在单个突触前末梢通过FFN可视化多巴胺释放
2009年8月31日
一种利用荧光多巴胺类似物光学测量神经传递的新方法。
荧光假神经递质。FFN 511 是一种荧光单胺类物质，当施加于脑切片时，可作为突触前单胺转运体的底物。FFN 511 通过单胺转运体被多巴胺能突触小泡摄取，可用于直接可视化单胺能神经元（如纹状体中的神经元）突触前末梢的神经递质释放。递质从末梢释放的过程在切片中表现为点状荧光信号的减弱。
在本视频中，使用振动切片机制备了250微米厚的冠状脑片，用FFN 511染色后，通过双光子激光显微镜进行成像。实验展示了揭示iCal释放具有频率依赖性异质性的结果。大家好，我是来自哥伦比亚大学神经病学系David实验室的HU。
大家好，我是来自 Soldier 实验室的 Minerva。今天我们将向您展示一种使用荧光假性神经递质对脑切片中多巴胺末梢进行标记的实验方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究多巴胺的释放。
那么，让我们开始吧。在制备急性脑片之前，必须先将人工脑脊液（A CSF）充氧，并用冰预冷至少15分钟，此操作需在小鼠脑组织取出前完成。在解剖过程中，保持A CSF始终处于冰冻且充氧状态。从小鼠体内取出完整脑组织后，立即用万能胶将其固定在振动切片机的样品托上。脑组织的取出与固定操作必须在两分钟内完成。
将托盘中加入冷却的充氧人工脑脊液（A CSF），在+1.54至+0.623孔之间冠状切取厚度为250微米的脑片。将获得的脑片用针分割成六个半片。在室温下，将脑片置于充氧的人工脑脊液（A CSF）中孵育至少一小时，在孵育期间处理脑片。
在充氧的人工脑脊液（A CSF）中，通过将10毫摩尔的FFN 511储备液加入A CSF中，配制10微摩尔的FFN 511负载溶液。随后，在A CSF中配制100微摩尔的A-D-V-A-S-E-P七肽溶液，并将两种溶液分别充氧至少15分钟，然后再分别加入脑片中。每片脑组织切片用FFN 511负载溶液在室温下孵育30分钟。
接下来，通过将负载的脑片在室温下孵育于含氧的100微摩尔advers、7A人工脑脊液（CSF）中30分钟，以去除与细胞外组织结合的染料。脑片现可进行成像。FFN 511染色将在脑片中使用 Prairie Ultima 多光子激光扫描显微镜进行成像。将负载FFN 511的脑片置于记录室中，并以每分钟1至2毫升的流速持续灌注含氧人工脑脊液（CSF）。然后将带有尼龙丝的铂金丝网置于脑片上方，以尽量减少组织移动。
在实验过程中，为进一步减少组织移动，成像前需让脑片在孵育 chamber 中稳定至少 10 分钟。使用 10 倍水浸物镜在明场透射光下观察并定位背侧纹状体 AUM，将双极绞线钨电极放置于该区域，以进行刺激实验。静息成像区域位于 300 微米范围内。
将刺激性双极电极的两个尖端之间的区域置于视野图像中央，在63倍水浸紫外物镜下观察经FFN 511标记的Sal神经末梢。FFN 511由Spectral Physics的mi tai激光器在760纳米波长激发。通过带通滤光片观察Sal神经末梢的最佳荧光信号，并以12位格式采集图像，感兴趣区域为75 × 75微米，分辨率为512 × 512像素。此处展示了一张用FFN 511标记Sal多巴胺能神经末梢的示例图像。
在氯化钾滞留实验中，当高钾人工脑脊液溶液作用于脑片时，FFN 511 标记可在四分钟内被高浓度氯化钾、硫酸苯丙胺或电刺激诱导释放。通过记录 XYZT 图像，随时间追踪电刺激引起的 FFN 511 释放过程。在刺激前获取至少五分钟的 Z 轴堆栈对照时间序列图像，以确保脑片无明显移动，且激光未引起光漂白。在获取对照图像后，再进行后续实验。
在开始刺激的同时继续进行XYZT成像，刺激频率为1 Hz、4 Hz或20 Hz，通过由主控八通道脉冲发生器触发的IsoFlex刺激隔离器，利用极化电极对纹状体进行局部刺激。本视频展示了在脑片制备中FFN 511在胞吐过程中的释放情况。当FFN 511完全加载至SAL后，可观察到纹状体区域有丰富的标记，皮层区域标记稀疏，胼胝体则无标记。
通过高浓度氯化钾可以选择性地标记多巴胺末梢，这些代表性图像显示了在加入氯化钾之前以及加入70毫摩尔氯化钾两分钟后的标记情况。此外，也可通过苯丙胺实现对脑脊液中FFN 511标记的保留。此图像显示了给予苯丙胺前纹状体中FFN 511的标记情况。
尽管此图像显示的是用 20 微摩尔浓度的安非他明处理后 20 分钟时的纹状体，但这些图像展示的是局部电刺激引起的 FFN 511 标记情况，图像分别显示了刺激前、以及在 4 赫兹刺激开始后 217 秒和 514 秒时纹状体中的 FFN 511 标记。该归一化荧光强度随时间变化的曲线图显示，FFN 511 的释放具有钙离子依赖性和频率依赖性；未填充三角形代表的对照组未接受任何刺激；以未填充圆圈表示的氯化镉处理组的结果与未刺激对照组相同。
每种刺激频率对应的离散曲线由彩色圆圈表示，通过单指数衰减函数进行拟合，并根据 τ × 0.693 计算半衰期值。我们刚刚向您展示了如何将荧光递质探针 FFN511 装载到急性脑片中的多巴胺能神经末梢，以及如何通过高钾溶液和电刺激诱导其释放。这是首个能够在单个突触末梢水平上光学检测神经递质释放的方法。
进行此操作时，重要的是要始终注意保持切片的良好状态，并关注上样时间、背景漂白以及运动伪影等问题。切片在制备后可稳定加载FFN511并进行成像，持续时间可达四小时。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。
概述
本研究介绍了一种利用荧光多巴胺类似物（特别是FFN 511）光学测量神经传递的新方法。该技术可直接可视化脑切片中来自突触前末梢的多巴胺释放。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经传递
- 荧光成像
背景
- 荧光假神经递质可以模拟天然神经递质。
- FFN 511 是一种荧光单胺类物质，可被多巴胺能突触囊泡摄取。
- 该方法可揭示神经递质释放的动力学过程。
- 理解多巴胺的释放对于研究多种神经系统疾病至关重要。
研究目的
- 建立一种在脑切片中标记多巴胺末梢的操作步骤。
- 利用FFN 511可视化并定量多巴胺的释放。
- 研究多巴胺的频率依赖性释放特性。
使用的方法
- 制备小鼠急性脑切片。
- 用FFN 511孵育切片，并在充氧的人工脑脊液中培养。
- 使用多光子激光扫描显微镜进行成像。
- 开展刺激实验以观察多巴胺释放动力学。
主要结果
- FFN 511 能有效标记纹状体中的多巴胺神经末梢。
- FFN 511 的释放表现为荧光信号的减弱。
- 抑制实验揭示了多巴胺释放具有频率依赖性。
- 高浓度氯化钾和苯丙胺可使 FFN 511 从神经末梢被置换出来。
结论
- 该方法为实时研究多巴胺释放提供了可靠的手段。
- FFN 511 是研究神经传递的有力工具。
- 该方法可加深我们对大脑中多巴胺能信号传导的理解。
常见问题
行业重要性概述
在单个突触前终末直接可视化神经递质释放，可实现多巴胺能靶点验证中的机制性风险降低。该方法通过量化频率依赖性释放动力学以及突触囊泡群体的异质性，提供可预测的置信度。通过将突触前功能与刺激参数及受体调节相联系，该方法为早期发现阶段的决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过测量多巴胺释放随刺激频率的变化，验证治疗假设。
- 操作价值：利用FFN 511作为囊泡单胺转运体的底物，实现对突触前终末的功能性验证。
- 预测价值：揭示由D2受体调控的、具有频率依赖性的突触前终末异质性，为靶点选择和通路去风险化提供依据。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过荧光衰减提供神经递质释放的定量读数，从而实现不同刺激条件下检测方法的标准化。
- 操作价值：利用FFN 511脱染曲线的单指数拟合，支持释放动力学的可重复测量。
- 可扩展性：适用于急性脑切片中的多光子成像，可重复使用该平台进行化合物的比较筛选。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过在纹状体末梢中展示多巴胺D2受体依赖性的频率编码，将突触前释放动力学与疾病相关系统相连接。
- 机制去风险化：在测试条件下排除了动力学上不同的储备囊泡群体，从而优化了囊泡循环和释放概率的模型。
- 预测可信度：通过将刺激频率与释放比例及末梢异质性相关联，实现基于风险评估的推进预测。
流程与工作流整合
该方法通过提供突触前末梢多巴胺释放的直接、实时测量，可整合到早期发现工作流程中，支持在先导化合物确定前进行假设验证和生物学风险评估。
- 发现生物学：通过量化每次刺激的释放分数及其对刺激频率（1、4、20 Hz）的依赖性，检测突触前功能。
- 筛选：提供可直接用于检测的生物系统，并配备经验证的FFN 511加载与脱染协议，以实现神经递质释放测量的一致性。
- 分析：生成定量的因变量（随时间变化的归一化荧光强度、半衰期值），从而支持在不同条件、基因或药理学干预之间比较释放动力学。
- 转化研究：将突触前释放表型与D2受体调控关联，支持多巴胺能通路中生物标志物的比对。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像平台，用于在疾病模型和靶点验证研究中探究神经递质释放。
运营与企业影响
- 科学价值：为突触前释放概率及频率依赖性编码提供机制性见解，降低多巴胺能信号传导模型中的不确定性。
- 操作价值：通过标准化脑片制备、FFN 511 负载、脱色对照及多光子成像参数，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过揭示突触前异质性及受体介导的释放动态调节，优化“进行/不进行”决策。
- 项目影响：基于已验证的突触前功能与释放可预测性，支持对靶点进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备急性脑切片制备、多光子显微成像以及荧光探针操作方面的专业知识。
- 依赖于配备适当激发波长（760 nm）和适用于FFN 511发射滤光片的多光子激光扫描显微镜。
- 要求在不同实验之间标准化刺激参数（频率、持续时间、电极位置）以及脱色对照（KCl、苯丙胺、电刺激）。
- 针对不同脑区或疾病模型进行实验时，需考虑终末密度和转运蛋白表达水平的差异并进行相应调整。
- 受光漂白和运动伪影的限制，需要在切片制备后维持长达四小时的稳定期，并保持切片的生理健康状态。
