绒毛膜和卵黄膜的机械去除：一种制备方法 黑腹果蝇 用于直接观察的卵母细胞

- 开始 与 成熟 卵母细胞 从 固定的 卵巢 在一个 生理盐水 溶液 成熟 卵母细胞 熊 蛋壳 由……组成 的 一个 外层 绒毛膜 和 内层 卵黄 膜

为 机械性去除 卵壳 和 绒毛膜 以及 卵黄 膜，将 卵母细胞 置于 两片 经 预处理 的 载玻片 的 磨砂面 之间。移动 上方 的 载玻片 进行 直线 来回 运动 以 产生 摩擦力 使 卵母细胞 滚动 。

现在， 移动 的 顶部 载玻片 在 a 轻微 角度 到 滚动 的 卵母细胞 在 另一个 方向。 避免 圆形 运动 增加 这 角度 在 短 增量 直到 的 顶部 载玻片 移动 垂直的 到 的 底部 载玻片 这 运动 机械地 去除 的 绒毛膜 和 卵黄 膜， 使能够 获取 用于 探针 或 染色剂 进入 的 卵母细胞

卵母细胞 无 绒毛膜 将 出现 长 和 薄的 和 那些 无 卵黄 膜 将 有 尖的 末端 至 分离 的 已清除 卵母细胞 从 的 周围 碎片 转移 的 样本 混合 至 a 管 和 允许 的 卵母细胞 到 沉淀 到 的 底部 而 的 碎片 浮游物 在 的 顶部 和 能 是 已移除。

在 本 方案中，我 将 去除 绒毛膜 和 卵黄 膜 ， 以 Drosophila 成熟卵母细胞为材料。

- 至 分离 的 晚期 卵母细胞， 首先， 添加 1 毫升 的 PBSBTx 到 a 浅的 解剖 培养皿 然后， 使用 a P200 与 a BSA包被的 尖端 到 转移 固定的 卵巢 进入 的 浅层 培养皿 移液器 的 卵巢 向上 和 向下 与 的 BSA包被的 移液器 提示 到 移除 的 成熟 卵母细胞 从 的 较少 成熟 卵母细胞

当 晚期 卵母细胞 是 足够地 分离的， 转移 全部 的 组织 至 a 500微升 微型离心机 管 移除 过量 液体 与 a 拉出 巴斯德 移液器 离开 关于 150 到 200 微升 在 的 管

准备 卵母细胞 翻滚 操作 时， 先 用 200 µL PBSBTx 预润湿 一 个 深孔 培养皿， 盖好 后 置于 一旁备用。

获取 三 霜状 玻璃 载玻片 和 设置 载玻片 三 暂存。 接下来， 轻柔地 揉搓 的 霜状 玻璃 区域 的 载玻片 一 和 二 一起。 冲洗 它们 在 去离子 水 到 移除 任何 玻璃 碎片 和 干燥 与 a 一次性 擦拭。 包被 的 磨砂的 区域 的 载玻片 一 和 二 与 PBSBTx 由 添加 50 微升 的 PBSBTx 至 一 载玻片 和 揉搓 这 区域 与 的 其他 载玻片 移除 的 液体 与 a 一次性 擦拭 和 位置 的 载玻片 下 a 解剖 显微镜 保持 的 磨砂的 区域 的 载玻片 一 和 二 在 接触 与 载玻片 三 支持 载玻片 二

为了 滚动 的 卵母细胞， 首先， 预润湿 a P200 移液器 尖端 在 PBSBTx 和 分散 的 卵母细胞 在 的 微型离心机 管 由 移液 向上 和 向下 转移 50 微升 的 液体 含有 的 卵母细胞 到 的 中心 的 的 霜状 玻璃 部分 的 载玻片 一。 提升 载玻片 二 到 做 此。

缓慢地 较低 载玻片 二 直到 的 表面 张力 的 的 液体 生成 a 密封 之间 的 二 霜状 玻璃 区域。 有 应该 是 足够 液体 到 盖子 的 磨砂的 面积, 但 无 应该 是 渗出 出。 然后， 保持 的 底部 载玻片 一 在 位置 与 一 手 和 使用 的 其他 手 到 移动 的 顶部 载玻片 二 返回 和 向前 在 a 水平的 方向, 保持 载玻片 二 水平 和 支持的 开启 载玻片 三

执行 在……下方 a 显微镜 用于 简单 可视化 的 卵母细胞 运动 和 进展 之后 a 少数 运动 在 的 水平的 方向, 轻微地 改变 的 角度 的 运动 在 多个 增量 逐渐地 增加 这 角度 至 90 度 直到 运动 的 的 顶部 载玻片 二 是 垂直的 到 的 开始 方向。 注意 那 空 绒毛膜 将 是 可见的 在 的 液体 和 卵母细胞 缺乏 绒毛膜 将 出现 更长 和 较薄的

- 当 滚动 的 卵母细胞， 确保 那个 的 方向 的 滚动 是 始终 在 a 直的 线 和 从不 a 圆形 运动

- 重复 的 滚动 关于 7 到 10 次 直到 的 溶液 变为 轻微地 浑浊。 停止 滚动 当 的 大多数 的 卵母细胞 出现 到 有 丢失 他们的 卵黄 膜

轻柔地 提起 的 顶部 载玻片 二， 拖拽 一 的 它的 角落 到 的 中心 的 的 霜状 区域 在 的 底部 载玻片 一 因此 那 的 卷曲的 卵母细胞 积累 在 的 中心 的 的 磨砂的 区域 冲洗 的 卵母细胞 从 两者 载玻片 与 PBSBTx 进入 的 深孔板 培养皿 含有 PBSBTx

清洁 载玻片 一 和 二 与 超纯 水 干燥 与 a 一次性 擦拭 和 重置。 重复 这些 步骤 直到 全部 的 卵母细胞 的 的 相同 基因型 有 已经 卷起。 这 通常 需要 三 到 四 轮次 的 滚动 每 基因型

为了 移除 碎片 之后 滚动， 添加 1 毫升 PBSBTx 到 a 15毫升 圆锥形的 管 涡旋混合 的 液体 到 涂层 的 侧面 的 的 管 使用 a PBSBTx-包被的 P1000 移液器 尖端， 转移 的 卷曲的 卵母细胞 从 的 深孔板 培养皿 至 的 圆锥形的 管 含有 1 毫升 的 PBSBTx 添加 一个 额外的 2 毫升 的 PBSBTx 到 的 锥形 管 含有 的 卵母细胞

保持 的 圆锥形的 管 对抗 a 暗 背景 至 见 的 不透明的 卵母细胞 作为 他们 水槽 之后 让 的 卵母细胞 沉淀 到 的 底部 使用一个 P1000 到 移除 的 顶部 2 毫升 的 溶液 含有 碎片 和 弃去。

之后 重复 的 步骤 用于 a 总计 的 三 轮次 的 碎片 去除， 使用 a PBSBTx 涂层 P1000 移液器 尖端 到 转移 的 卵母细胞 返回 到 的 原始 500微升 微型离心机 管 20 到 25 雌性 应该 产量 大约 50 微升 的 卷曲的 成熟 卵母细胞