绒毛膜和卵黄膜机械去除:一种制备用于直接观察的果蝇卵母细胞的方法

- 从盐水溶液中固定卵巢的成熟卵母细胞开始。成熟的卵母细胞带有由外绒毛膜和内卵黄膜组成的蛋壳。

为了机械地去除绒毛膜和卵黄膜，将卵母细胞放在两个预处理过的载玻片的磨砂部分之间。以笔直的来回运动移动顶部载玻片，以产生滚动卵母细胞的摩擦力。

现在，以一个小角度移动顶部载玻片，使卵母细胞向另一个方向滚动。为避免圆周运动，以短增量增加此角度，直到顶部滑块垂直于底部滑块移动。这种运动机械地去除绒毛膜和卵黄膜，使探针或染色剂能够进入卵母细胞。

没有绒毛膜的卵母细胞会显得又长又薄，而没有卵黄膜的卵母细胞会显得尖尖的末端。为了将清除的卵母细胞与周围的碎屑分离，将样品混合物转移到试管中，让卵母细胞沉降到底部，而碎屑漂浮在顶部，可以去除。

在该协议中，我们将从成熟的果蝇卵母细胞中去除绒毛膜和卵黄素膜。

- 要分离晚期卵母细胞，首先，将 1 毫升 PBSBTx 添加到浅解剖皿中。然后，使用带有 BSA 涂层尖端的 P200 将固定的卵巢转移到浅培养皿中。用涂有 BSA 的移液器吸头上下移液卵巢，以将成熟卵母细胞从不太成熟的卵母细胞中移出。

当晚期卵母细胞充分分离时，将所有组织转移到 500 μL 微量离心管中。用拉动的巴斯德移液管去除多余的液体，在试管中留下约 150 至 200 微升。

为了准备卵母细胞滚动，请用 200 μL PBSBTx 预润湿深孔培养皿。盖上培养皿并放在一边。

获得 3 张磨砂载玻片，并将 3 张载玻片放在一边。接下来，轻轻地将载玻片 1 和 2 的磨砂玻璃区域摩擦在一起。用去离子水冲洗它们以去除任何玻璃碎片并用一次性湿巾擦干。通过向一张载玻片中加入 50 微升 PBSBTx 并用另一张载玻片摩擦该区域，用 PBSBTx 涂覆载玻片 1 和 2 的磨砂区域。用一次性抹布去除液体，并将载玻片置于解剖显微镜下。保持载玻片 1 和 2 的磨砂区域与支撑载玻片 2 的载玻片 3 接触。

要滚动卵母细胞，首先，在 PBSBTx 中预润湿 P200 移液器吸头，然后通过上下移液将卵母细胞分散在微量离心管中。将 50 微升含有卵母细胞的液体转移到载玻片 1 的磨砂玻璃部分的中心。抬起滑梯 2 来执行此作。

慢慢降低载玻片 2，直到液体的表面张力在两个磨砂玻璃区域之间形成密封。应该有足够的液体来覆盖磨砂区域，但不应有液体渗出。然后，用一只手将底部幻灯片 1 固定到位，用另一只手沿水平方向来回移动顶部幻灯片 2，保持幻灯片 2 水平并支撑在幻灯片 3 上。

在显微镜下进行，以便轻松观察卵母细胞的运动和进展。在水平方向上移动几次后，稍微改变移动角度。以多个增量逐渐将此角度增加到 90 度，直到顶部滑轨 2 的移动垂直于起始方向。请注意，液体中可以看到空的绒毛膜，而缺乏绒毛膜的卵母细胞会显得更长更薄。

- 滚动卵母细胞时，确保滚动方向始终在直线上，而不是圆周运动。

- 重复滚动约 7 到 10 次，直到溶液变得略微浑浊。当大多数卵母细胞似乎已经失去卵黄膜时，停止滚动。

轻轻提起顶部幻灯片 2，将其角之一拖动到底部幻灯片 1 的磨砂区域的中心，使滚动的卵母细胞积聚在磨砂区域的中心。用 PBSBTx 将两张载玻片上的卵母细胞冲洗到含有 PBSBTx 的深孔培养皿中。

用超纯水清洁载玻片 1 和 2。用一次性湿巾擦干并重置。重复这些步骤，直到相同基因型的所有卵母细胞都被滚动。这通常需要每个基因型进行 3 到 4 轮滚动。

为了去除滚动后的碎屑，将 1 毫升 PBSBTx 添加到 15 毫升锥形管中。旋转液体以覆盖管的侧面。使用 PBSBTx 涂层的 P1000 移液器吸头，将卷起的卵母细胞从深孔培养皿转移到含有 1 毫升 PBSBTx 的锥形管中。在含有卵母细胞的锥形管中再添加 2 毫升 PBSBTx。

将锥形管放在深色背景上，以便在不透明的卵母细胞下沉时看到它们。让卵母细胞沉降到底部后，使用 P1000 去除顶部 2 毫升含有碎屑的溶液并丢弃。

重复该步骤总共三轮碎屑清除后，使用涂有 PBSBTx 的 P1000 移液器吸头将卵母细胞转移回原来的 500 μL 微量离心管中。20 至 25 名雌性应产生大约 50 μL 的成熟卵母细胞卷起。