在整个猴脑进行大规模蛋白质检测的批次免疫染色
2009年7月27日
大型整个灵长类动物大脑的靶蛋白的免疫检测是采用新颖的组织包埋，切片与创意仪器在某一特定时间使用多个自由浮动的部分批次的染色相结合的方法。
该程序从收到 4% PFA 灌注、外化和冷冻保护的大脑开始，该大脑已被发送给神经科学合作伙伴，以使用嵌入周围基质中的对齐标志进行包埋。可以在冠状面对大脑进行切片，以产生所需厚度的连续切片，这将使用专门的篮子和容器代表大脑的整个前后部分。可以进行批量免疫处理，以确定蛋白质在整个大脑中的空间表达模式。
嗨，我是来自蒙特利尔大学视光学院视觉神经科学实验室的 Shaheen Zur 博士。大家好，我是 Mark Burke 博士，也来自蒙特利尔大学视光学院视觉神经科学实验室。大家好，我是 Dr.Mo Petto，蒙特利尔大学视光学院视觉神经科学实验室主任。
今天，我们将向您展示一种用于全猴大脑中大规模蛋白质检测的批量免疫染色程序。我们在实验室中使用该程序来研究整个大脑中靶蛋白的表达模式，并比较和对比这些蛋白质在同一大脑内的表达。那么让我们开始吧。
在组织学处理之前，获得灵长类动物大脑，该脑已通过全身灌注和固定后保存，并使用分级蔗糖溶液进行冷冻保护。在这个阶段，大脑被送到神经科学协会，使用他们的专有技术进行嵌入和自由切片。返回后，将观察到 7 个对齐标志被放置在包埋矩阵中，以便切片可以正确定向并在组织学处理完成后重新对齐。
在进行切片时，会拍摄数字图像，这些图像稍后可用于解剖图的 3D 重建。神经科学家协会对我们的组织进行处理，以在整个大脑上产生连续的 50 微米厚的自由浮动冠状切片。完成后，我们可以开始对切片进行组织学处理。
当我们开始组织学处理时，我们通常每个抗体或染色剂需要处理大约 140 个切片。在这里，我们将使用用 SMI 32 抗体处理的较小切片样品来演示该技术，SMI 32 是一种针对非磷酸化神经丝蛋白的单克隆抗体。在整个过程中，使用专门的染色皿和染色篮，可以同时有效地处理大量自由浮动切片。
这确保了所得染色剂在所有切片上都是一致的。第一步是将切片在含有 TRITTON X 100 和正常马血清的 PBS 溶液中孵育 60 分钟。这将减少导致背景染色的抗体分子的非特异性结合。
接下来，将切片孵育过夜。在基于 PBS 的 SMI 32 抗体溶液中，次日补充 tritton X 100 和正常马血清，将切片在洗涤液中洗涤 3 次，每次 10 分钟，然后在室温下孵育 2 小时。在含有 Triton X 100 和正常马血清的基于 PBS 的生物素化 Muse 二抗溶液中。
再洗涤 3 次 10 分钟后，将切片置于 avadon 生物素偶联的辣根过氧化物酶复合物溶液中，在室温下放置 1 小时。最后，在另一组洗涤后，将切片置于 D 氨基苯反应中 10 分钟，从而在免疫反应神经元内产生棕色染色。然后通过取出染色篮并将切片浸入 PBS 中来终止反应。
在 PBS 切片中冲洗 2 到 3 到 5 分钟后，即可单独安装在载玻片上，以使用大培养皿和非常柔软的油漆刷开始安装过程。将切片从 PBS 缓冲液容器中取出，并单独安装在明胶涂层载玻片上。然后让样品在第二天在通风橱中风干过夜。
通过将切片浸入去离子水中冲洗，以洗去镶样过程中可能残留的任何盐晶体。然后，将载玻片在分级乙醇步骤中脱水，用二甲苯清洗，并盖上每种封片剂的盖玻片。在此阶段，玻片应在水平位置存放约 1 周至 10 天，以使封固剂变硬。
在此之后，载玻片可以储存在载玻片盒中或通过显微镜进行成像。该方法可在整个猴子大脑中生成目标靶蛋白的完整表达谱。在这里，我们显示了具有代表性的冠状切片，这些切片提供了 FMRP、新 n 和 SMI 32 表达的快照。
在同一个猴子的大脑中。我们刚刚向您展示了如何在整个大脑中完成目标靶蛋白的批量免疫染色。执行此程序时，重要的是要确保所有切片在各种溶液中孵育时都经过轻微的搅拌，并且它们始终保持完全浸没。
此外，在玻璃安装解剖时花点时间，在不损害组织完整性的情况下去除尽可能多的皱纹和折叠。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文讨论了一种新型方法，用于在灵长类动物大脑中大规模免疫检测目标蛋白。它强调了创新的组织嵌入和切片方法，以及多个自由漂浮切片的批量染色技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫检测
- 脑成像
背景
- 免疫检测对于研究大脑中的蛋白表达至关重要。
- 传统方法在范围和效率上可能有局限性。
- 组织处理技术的进步可以增强研究能力。
- 批量处理允许对蛋白分布进行全面分析。
研究目的
- 开发用于灵长类动物大脑大规模免疫检测的方法。
- 提高蛋白表达分析的效率。
- 促进对大脑中空间表达模式的研究。
使用的方法
- 使用4% PFA灌注以保存大脑。
- 使用周围基质中的对齐标志进行嵌入。
- 在冠状面进行连续切片。
- 用于空间蛋白表达分析的批量免疫处理。
主要结果
- 成功嵌入和切割灵长类动物脑组织。
- 展示了分析蛋白表达模式的能力。
- 创新技术提高了免疫检测的效率。
- 在神经科学研究中具有更广泛应用的潜力。
结论
- 所开发的方法显著改善了大规模免疫检测。
- 这些技术可以推进我们对大脑蛋白表达的理解。
- 未来的研究可以在各种应用中建立在这些方法之上。
常见问题
Executive Industry Relevance
Large-scale protein expression mapping in primate brains supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. Batch immunostaining enables reproducible, quantitative assessment of spatial protein distribution across the whole brain, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. This approach addresses a critical gap in translational research by providing disease-relevant system data for lead identification and preclinical model alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping target protein expression across the entire primate brain.
- Operational Value: Supports biological de-risking through uniform staining of serial sections for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing spatially resolved protein expression data for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via batch processing of free-floating sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through synchronized immunostaining of large section sets.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse for reliable compound evaluation in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through alignment of protein expression patterns with neurological disorder models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation using standardized immunostaining protocols.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative measurement of protein levels and neuronal populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation to preclinical research by enabling spatially resolved protein expression analysis in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through whole-brain protein mapping.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility via batch immunostaining of serial sections.
- Analytics: Highlights quantitative readouts such as protein levels and neuron population counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via alignment of expression patterns with biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for large-scale protein detection across multiple targets and studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein expression studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of immunostaining workflows for large section sets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on whole-brain expression profiles.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, immunohistochemistry, and neuroanatomy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including specialized staining dishes, baskets, and microscopy systems.
- Cross-team standardization requirements for section alignment, staining consistency, and data interpretation.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primate versus rodent brain processing.
- Practical limitations including section handling complexity and mounting precision for large-scale serial sections.
