胰腺细胞中钙动力学的成像：一种研究胰岛细胞质钙浓度实时变化的技术

胰岛是一类分泌激素的胰腺细胞群，其在维持葡萄糖稳态中发挥关键作用。葡萄糖浓度升高会引发钾离子通道关闭，阻止钾离子外流，从而导致细胞膜去极化。随后，电压依赖性钙离子通道打开，允许钙离子内流。细胞质内钙离子浓度的升高可刺激胰岛素等激素的释放。为实时成像细胞质内钙离子动态变化，可将少量负载了合适钙离子指示染料的胰岛转移至预组装细网隔片的壁间区域。

将网状结构倒置放置于倒置显微镜成像室内的盖玻片上。放置粗网和重物以固定细胞。向成像室内加入成像溶液。随后，建立灌流系统以引入葡萄糖或感兴趣的测试激素。细胞内预先加载的荧光钙指示剂可报告胞质钙浓度的任何升高。当与钙离子结合时，指示剂分子的荧光发射会显著增强。在以下实验方案中，我们将展示小鼠胰岛在葡萄糖灌流刺激下钙动态的实时成像。

— 为了固定胰岛以便成像，组装一个用于倒置显微镜的成像腔室，并将玻璃盖玻片放入腔室内。确保玻璃与腔室的接口密封不漏水，并确认盖玻片位于显微镜物镜的可及范围内。接下来，裁剪20 × 20毫米的细网和粗网方片，并使用45至50微米厚的粘性胶带在细网片上制作两条间隔壁。将粗网和一个重物浸入盛有成像溶液的35毫米培养皿中，然后将细网置于解剖显微镜下。

将带有间隔壁的细网翻转，使间隔壁朝上，用P20移液器将数个胰岛转移至两个间隔壁之间。使用钟表匠镊子将细网倒置放入倒置显微镜的成像室中，使间隔壁朝下，直接接触腔室盖玻片，从而将胰岛固定在间隔壁与细网之间，并位于盖玻片中央。

注意保持网格充分水化，但不要含有过量溶液，以免引起样本的侧向移动。

— 然后，将粗网和重物放置在腔室中细网的上方，并向腔室内加入成像溶液。待胰岛固定后，在倒置显微镜上选择成像模式和物镜，将含有胰岛的腔室置于显微镜的温控载物台上。设置灌流系统后，使腔室内的流入端位置低于流出端，并调节流出流速大于流入流速。

确保流出液与溶液的接触尽可能减少，以便以多次连续的小液滴形式排出溶液，避免长时间连续排出溶液。接着，使用含有3毫摩尔葡萄糖的成像溶液启动灌流，并选择适合绿色荧光染料成像的光路和滤光片。然后，进行活体成像以设定成像参数，并调整视野以捕获目标胰岛。

为了优化图像的信噪比，调节激发光强度、曝光时间和像素合并（binning）参数，确保在尽可能低的光照强度和曝光条件下，能够清晰地观察到胰岛内每个细胞。随后以 0.1 至 5 赫兹的频率对胰岛进行成像，并在数据采集过程中实时检查所获取数据的质量。