Name: 多巴胺的释放突触前货箱码头在个别的可视化与FFNs (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习使用荧光假神经递质FFN 511在小鼠脑切片中可视化多巴胺释放的方法。该技术通过多光子激光扫描显微镜实时观察突触前末梢的神经递质释放动态，为研究多巴胺能信号传导提供可靠工具。

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D. Sames 感谢 G. Harold 与 Leila Y. Mathers 慈善基金会以及哥伦比亚大学科学与工程计划的支持。 D. Sames 和 D. Sulzer 感谢麦克奈特基金会颁发的神经科学技术创新奖。 D. Sulzer 感谢美国国家药物滥用研究所（NIDA）、美国国家精神卫生研究所（NIMH）以及皮考尔基金会和帕金森病基金会的支持。 H. Zhang 感谢 NARSAD 的支持。 R.H. Edwards 感谢迈克尔·J·福克斯基金会、国家帕金森基金会、美国国家药物滥用研究所（NIDA）和美国国家精神卫生研究所（NIMH）的支持。 我们感谢 Robert Burke 提供 6-OHDA 注射及建议，Mark Sonders 提出的有益讨论，Merek Siu 在成像分析编程方面的帮助，以及 Jan Schmoranzer 在全内反射荧光显微镜（TIRF）系统搭建中提供的技术支持。

本方法已用于所报告的研究中 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">古贝纳托尔 等，科学 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a>.
1. 制备急性纹状体切片
<ol>
<li>在制备急性纹状体脑片之前，必须预先将人工脑脊液（ASCF）通氧，并用冰冷却至少15分钟，然后才能进行脑组织提取。在解剖过程中，保持ASCF处于冰冻且持续通氧的状态。ASCF配方（单位：mM）：NaCl 125，KCl 2.5，NaHCO3 26，CaCl2 2.4，MgSO4 1.3，KH2PO4 0.3，葡萄糖 10，HEPES 5；pH 7.3–7.4，渗透压 290–295 mOsm。</li>
<li>对雄性小鼠实施无麻醉斩首。</li>
<li>从小鼠体内取出完整脑组织，并使用Krazy®Glue将其固定在振动切片机的样品托上。脑组织的取出与固定过程必须在2分钟内完成。在此期间，务必保持ASCF处于冰冻且持续通氧的状态，以维持组织活性。</li>
<li>在前囟位置+1.54至+0.62 mm1范围内，沿冠状面切割厚度为250 μm的纹状体脑片。可获得3个完整的脑片，随后可用针将其分割为6个半片。</li>
<li>在室温下，将脑片置于持续通氧的ASCF中孵育至少1小时，然后再进行探针负载。脑片对FFN511的负载效果良好，在制备后4小时内均可保持活性并用于成像。</li>
</ol>
2. 加载 FFN511
<ol>
<li>配制FFN511加载液（含10μM FFN511的ACSF）；同时配制含100μM ADVASEP-7的ACSF。所有溶液均需现配，并在使用前至少氧合15分钟。</li>
<li>将脑片分别置于FFN511加载液中，在室温下孵育30分钟。</li>
<li>随后将加载后的脑片转移至含氧的100μM ADVASEP-7 ACSF溶液中，在室温下孵育30分钟，以去除与细胞外组织结合的染料2。此时脑片即可用于成像。</li>
</ol> 
3. 脑切片中FFN511的成像
使用多光子激光扫描显微镜对切片中的FFN511进行成像。我们采用Prairie Ultima多光子激光扫描显微镜（此前曾使用Zeiss LSM 510 NLO多光子激光扫描显微镜，部分结果由Zeiss显微镜获得）。
<ol>
<li>将载有FFN511的脑片置于记录室（RC-27L，Warner）中，并以氧合人工脑脊液（ACSF）以每分钟1-2 ml的流速进行灌流。然后在脑片上方放置带尼龙丝的铂金网格，以尽量减少实验过程中的移动。为进一步减少移动，在成像前需让脑片在记录室中稳定至少10分钟。</li>
<li>在10倍水浸物镜下，利用明场透射光观察并定位背侧纹状体。</li>
<li>若进行刺激实验，将双极绞合钨电极置于该区域。理想的成像区域位于刺激用双极电极两个尖端之间300 μm范围内。将该区域置于视野中央。</li>
<li>在63倍（0.9 NA）水浸紫外物镜下对FFN511标记的纹状体末梢进行成像。使用Spectral Physics公司的Mai Tai激光器在760 nm波长激发FFN511，通过带通滤光片（480-520 nm）可观察到纹状体末梢的最佳荧光信号。图像以12位格式采集，感兴趣区域为75 × 75 μm，分辨率为512 × 512像素。对于刺激去染实验，为补偿z轴漂移，每个时间点需在z轴方向以1 μm间隔采集5-7张z轴序列图像。</li>
</ol>
4. FFN511 脱色
FFN511 标记可通过高浓度 KCl（我们使用 70 mM KCl）、(+)-苯丙胺硫酸盐（AMPH，20 μM）或电刺激进行脱色。在 KCl 脱色实验中，当高钾人工脑脊液（ACSF）施加到脑切片时，FFN511 标记在 2 分钟内发生脱色。记录 xyz-t 图像以随时间追踪 FFN511 的脱色过程。以下描述依赖于电刺激的多巴胺末梢脱色：
<ol>
<li>为追踪 FFN511 随时间的脱染过程，需采集 xyz-t 图像。为确保脑片移动最小（z 轴方向小于 4 μm）且激光不引起光漂白，应在刺激前至少采集 5 分钟的 z 层扫描对照时间序列图像。否则，应调整激光功率。</li>
<li>在获取上述对照图像后，继续进行 xyz-t 成像，同时以 1、4 或 20 Hz 的频率开始刺激。通过由 Master-8 脉冲发生器（AMPI，Jerusalem，Israel）触发的 Iso-Flex 刺激隔离器，使用双极电极在纹状体局部施加 1、4 或 20 Hz（300 μs × 1 mA）的刺激。为尽量减少释放位点去极化的变异，我们采用的刺激方案为：刺激强度设定为通过循环伏安法确定的最大刺激强度的 150%。</li>
<li>使用适当的软件进行成像分析。在本实验室中，我们使用 Image J（Wayne Rosband，美国国立卫生研究院，Rockville，MD）以及基于 IDL（Research Systems，Boulder，CO）编写的自定义软件，对荧光斑点及其随时间的变化进行定量分析3。</li>
</ol>
代表性结果
图1显示FFN511在纹状体脑片中的加载现已完成。图1展示了使用10倍和60倍物镜拍摄的代表性图像。多巴胺能末梢的选择性标记可通过20 μM苯丙胺去染色。 图2显示高浓度KCl导致FFN511标记的去染色。 图3显示局部电刺激引起FFN511标记的去染色。
<img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="脑切片的荧光显微镜图像，显示对照和处理条件。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. FFN511 标记活体皮质-纹状体急性脑片中的多巴胺能神经末梢。(A) 急性活体皮质-纹状体脑片中 FFN511 的标记：纹状体（STR）中存在大量标记，皮质（CTX）中标记较少，胼胝体（CC）中无标记。比例尺：100 μm。(B) 苯丙胺诱导纹状体中 FFN511 荧光信号的消除。左图：苯丙胺处理前；右图：20 μM 苯丙胺处理 20 分钟后。比例尺：10 μm。
<img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="显微镜图像；细胞对KCl的反应。对照组与处理组之间的对比变化可见。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 图2. 高浓度KCl导致FFN511标记褪色。在ACSF中施加70 mM KCl后2分钟内，FFN511标记即发生褪色。比例尺：10μm。
<img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="神经元钙信号；荧光成像，衰减曲线；光激发分析；" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3. 
纹状体中FFN511标记的频率依赖性脱染。(A) 在t = 0时开始以4 Hz进行局部刺激，导致末梢发生脱染。比例尺：5 μm。(B) FFN511在4 Hz下的脱染具有Ca2+依赖性和频率依赖性。对照组未接受刺激（来自3个切片的153个 puncta）。加入氯化镉（200 μM）后的脱染情况与未刺激对照组相同（来自5个切片的475个 puncta）。各刺激频率下的脱染曲线均通过单指数衰减函数拟合，并根据τ × 0.693计算半衰期（t1/2）值（1 Hz：来自9个切片的765个 puncta；4 Hz：来自7个切片的410个 puncta；20 Hz：来自6个切片的416个 puncta）。请参见在纹状体脑片制备中通过双光子显微镜记录的FFN511在胞吐过程中脱染的视频显微图像。

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

在本视频中，我们演示了一种利用荧光多巴胺类似物光学可视化神经递质释放的方法。FFN511 是我们开发的第一代荧光神经递质探针（FFNs）。尽管该探针的设计靶向神经元囊泡单胺转运体（VMAT2），该转运体负责将单胺类神经递质从细胞质转运至突触囊泡，并特异性地标记纹状体中的多巴胺能末梢以及皮层中假定的儿茶酚胺和/或5-羟色胺能末梢（如《科学》论文所示），但由于 FFN511 具有相对较强的疏水性，因此适当的孵育时间对特异性至关重要。我们发现，在纹状体脑片中孵育超过 40 分钟会导致广泛的非特异性染色。通过使用高浓度 KCl 去染色，可直接评估其特异性，KCl 应促使功能性突触囊泡内的 FFN 释放。若脑片与 FFN511 接触时间少于 15 分钟，则因染料在末梢中加载不足，荧光信号将较弱。在本实验方案中，我们使用 100μM ADVASEP-7 去除染料在细胞外组织中的结合。此步骤并非必需，但如果省略，则需延长在人工脑脊液（ACSF）中的洗脱时间。总之，根据所选用的实验样本，您需要调整染料浓度和孵育时间，以确定最佳标记条件。

<table><tbody><tr><td>FFN511（8-(2-氨基-乙基)-2,3,5,6-四氢-1H,4H-11-氧杂-3a-氮杂-苯并[de]蒽-10-酮）</td><td>Columbia University - Dalibor Sames 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>RC-27L 记录室</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>PELCO PrepEze 6孔支架</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>用于脑片孵育</td></tr><tr><td>Master-8 脉冲刺激器与 Iso-Flex 刺激隔离器</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在单个突触前末梢通过ffn可视化多巴胺释放

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

神经系统通过突触小泡融合过程中的神经递质释放，在神经元之间传递信号。为了直接观察单个突触前终末对神经递质的摄取和释放，我们设计了荧光假性神经递质作为突触小泡单胺转运体的底物。利用这些探针成像纹状体中的多巴胺释放，我们获得了若干与突触可塑性相关的发现。我们发现，每次刺激时释放神经递质的突触小泡比例依赖于刺激频率。在这些实验条件下，未观察到动力学上独立的“储备”突触小泡群体。研究揭示了突触前终末存在频率依赖性的异质性，该特性部分依赖于D2多巴胺受体，提示了一种突触前选择的频率依赖性编码机制。

Hui Zhang 和 Niko G. Gubernator 对本工作贡献相同。

一种利用荧光多巴胺类似物光学测量神经传递的新方法。

在单个突触前末梢通过FFN可视化多巴胺释放

神经系统通过突触小泡融合过程中的神经递质释放，在神经元之间传递信号。为观察神经递质的摄取和……

荧光假神经递质。FFN 511 是一种荧光单胺类物质，当施加于脑切片时，可作为突触前单胺转运体的底物。FFN 511 通过单胺转运体被多巴胺能突触小泡摄取，可用于直接可视化单胺能神经元（如纹状体中的神经元）突触前末梢的神经递质释放。递质从末梢释放的过程在切片中表现为点状荧光信号的减弱。在本视频中，使用振动切片机制备了250微米厚的冠状脑片，用FFN 511染色后，通过双光子激光显微镜进行成像。实验展示了揭示iCal释放具有频率依赖性异质性的结果。大家好，我是来自哥伦比亚大学神经病学系David实验室的HU。大家好，我是来自 Soldier 实验室的 Minerva。今天我们将向您展示一种使用荧光假性神经递质对脑切片中多巴胺末梢进行标记的实验方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究多巴胺的释放。那么，让我们开始吧。在制备急性脑片之前，必须先将人工脑脊液（A CSF）充氧，并用冰预冷至少15分钟，此操作需在小鼠脑组织取出前完成。在解剖过程中，保持A CSF始终处于冰冻且充氧状态。从小鼠体内取出完整脑组织后，立即用万能胶将其固定在振动切片机的样品托上。脑组织的取出与固定操作必须在两分钟内完成。将托盘中加入冷却的充氧人工脑脊液（A CSF），在+1.54至+0.623孔之间冠状切取厚度为250微米的脑片。将获得的脑片用针分割成六个半片。在室温下，将脑片置于充氧的人工脑脊液（A CSF）中孵育至少一小时，在孵育期间处理脑片。在充氧的人工脑脊液（A CSF）中，通过将10毫摩尔的FFN 511储备液加入A CSF中，配制10微摩尔的FFN 511负载溶液。随后，在A CSF中配制100微摩尔的A-D-V-A-S-E-P七肽溶液，并将两种溶液分别充氧至少15分钟，然后再分别加入脑片中。每片脑组织切片用FFN 511负载溶液在室温下孵育30分钟。接下来，通过将负载的脑片在室温下孵育于含氧的100微摩尔advers、7A人工脑脊液（CSF）中30分钟，以去除与细胞外组织结合的染料。脑片现可进行成像。FFN 511染色将在脑片中使用 Prairie Ultima 多光子激光扫描显微镜进行成像。将负载FFN 511的脑片置于记录室中，并以每分钟1至2毫升的流速持续灌注含氧人工脑脊液（CSF）。然后将带有尼龙丝的铂金丝网置于脑片上方，以尽量减少组织移动。在实验过程中，为进一步减少组织移动，成像前需让脑片在孵育 chamber 中稳定至少 10 分钟。使用 10 倍水浸物镜在明场透射光下观察并定位背侧纹状体 AUM，将双极绞线钨电极放置于该区域，以进行刺激实验。静息成像区域位于 300 微米范围内。将刺激性双极电极的两个尖端之间的区域置于视野图像中央，在63倍水浸紫外物镜下观察经FFN 511标记的Sal神经末梢。FFN 511由Spectral Physics的mi tai激光器在760纳米波长激发。通过带通滤光片观察Sal神经末梢的最佳荧光信号，并以12位格式采集图像，感兴趣区域为75 × 75微米，分辨率为512 × 512像素。此处展示了一张用FFN 511标记Sal多巴胺能神经末梢的示例图像。在氯化钾滞留实验中，当高钾人工脑脊液溶液作用于脑片时，FFN 511 标记可在四分钟内被高浓度氯化钾、硫酸苯丙胺或电刺激诱导释放。通过记录 XYZT 图像，随时间追踪电刺激引起的 FFN 511 释放过程。在刺激前获取至少五分钟的 Z 轴堆栈对照时间序列图像，以确保脑片无明显移动，且激光未引起光漂白。在获取对照图像后，再进行后续实验。在开始刺激的同时继续进行XYZT成像，刺激频率为1 Hz、4 Hz或20 Hz，通过由主控八通道脉冲发生器触发的IsoFlex刺激隔离器，利用极化电极对纹状体进行局部刺激。本视频展示了在脑片制备中FFN 511在胞吐过程中的释放情况。当FFN 511完全加载至SAL后，可观察到纹状体区域有丰富的标记，皮层区域标记稀疏，胼胝体则无标记。通过高浓度氯化钾可以选择性地标记多巴胺末梢，这些代表性图像显示了在加入氯化钾之前以及加入70毫摩尔氯化钾两分钟后的标记情况。此外，也可通过苯丙胺实现对脑脊液中FFN 511标记的保留。此图像显示了给予苯丙胺前纹状体中FFN 511的标记情况。尽管此图像显示的是用 20 微摩尔浓度的安非他明处理后 20 分钟时的纹状体，但这些图像展示的是局部电刺激引起的 FFN 511 标记情况，图像分别显示了刺激前、以及在 4 赫兹刺激开始后 217 秒和 514 秒时纹状体中的 FFN 511 标记。该归一化荧光强度随时间变化的曲线图显示，FFN 511 的释放具有钙离子依赖性和频率依赖性；未填充三角形代表的对照组未接受任何刺激；以未填充圆圈表示的氯化镉处理组的结果与未刺激对照组相同。每种刺激频率对应的离散曲线由彩色圆圈表示，通过单指数衰减函数进行拟合，并根据 τ × 0.693 计算半衰期值。我们刚刚向您展示了如何将荧光递质探针 FFN511 装载到急性脑片中的多巴胺能神经末梢，以及如何通过高钾溶液和电刺激诱导其释放。这是首个能够在单个突触末梢水平上光学检测神经递质释放的方法。进行此操作时，重要的是要始终注意保持切片的良好状态，并关注上样时间、背景漂白以及运动伪影等问题。切片在制备后可稳定加载FFN511并进行成像，持续时间可达四小时。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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