Name: 一个外源凝集素的高效液相色谱法从复杂生物样品，以丰富的选择性糖基化肽 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: 学习利用外源凝集素亲和色谱法从人血浆中高效富集糖基化肽段的技术。该方法结合高效液相色谱系统，可显著提升复杂生物样品中糖肽的分离效率，助力疾病生物标志物发现研究。

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本工作由癌症临床蛋白质组学技术计划资助，项目编号5U24CA126477-04。

1) 制备凝集素偶联的 POROS 柱
<ol>
<li>佩戴口罩，以防在步骤 1.1 - 1.2 中吸入 POROS-AL 微球。称取所需量的 POROS 微球（每 100 mg 微球/300 μl 最终体积）并转移至洁净的微量离心管中。</li>
<li>用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠。在微量离心机中以最大速度离心3分钟，使磁珠沉淀。弃去上清液，并重复洗涤一次。</li>
<li>称取所需量的未结合凝集素（1 - 4 mg/ 200 μl 珠粒）转移至洁净的微量离心管中。加入 PBS 配制成 5–20 mg/mL 的溶液。保留备用 25 μl 该溶液的</li>
<li>将剩余的凝集素溶液转移至 POROS 小球中。加入氰基硼氢化钠至终浓度为 50 mM。将离心管置于摇床上，室温下振荡反应过夜。（注意：氰基硼氢化钠具有毒性，必须在通风橱中操作。被污染的废弃物须妥善处理。）</li>
<li>按照步骤1.2离心收集POROS珠。移除上清液，并作为偶联后溶液保存。</li>
<li>用 1 mL 淬灭缓冲液（1 M Tris-Cl，pH 7.4）洗涤磁珠。参照步骤 1.2 方法离心收集磁珠，并安全弃去上清液。</li>
<li>用1 mL 淬灭缓冲液封闭POROS珠上剩余的活性位点。加入氰基硼氢化钠至终浓度为50 mM。将离心管置于摇床上，室温孵育30分钟。</li>
<li>离心收集步骤1.2中的沉淀珠，弃去上清液。</li>
<li>用1 mL 1 M NaCl洗涤磁珠。离心收集磁珠并弃去上清液。重复此步骤四次，共洗涤五次。磁珠现可进行装柱。</li>
<li>为确定与POROS珠结合的蛋白量，需对结合前和结合后的凝集素溶液进行蛋白浓度测定。浓度之差即为结合到珠上的蛋白量。每单位体积珠所结合的蛋白量等于珠上凝集素的浓度。目标凝集素浓度范围为2–20 mg/mL。</li>
</ol>
2) 将凝集素偶联的 POROS 小珠装填至 PEEK 柱中
<ol>
<li>组装填充系统（具体描述见下文），并将其固定在金属环架上。填充系统自下而上依次为：压力限制器、柱端接头1、烧结片、色谱柱（2 × 50 mm）、柱端接头2、柱连接器、柱端接头3、色谱柱（4.5 × 50 mm）、柱端接头4和终端接头。上方的色谱柱用作填充材料的储液槽。</li>
<li>将POROS珠重悬于所需体积的缓冲液A（10 mM Tris缓冲液，pH 7.4，150 mM氯化钠，10 mM氯化钙，10 mM氯化镁）中。若用于装填一根色谱柱（~200 μl 床体积），重悬于 400 μl 缓冲液 A</li>
<li>将偶联的POROS凝胶转移至上层柱管（储液室）。向储液室中加入缓冲液A，直至液面升至柱床上端。轻轻将柱端接头安装到柱管顶部，注意避免柱内产生气泡。将上层柱管的接头连接至高效液相色谱（HPLC）系统。</li>
<li>用缓冲液A通过系统对色谱柱进行装填。起始流速为0.5 mL/min，每分钟增加0.5 mL/min，直至达到4 mL/min或最高压力（3000 psi）。随后在可达到的最高流速下继续冲洗，直至至少有35 mL的缓冲液A流经色谱柱。</li>
<li>关闭泵，使柱压逐渐降至 &lt; 20 psi</li>
<li>轻轻地从顶部开始拆卸装填系统。当拆至末端柱连接头2时，需小心移除。此时应有部分填料从柱子顶端挤出。使用剃刀片或类似锋利工具，轻轻刮去突出的微珠，使微珠表面与柱子顶端齐平。操作过程中切勿对微珠施加压力。</li>
<li>将填充柱从铁架台上取下。将新的烧结板放入一个新的端部接头中，并将填充柱翻转，使新开口端（原顶部）与装有烧结板/端部接头的一端连接。</li>
<li>正确标记柱子。现在即可使用。不使用时，可将柱子保存在含0.02%叠氮化钠的PBS中 4 °C 长达6个月。</li>
</ol>
3) 编程设定高效液相色谱方法
<ol>
<li>您的HPLC编程细节将根据制造商软件的具体情况而有所不同。我们使用的是Michrom Paradigm MG4 HPLC。在此设备上，方法的建立和访问需通过屏幕顶部的“Setup”选项卡进行。请编程以下方法： 
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>时间</td>
 <td>流速（μl/min)</td>
 <td>% A</td>
 <td>% B</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0:00</td>
 <td>50</td>
 <td>100</td>
 <td>0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9:00</td>
 <td>50</td>
 <td>100</td>
 <td>0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9:01</td>
 <td>500</td>
 <td>0</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>13:50</td>
 <td>500</td>
 <td>0</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>13:51</td>
 <td>3000</td>
 <td>100</td>
 <td>0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>19:50</td>
 <td>3000</td>
 <td>100</td>
 <td>0</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
 缓冲液A：10 mM Tris缓冲液，pH 7.4，150 mM氯化钠，10 mM氯化钙，10 mM氯化镁 
 缓冲液B：0.5 M 乙酸 
 紫外检测器应设置为在 0:00 至 19:50 期间于 280 nm 波长处进行检测。应调整 y 轴以检测低吸光度水平。 例如0 - 50 AU</li>
<li>如果配有自动进样器，请按照以下程序设置组分收集；否则，在进行色谱分析时，根据指示手动收集各组分。 
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>样品注入后至收集的延迟时间 </td>
 <td>采集时长（分钟）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>流通式</td>
 <td>2.8</td>
 <td>4.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>结合的</td>
 <td>9</td>
 <td>2.6</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
</li>
</ol>
4) 准备高效液相色谱样品
<ol>
<li>在本方案使用前，应使用 MARS 柱（Agilent；Santa Clara, CA）去除人血浆中丰度最高的 14 种蛋白质。去除了高丰度蛋白的血浆、人乳铁蛋白和酵母蔗糖酶应分别进行胰蛋白酶消化并脱盐，方法如前所述1。</li>
<li>为制备凝集素特异性的乳铁蛋白标准品，采用第 3 部分所述方法，将 50 μg 胰蛋白酶消化后的乳铁蛋白分别上样至 AAL 或 SNA 柱进行层析。结合组分将含有凝集素特异性的乳铁蛋白糖肽。按照第 4.4 部分的方法中和样品，并按第 6 部分方法进行脱盐。将样品重悬于 1 mL A 缓冲液中。所得样品即可使用。</li>
<li>将进行三次实验重复。为准备三次重复的样品，向 30 μl 经 MARS 去除高丰度蛋白、胰蛋白酶消化后的血浆当量（PE）中加入 3 pmol 胰蛋白酶消化的蔗糖酶和 1 μl 凝集素特异性乳铁蛋白（AAL-LAC 或 SNA-LAC）。PE 定义为产生一定量处理后血浆（经 MARS 去除高丰度蛋白并进行胰蛋白酶消化）所对应的未处理/完整/原始血浆体积。向样品中加入 A 缓冲液，使最终体积达到 330 μl。</li>
<li>向将用于收集洗脱液的样品管中加入中和缓冲液（1 M Tris，pH 8.0）。所用管的数量和体积取决于自动进样器的限制条件。对于 Paradigm MG4 系统，一个管收集穿流液，两个管收集洗脱液。中和 1 mL 洗脱液约需 1.5 mL Tris 缓冲液。目标中和后 pH 为 7.0–8.0；使用 pH 指示试纸检测最终 pH。</li>
</ol>
5) 进行层析
<ol>
<li>后续所有空白对照和样品运行均采用第1部分所述方法。使用过程中色谱柱和缓冲液均保持室温。色谱柱储存于4 °C，缓冲液储存于室温。</li>
<li>将AAL或SNA凝集素柱连接至高效液相色谱（HPLC）系统，并运行两次空白方法（仅注入缓冲液A）。确保所用凝集素柱与第2部分中对应的凝集素特异性乳铁蛋白相匹配。</li>
<li>对三个血浆样品进行色谱分析，每注入一个样品之间插入一次空白运行，共完成7次HPLC运行。空白运行的组分无需收集。</li>
</ol>
6) 脱盐收集的组分
每种组分使用一个1 mL Waters Oasis HLB SPE小柱，步骤如下：
<ol>
<li>将所需数量的萃取柱连接至真空 manifold 上。</li>
<li>用 1 mL 含 1% 甲酸的 80% 乙腈润洗每根萃取柱（manifold 上的真空表读数应为 5 - 20 lnHg）。</li>
<li>用 1.5 mL 0.1% 甲酸平衡萃取柱（manifold 上的真空表读数应为 5 - 20 lnHg）。</li>
<li>将一份样品的全部体积上样至一根萃取柱（manifold 上的真空表读数应为 2 - 2.5 lnHg，流速不得超过 1 mL/min）。</li>
<li>用 3 × 1 mL 0.1% 甲酸洗涤萃取柱（manifold 上的真空表读数应为 5 - 20 lnHg）。</li>
<li>用 1 × 1 mL 含 0.1% 甲酸的 80% 乙腈洗脱肽段/糖基化肽段至已标记的离心管中（manifold 上的真空表读数应为 2 - 2.5 lnHg，流速不得超过 1 mL/min）。每根萃取柱使用一个单独的收集管。</li>
<li>向每个收集管中加入 60 μl 0.5 M 碳酸氢铵以中和洗脱液。目标中和 pH 为 7.0–8.0；使用 pH 试纸检测最终 pH。</li>
<li>将洗脱的肽段/糖基化肽段在真空离心浓缩仪（例如 Thermo Savant SpeedVac）中于 35°C 下浓缩约 2 小时，至体积约为 50 μL。</li>
</ol>
7) PNGase F 消化
<ol>
<li>检测样品 pH，确保其在 7.0 - 8.0 之间。如有需要，加入 50 mM 碳酸氢铵以提高 pH。若最终样品体积 > 100 μl，使用真空浓缩仪将样品浓缩至 50–100 μl。</li>
<li>向每个样品管中加入 0.5 μl（250 U）无甘油 PNGase F，并在 37 °C 下孵育过夜。</li>
</ol>
8) 使用 Zip Tip 进行样品处理
<ol>
<li>从经PNGase F消化的样品开始，按如下步骤对每个样品进行Ziptip处理。</li>
<li>用润湿的Ziptip 10 μl 100% 乙腈，随后 10 μl 80% 乙腈，0.1% 甲酸</li>
<li>用溶液平衡移液枪尖 20 μl 0.1% 甲酸</li>
<li>通过移液枪将样品在Ziptip填料中上下移液10次，以完成样品加载。</li>
<li>用移液枪反复吹打清洗移液尖 10 μl 0.1% 甲酸，5 次。</li>
<li>用干净的离心管收集洗脱样品 10 μl 80% 乙腈，0.1% 甲酸</li>
<li>重复洗脱步骤，并加入第二次洗脱液 10 μl 加入同一管中。</li>
<li>将样品真空离心浓缩至指定体积 &lt; 2 μl.</li>
<li>重悬样品于 20 μl 0.1% 甲酸。样品现可进行 LC-MS/MS 分析。</li>
</ol>
9）代表性结果：
POROS 偶联通常可产生每珠粒 2 - 20 mg/mL 范围内的凝集素浓度，此浓度适用于亲和层析。
胰蛋白酶消化的MARS耗竭型人血浆经凝集素色谱后，通常可在结合组分中富集糖肽。由于糖肽在LC-MS/MS分析前经过PNGase F处理，因此被鉴定为具有N-连接糖基化共识序列NXS/T（其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸）的肽段，且天冬酰胺残基在PNGase F作用下已转化为天冬氨酸。具有上述特征的肽段被视为去糖基化肽段（或“去糖肽”）。通常情况下，AAL或SNA色谱的流穿组分（FT）中约含有2-4%的去糖肽，而结合组分中回收的肽段有30-50%为去糖肽。使用QStar Elite质谱仪时，通常可在流穿组分中鉴定到1000-1300个肽段，在结合组分中鉴定到200-400个肽段。在流穿组分中应检测到两个或更多不同的转化酶去糖肽，在结合组分中应检测到两个或更多不同的乳铁蛋白去糖肽（表1）。
<img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="蛋白质分析表，包含蛋白质编号、肽段序列及用于质谱分析的理论质荷比。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 表 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

本方案提供了一种以糖链特异性方式快速分离和鉴定糖肽的方法。由于糖基化修饰在生物体内存在广泛变异，尤其在发育和致病过程中，该技术可适用于解决多种科学问题。特别是，我们正在利用该方法选择性富集携带癌症相关表位修饰的糖肽，作为生物标志物发现的第一步。

<table><tbody><tr><td>人血浆</td><td></td><td></td><td>本实验室自制</td></tr><tr><td>人乳铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>使用前需胰蛋白酶消化</td></tr><tr><td>酵母转化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>使用前需胰蛋白酶消化</td></tr><tr><td>Oass HLB 固相萃取小柱</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>1 cc 体积</td></tr><tr><td>ZipTip 吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore，C18，适用于 10 µL 移液器</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99.7%</td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>范围 0–14</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99.9%</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>不含钙和镁</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>无甘油</td></tr><tr><td>真空过滤瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>0.2 mm 孔径</td></tr><tr><td>POROS-AL 微球</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; 凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; 凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>5.0 M 溶液</td></tr></tbody></table>

一种利用凝集素高效液相色谱法从复杂生物样品中选择性富集糖基化肽段的方法

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

聚糖是一类重要的翻译后修饰分子。它们通常存在于分泌蛋白和细胞外分子上，其结构可反映细胞内部状态。肿瘤细胞表面的聚糖往往富含唾液酸和岩藻糖基团。我们提出，可利用这些与癌症相关的聚糖变异形式，开发用于早期疾病诊断的生物标志物。为此，我们建立了一种基于质谱的实验流程，该流程结合了以凝集素为亲和基质的色谱技术。凝集素是一类可特异性结合特定聚糖结构的蛋白质。我们将分别识别唾液酸和岩藻糖的黑接骨木凝集素（Sambucus nigra, SNA）和橙黄伞菌凝集素（Aleuria aurantia, AAL）共价偶联至POROS微珠（Applied Biosystems），并装填于聚醚醚酮（PEEK）柱中，用于高压液相色谱（HPLC）。简言之，首先使用多重亲和去除系统（MARS-14；Agilent）去除血浆中丰度最高的十四种蛋白质。去除了高丰度蛋白的血浆样品经胰蛋白酶消化后，通过SNA或AAL HPLC分离为流穿组分和结合组分。各组分经PNGaseF处理以去除N-连接聚糖，随后在QStar Elite质谱仪上进行LC-MS/MS分析。数据采用Mascot软件进行解析。实验设计包括阳性对照——岩藻糖基化和唾液酸化的乳铁蛋白糖肽——以及阴性对照——来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的高甘露糖型糖肽，用于监测凝集素富集的特异性。该实验流程的关键特征包括：基于HPLC格式所带来的良好重复性；通过去酰胺化的Asn-Xxx-Ser/Thr序列模式对捕获并经PNGaseF处理的糖肽进行确证性鉴定；以及利用糖蛋白标准品进行质量评估。方案优化还包括确定起始样品与色谱柱容量的合适比例，筛选最有效的捕获与洗脱缓冲液，以及监控PNGaseF处理过程以确保完全去糖基化。未来的研究方向是将该流程应用于乳腺癌患者与健康对照个体血浆样本的质谱驱动发现研究。

聚糖，翻译后修饰，生物标志物，质谱，液相色谱-质谱联用，凝集素，SNA，AAL，HPLC，PNGaseF，血浆，糖蛋白，乳腺癌

采用凝集素偶联的POROS微珠进行高效液相色谱分析。糖肽标准品用作阳性和阴性对照。将经MARS-14去除高丰度蛋白并经胰蛋白酶消化的人血浆进行色谱分离，收集流穿组分（FT）和结合组分，用于电喷雾电离液相色谱-串联质谱（ESI-LC-MS/MS）分析。与流穿组分相比，糖肽在结合组分中得到富集。

糖类是重要的翻译后修饰类别。通常存在于分泌蛋白和细胞外分子上，糖类结构可传递……

该实验步骤专门用于从人血浆中分离特异性糖基化的糖肽。血浆经胰蛋白酶消化，得到肽段和糖肽的混合物，并加入糖肽标准品。凝集素色谱的阳性和阴性对照被添加至血浆中。样品经过基于凝集素亲和层析的高压液相层析。所用凝集素分别结合二糖岩藻糖和唾液酸，肽段和无关糖肽在流穿组分中从层析柱洗脱。使用乙酸将结合组分从层析柱中洗脱下来。这富含特异性修饰的糖肽。大家好，我是Penny Drake，来自加利福尼亚大学旧金山分校妇产科与生殖科学系Susan Fisher实验室，以及San Lamore质谱核心实验室。我是Eric Johansen，同样来自Sandler Moore质谱核心实验室和Fisher实验室。今天，我们将向您展示一种凝集素色谱法操作流程，用于从人血浆及其他复杂混合物中富集糖肽。我们在实验室中将该方法作为一种通用工具，具有多种应用。例如，它在我们的乳腺癌生物标志物发现工作流程中发挥着重要作用。那么我们开始吧。进行此操作时，应佩戴口罩以防止吸入微珠。然后称取100毫克的porro微珠，并转移至一支干净的einor离心管中。填充一个色谱柱大约需要 300 微升的珠子。此外，称取未偶联的凝集素并转移至一个干净的离心管中。所使用的凝集素为 SNA 和 AAL。继续向凝集素中加入PBS，配制成5至20毫克/毫升的溶液。保留25微升该预结合溶液。接下来，通过加入1毫升PBS并在微量离心机中以最大速度离心，洗涤Porro磁珠。孵育三分钟后，弃去上清液，并重复洗涤一次。现在于通风橱中操作，将剩余的凝集素溶液转移至已洗涤的Porro层析柱中，然后加入氰基硼氢化钠，使其终浓度为50毫摩尔。 请注意，硼氢化钠具有毒性，废弃物必须妥善处理。将封闭的试管用封口膜密封后置于摇床上，室温反应过夜。凝集素与琼脂糖珠过夜结合后，再次离心收集琼脂糖珠。弃去上清液，并将其保留作为结合后溶液，用于封闭珠子上剩余的活性位点。首先，用1 mL pH 7.4的1 M CL淬灭缓冲液离心洗涤磁珠。然后向其中加入1 mL淬灭缓冲液，并加入叠氮化钠至终浓度为50 mmol/L。将离心管置于摇床上，室温孵育30分钟。淬灭现已完成。离心珠子，操作同前。弃去上清液，随后用一毫升一摩尔氯化钠溶液洗涤磁珠五次，每次均弃去上清液。对偶联前和偶联后的凝集素溶液进行蛋白质浓度测定，并利用浓度差确定偶联到磁珠上的蛋白质含量。目标凝集素浓度为每毫升磁珠体积偶联 2 至 20 毫克蛋白质。偶联的Porro珠子现已准备好装柱。将珠子装入色谱柱时，需组装装柱系统，该系统由两个色谱柱组成，并固定在金属支架上。上方的色谱柱用作装柱材料的储液槽。包装系统由下至上依次为压力限制器、用于目标柱的末端柱接头一、末端柱接头、双柱连接器、末端柱接头三、储液柱、末端柱接头四以及末端接头。接下来，将300 µL的Porro Speeds重悬于600中。缓冲液A的微升数。为装填一根色谱柱，将珠子转移至上部储液柱中。加入缓冲液A直至液面到达柱子顶端。轻轻将末端接头置于柱子顶部。尽量避免色谱柱中产生气泡。将色谱柱上端接头连接至高效液相色谱（HPLC）系统。通过系统泵入缓冲液A或磷酸盐缓冲液（PBS）以装填色谱柱。以每分钟0.5毫升的流速开始。每分钟将流速增加0.5毫升，直至达到每分钟4毫升或最大压力为止。随后以可达到的最大流速继续运行，直到至少有35毫升缓冲液通过层析柱。完成操作后，关闭泵并使柱压降至 20 PSI 以下。柱子填装完毕后，从顶部开始小心拆卸填装系统。当拆至末端柱连接头二时，需小心将其取下。使用剃须刀片轻轻擦去从柱子顶部挤出的填料。操作时不要对凝胶颗粒施加压力。将装填好的柱子从铁架台上取下。将新的烧结片放入新的端子接头中，并将装填好的色谱柱翻转，使其与开放柱端的FR加端子接头连接。此时色谱柱已准备就绪，可用于高效液相色谱（HPLC）运行。当不使用时，可将色谱柱保存在含0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于4摄氏度条件下最长可保存六个月。编程HPLC的具体步骤将根据您的设备配置以及制造商软件的具体情况而有所不同。本实验中，我们使用的是Microme Paradigm MG Four HPLC系统。在该设备上，方法的建立和调用可通过屏幕顶部程序中的“Setup”（设置）选项卡完成。所示方法在随附的书面方案中也有详细描述。若使用自动进样器程序，也应遵循书面方案。使用与之前相同的缓冲液A，以及缓冲液B进行HPLC运行，并将缓冲液和色谱柱均保持在室温下。将紫外检测器设置为在0至19分50秒期间读取2和80纳米处的信号。调整Y轴以检测0至50吸收单位范围内的低吸收水平。接下来，准备样品。检测样本来源于采用Mars柱去除14种最丰富蛋白质后的人血浆。去除高丰度蛋白的血浆样本以及两种标准品——人乳铁蛋白和酵母转化酶——均分别进行三份独立的胰蛋白酶消化和脱盐处理，方法如前所述。为中和样品，需在收集电泳洗脱液（EIT）的样品瓶中预先准备好中和缓冲液，用于MG四相范式。其中一瓶收集流穿液，另外三瓶收集洗脱液。每中和1毫升EIT大约需要1.5毫升缓冲液。目标中和pH值为7.0至8.0。务必使用pH指示试纸检测最终pH值。按照本方案后续所述方法对样品进行脱盐处理。为获得最佳效果，将样品重悬于1毫升缓冲液A中。进行三次实验重复，以便对数据进行比较和合并。为准备三次重复的样品，向30微升去除了Mars的胰蛋白酶消化血浆等量物或pe中加入三皮摩尔的胰蛋白酶、消化后的转化酶以及一微升高效液相色谱纯化的特异性乳铁蛋白凝集素。每次重复实验所用血浆蛋白量约为50微克。向样品中加入缓冲液A，使总体积达到330微升，即每次实验重复为110微升。可先使用AAL或SNA凝集素柱，首先运行两次空白方法，仅注入缓冲液A。确保所用凝集素柱与作为标准品使用的、先前经色谱纯化的特异性乳铁蛋白凝集素相对应。共进行七次高效液相色谱运行，每次注入的血浆样品之间注入一次空白样品。空白运行的组分无需收集。再次确认，应在收集脱盐及P-N-G-A-F消化后洗脱液的样品瓶中加入中和缓冲液，以确保样品被中和，此时样品即可用于质谱分析。使用一个1 mL Waters Oasis H-L-B-S-P-E小柱，对乳铁蛋白标准品和实验样品的每一份HBLC组分进行脱盐。首先将所需数量的小柱连接至真空 manifold。用1 mL含1%甲酸的80%乙腈润洗每个小柱。多联管真空泵上的真空计读数应为5至20英寸汞柱。用1.5毫升0.1%甲酸将萃取柱平衡。再次确认多联管真空泵上的真空计读数应为5至20英寸汞柱。将一份样品的全部体积上样至一个固相萃取柱中。此时，真空 manifold 上的真空表读数应为 2 至 2.5 英寸。汞的流速不应超过每分钟 1 毫升。使用每根小柱对应的单个标记收集管，用一毫升0.1%甲酸洗涤小柱三次。用一毫升含0.1%甲酸的80%乙腈洗脱糖肽，并通过向每个收集管中加入60微升0.5摩尔碳酸氢铵将洗脱液中和至pH 7.0至8.0。务必使用pH指示试纸检测最终pH值。使用真空离心机（如Thermo Savant Speed Vac）在35°C下浓缩洗脱的肽段，时间约为两小时，浓缩至约50微升。再次检测样品pH值，确保其在7.0至8.0之间。如有需要，可加入50毫摩尔的碳酸氢铵以提高pH值。如果最终样品体积大于100微升，则通过真空离心浓缩样品，直至体积降至50至100微升之间。最后，向每个样品管中加入250单位无甘油的肽-N-糖苷酶F（PNGase F），在37摄氏度下孵育过夜，以去除肽段上的N-连接糖链。在完成与PNGase F的过夜孵育后，使用含有反相C18基质的ZipTip吸头对样品进行脱盐处理，然后开始后续操作。在一块多聚甲醛上分别制备两个液滴，一个为0.1%甲酸溶液，另一个为80%乙腈加0.1%甲酸溶液，用于洗涤和洗脱。使用液滴可防止样品间肽段的交叉污染，每处理一个吸头尖端样品均需制备新的液滴。首先用乙腈溶液润湿Zip Tip，然后用10 µL 0.1%甲酸溶液上下吹打三次，以平衡Zip Tip。用移液器上下吹打10次上样。然后用10微升0.1%甲酸清洗枪头5次。最后用80%乙腈含1%甲酸溶液洗脱样品两次，将洗脱的肽段收集至离心管中。通过真空离心浓缩将样品体积减少至两微升以下，最后将样品重悬于20微升0.1%甲酸溶液中。样品现可进行液相色谱-质谱-质谱（L-C-M-S-M-S）分析。Porro偶联通常可产生每毫升2至20毫克的磁珠固定化凝集素浓度，此浓度适用于亲和色谱。胰蛋白酶消化的去火星人血浆经凝集素层析后，通常可使结合组分中的糖肽得到富集。我们的实验流程用于鉴定含有NXS或NXT（其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸）未连接共识序列的N-连接糖肽。PNGF处理可去除未连接的糖链，并使糖链所连接的天冬酰胺残基发生脱氨作用。脱甘露糖化会导致去糖基化肽段或去糖肽段相对于未修饰肽段产生一个道尔顿的质量偏移。因此，DEG糖肽被鉴定为含有N-连接共识序列的肽段，其中共识序列内的天冬酰胺残基发生脱酰胺化，表现为相对于未修饰的天冬酰胺残基质量增加一。以下两个示例谱图说明了这一概念。上方谱图显示了含有 EnLink 共有序列的未修饰肽段的碎片化情况。下方谱图显示了同一肽段在 EnLink 共有序列内天冬酰胺残基发生脱氨后的碎片化情况。与未修饰肽段中相应的碎片相比，脱氨肽段的 Y7、Y8 和 B3 碎片所对应的圆圈标记的分子离子质量均增加了 1 道尔顿。这种质量偏移表明，下方谱图中的肽段含有一个脱酰胺的天冬酰胺残基。通常使用QStar Elite仪器时，在流穿组分中可鉴定到1000至1300个总肽段，而在结合组分中可鉴定到200至400个肽段。平均而言，来自凝集素或SNA色谱的流穿组分中含有2%至4%的去糖基化肽段，而结合组分中回收的肽段有30%至50%为去糖基化肽段。我们使用“deg糖肽”这一术语而非“糖肽”，因为在质谱分析过程中观察到的是去糖基化和脱氨后的分子。然而，我们推测样本中大多数deg糖肽原本是未结合的糖肽，经PNGF处理后发生了去糖基化和脱氨反应。在结合样品中deg糖肽的富集支持了这一假设，使我们能够将D糖肽的检测作为凝集素亲和层析方法捕获糖肽的间接指标。在流穿组分中应观察到两种或多种不同的转化酶N-糖肽，在结合组分中应观察到两种或多种不同的去糖基化乳铁蛋白糖肽。我们刚刚向您展示了如何制备凝集素柱，并在高效液相色谱（HPLC）体系中进行凝集素亲和层析。在进行该实验时，重要的是起始使用高质量的糖肽样品，全程监测样品的pH值，并利用糖肽标准品确认层析结果的质量。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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