌注、暴露并进行冷冻保护的大脑样本，该样本已送至Neuroscience Associates，利用包埋基质中嵌入的对齐标记进行包埋。可沿冠状面切片，使用特制的篮子和容器获取所需厚度的连续切片，以完整覆盖大脑的前-后轴范围。可通过批量免疫处理，确定目标蛋白在整个大脑中的空间表达模式。大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室的 Dr. Shaheen Zur。大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室的 Dr. Mark Burke。大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室主任 Dr. Mo Petto。今天，我们将向您展示一种用于大规模检测完整猴脑中蛋白质的批量免疫染色方法。我们在实验室中使用该方法来研究目标蛋白质在整个脑组织中的表达模式，并比较和对比这些蛋白质在同一脑组织内的表达情况。那么，让我们开始吧。在进行组织学处理之前，获取一个通过全身灌注保存、后续固定并使用梯度蔗糖溶液进行冷冻保护的灵长类动物脑组织。在此阶段，将脑组织送至神经科学合作机构，利用其专有技术进行包埋并进行自由切片。待样本返回后，可观察到包埋基质中已放置七个对齐标记点，以便在组织学处理完成后对切片进行准确定向和重新对齐。在切片过程中，会采集数字图像，这些图像后续可用于解剖图谱的三维重建。神经科学关联公司对我们的组织进行处理，以获得覆盖全脑的连续50 µm厚的游离冠状切片。处理完成后，我们即可开始对切片进行组织学处理。开始组织学处理时，我们通常需要处理每种抗体或染色约140张切片。本文将以使用SMI 32抗体处理的少量切片为例演示该技术，SMI 32是一种针对非磷酸化神经丝蛋白的单克隆抗体。在整个操作过程中，使用专用的染色皿和染色篮，可同时高效地处理大量游离切片。这可以确保所有切片的染色结果一致。第一步是将切片置于含有TRITON X-100和正常马血清的PBS溶液中孵育60分钟。这一步可减少抗体分子的非特异性结合，从而降低背景染色。接下来，将切片在含有Triton X-100和正常马血清的PBS配制的SMI 32抗体溶液中4℃孵育过夜。次日，用洗涤液洗涤切片三次，每次10分钟，然后在室温下孵育两小时，使用含Triton X-100和正常马血清的PBS配制的生物素化Muse二抗溶液。经过另外三轮每次10分钟的漂洗后，将切片置于室温下，与生物素偶联的马辣过氧化物酶复合物溶液孵育1小时。最后，再经过一轮漂洗后，将切片放入D-氨基联苯反应液中反应10分钟，使免疫反应性神经元内产生棕褐色沉淀。反应通过取出染色篮并将切片浸入PBS中而终止。在 PBS 中经过两到三次、每次五分钟的漂洗后，即可使用大型培养皿和极软的画笔，将切片逐一转移到载玻片上进行封片。将切片从 PBS 缓冲液容器中取出，并逐一转移至明胶包被的玻璃载玻片上。随后，将样品置于通风橱中，于次日室温下静置过夜，使其自然干燥。将切片浸入去离子水中进行漂洗，以去除封片过程中可能残留的盐结晶。随后，载玻片经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，并用Permount封片剂封片。此阶段，载玻片应水平存放约一周至10天，以使封片剂充分硬化。此后，切片可保存在切片盒中，或通过显微镜进行成像。该方法可获得目标蛋白在整个猴脑中的完整表达谱。此处展示的代表性冠状切片提供了FMRP、new n和SMI 32表达情况的快照。在同一猴脑中。我们刚刚向您展示了如何在整个大脑范围内完成目标蛋白的批量免疫染色。进行此操作时，重要的是确保所有切片在各种溶液中孵育期间始终处于轻微振荡状态，并且始终保持完全浸没。此外，在将样本固定于载玻片上时应耐心操作，尽量去除皱褶和折叠，同时不破坏组织的完整性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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