胰腺细胞中钙动力学成像:一种研究胰岛胞质钙浓度实时变化的技术

- 胰岛是一组产生激素的胰腺细胞，在维持葡萄糖稳态中起着至关重要的作用。葡萄糖浓度升高会触发钾离子通道的闭合，阻止钾离子外流，导致膜去极化。因此，电压依赖性钙离子通道打开，允许钙离子流入。这种细胞溶质钙浓度的增加会刺激胰岛素等激素的释放。为了对胞质钙动力学进行实时成像，在预组装的细网的间隔壁之间转移几个装有合适钙指示剂染料的胰岛。

将网片倒置在倒置显微镜成像室内的盖玻片上。放置粗网和重物以固定细胞。将成像溶液加入腔室中。接下来，设置灌注系统以引入葡萄糖或感兴趣的测试激素。在细胞内，预装荧光钙指示剂报告了胞质钙浓度的任何增加。与钙离子结合后，指示剂分子的荧光发射显著增加。在以下方案中，我们将展示小鼠胰岛中钙动力学响应葡萄糖灌注的实时成像。

- 为了固定胰岛进行成像，请为倒置显微镜组装一个成像室，并在腔室内放置一个玻璃盖玻片。确保玻璃室接口是防水的，并确认盖玻片在显微镜物镜的触手可及范围内。接下来，切割 20 X 20 毫米见方的细网和粗网，并使用 45 到 50 微米的厚胶带在一块细网上创建两个间隔壁。将粗网片和砝码浸入 35 毫米成像液培养皿中，并将细网片置于解剖显微镜下。

转动细网，垫片壁倒置，垫片朝上，并使用 P20 移液器在两个垫片之间转移多个胰岛。使用制表师的镊子，将网片倒置在倒置显微镜的成像室内，使垫片朝下，直接位于腔室盖玻片上，将垫片和网片之间的胰岛困在盖玻片中间。

- 注意网片水合良好，不含过量的溶液，否则会引起样品的横向运动。

- 然后，将粗网和重物放在腔室中细网的顶部，并将成像溶液添加到腔室中。固定胰岛后，在倒置显微镜上选择成像模式和物镜，并将带有胰岛的腔室放在显微镜的温控载物台上。设置熔流后，将流入量置于腔室内低于流出量的位置，并将流出通量设置为大于流入通量。

确保流出口与溶液的接触最小，以便它以多个连续的小液滴的形式去除溶液，等待长时间的连续溶液去除。接下来，用含有 3 毫摩尔葡萄糖的成像溶液开始 perifusion 并选择用于绿色荧光团成像的光路和滤光片。然后，运行实时成像以设置成像参数并调整视图以捕获感兴趣的胰岛。

为了优化图像的信噪比，请调整激发光强度、曝光时间和像素合并，确保这些设置允许以尽可能小的光强度和曝光对胰岛内的每个细胞进行清晰的可视化。然后，以 0.1 至 5 赫兹的频率对胰岛进行成像，在捕获时检查采集数据的质量。