PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

该程序的总体目标是确定 RNA 结合蛋白或 RVP 的转录组宽结合位点。这是通过首先使用光反应性核苷类似物对新生转录本进行体内标记来实现的。该程序的第二步是通过 365 纳米紫外光交联 RNA 和 RNA 结合蛋白。

该程序的第三步是免疫沉淀所研究的 RNA 结合蛋白并恢复与 RNA 的交联。该程序的最后一步是将 RNA 转化为 CD NA 文库和深度序列。最终可以获得显示 RVP 的转录组宽结合位点的结果，并能够定义 RNA 识别元件及其结合偏好。

大家好，我是来自纽约洛克菲勒大学 Tom SEL 实验室的 Marcus Hoffner。今天，我们将展示一种称为 par lip 或可光肋核苷类似物增强交联和免疫沉淀的方法。我们在实验室中使用该程序，通过其 RNA 结合蛋白的规模结合位点及其结合基序和偏好在转录组上进行鉴定。

好了，让我们开始吧。体内 UV 交联从层流罩开始。在该协议中，我们将使用标记的 IGF 两个 BP 一个细胞作为使用无菌技术的示例模型。

在 HEK 2 93 细胞培养基中，使用 100 至 400 倍 10 到 6 个细胞，将稳定表达标志 HA 标记的 IGF 的 2 个 BP 1 个在 Tet 阻遏物控制下的 HEK 2 93 细胞扩增至第 6 个细胞，并将它们培养至约 80% 共流畅度。在交联前 14 小时，细胞具有硫代尿苷或 SU 的光反应性核苷类似物直接到细胞培养基上。或者，可以使用第 6 坚尼或第 6 个 SG，在加入光反应性核苷后诱导表达标志 HA 标记的 IGF 2 BP，一个通过加入多西环素细胞，然后在细胞培养箱中孵育过夜。

接下来，倒出生长培养基。然后每板用 10 毫升冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞一次。然后通过倾析完全去除 PBS。

将未覆盖的板放在装有冰的托盘上，并在紫外线照射后用跨接针 2、400 紫外线交联剂或等效物用 365 纳米紫外线照射它们，用橡胶警察在每板 1 毫升 PBS 中刮掉细胞。将细胞转移至 50 mL 离心管中，并在 4 摄氏度下以 500 G 离心 5 分钟。丢弃超级名称并保留细胞沉淀。

此时，细胞沉淀可以在液氮中快速冷冻，并在零下 80 度下储存至少 12 个月。要继续该过程，请将沉淀悬浮在三个体积的 1 X NP 40 裂解缓冲液中，并在冰上孵育 10 分钟。在 4 摄氏度下以 13， 000 G 离心 15 分钟，以清除细胞裂解物。

离心后，通过 5 微米膜针式过滤器过滤裂解液，进一步清除裂解液。最后，加入 RNA T one 至终浓度为 1 单位/微升，并在 22 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟。随后，在冰上冷却反应 5 分钟。

在体内 UV 交联后。准备用于免疫沉淀的磁珠。将每 1 mil 细胞裂解物中 10 μL dyna beads 蛋白 G 磁性颗粒转移到 1.5 ml 微量离心管中。

然后将装有磁珠的试管放在磁力架上 1 到 2 分钟。取出上清液，并在试管上时向试管中加入 1 毫升柠檬酸盐磷酸盐缓冲液。接下来，盖上试管并涡旋样品以重悬珠子。

短暂离心以收集管盖中残留的任何微珠。再加入 1 mL 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液，重复此洗涤。洗涤复苏后，以甜菜悬浮液原始体积两倍的体积悬浮珠子和柠檬酸盐磷酸盐缓冲液。

然后，每 1 毫升节拍混悬液中加入 0.25 毫克 Anti-Flag M 二单克隆抗体。孵育后，在室温下将悬浮液在旋转轮上孵育 40 分钟，如前所述，在 1 毫升柠檬酸盐磷酸盐缓冲液中洗涤珠子两次，这种洗涤用于去除洗涤 Resus 后任何未结合的抗体，像之前一样悬浮珠子和柠檬酸盐磷酸盐缓冲液。要开始免疫沉淀，将新鲜制备的抗体偶联磁珠添加到 RNA T one 处理的细胞裂解物中。

将混合物转移到 15 毫升离心管中，并在 4 摄氏度下旋转 1 小时。孵育后，收集磁珠，弃去上清液，将磁珠重悬于 1 mL IP 洗涤缓冲液中，然后将它们转移到 1.5 mL 离心管中。如前所述，在 1 毫升 IP 洗涤缓冲液中洗涤珠子两次。

最后一次洗涤后，复苏将磁珠悬浮在 IP 洗涤缓冲液的原始磁珠体积中。然后加入 RNAT 1 至终浓度为 100 单位/微升。将微珠悬浮液在 22 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟。

然后将悬浮液在冰上冷却 5 分钟。接下来，在 1 毫升高盐洗涤缓冲液中洗涤珠子 3 次。然后将磁珠重悬于一个原始磁珠体积的去磷酸化缓冲液中。

添加小牛肠道碱性磷酸酶至终浓度为 0.5 单位/微升，并在 37 摄氏度下孵育悬浮液 10 分钟。在 1 毫升磷酸酶洗涤缓冲液中洗涤珠子两次，然后在不含 DTT 的多核苷酸激酶或 PNK 缓冲液中再洗涤两次。最后，将磁珠重悬于一个原始磁珠体积的 PNK 缓冲液中。

开始对交联 RNA 进行放射性标记。将 γ 32、PATP 和 T 4 PNK 添加到新鲜制备的微珠悬浮液的一个原始微珠体积中。将悬浮液在 30 摄氏度下孵育 37 分钟。

接下来，将非放射性 A TP 添加到悬浮液中，并在 37 摄氏度下再孵育 5 分钟。然后用 800 微升不含 DTT 的 PNK 缓冲液洗涤磁珠五次。最后，将珠子重悬于 70 μL 的 SDS 页面中。

上样缓冲液将放射性标记悬液在 95 摄氏度的加热块中孵育 5 分钟，以使免疫沉淀的 RNA 结合蛋白与交联 RNA 变性并释放出来。然后去除分离器上的磁珠，将 super natin 转移到干净的 1.5 毫升微量离心管中，每孔加载 40 微升 suade novox bis triss 4 至 12% 预制聚丙烯酰胺凝胶，并在 200 伏特下运行凝胶 55 分钟。凝胶电泳后，拆卸凝胶腔室并拆除板，将凝胶固定在一个板上，以便于凝胶与磷酸化成像仪纸质打印输出对齐。

在凝胶角不对称地植入三个微小的放射性凝胶块。用塑料薄膜（如 Saran wrap）包裹凝胶以避免污染。将凝胶暴露在空白磷酸化成像仪屏幕上 1 小时，然后在磷酸化成像仪上暴露。

接下来，使用植入的凝胶片将凝胶对准磷酸成像仪打印输出的顶部。剪下与 RNA 结合蛋白或 RBP 的预期大小相对应的条带。将条带转移到 dtu 透析器 MIDI 管中，并加入 800 微升 1 个 XSDS 电泳缓冲液电洗脱液。

根据制造商的说明，100 伏特的交联 R-N-A-R-B-P 络合物持续两小时。电洗脱后。添加蛋白酶 K 缓冲液和蛋白酶 K，在 55 摄氏度下孵育溶液 30 分钟。

通过酸性苯酚氯仿异戊醇萃取回收 RNA，然后进行氯仿萃取。然后加入 1 微升糖原，并通过加入 3 体积的乙醇沉淀 RNA。最后，将所得沉淀溶解在 10.5 微升水中。

回收 RNA 后，通过标准 CDNA 文库制备方案进行，并对序列读数进行仔细的生物信息学分析。用表达标志 H ha 标记的 IGF 2 BP 1 的 HK 2 93 细胞进行的 par 剪辑的代表性结果显示，与光反应性核苷类似物 4 SU 和 6 SG 交联效率替代光反应性核苷 6 SG 的交联效率通常低于 4 su。较低的交联效率可能导致来自丰富细胞 RNA 片段的序列的背景较高，因此最初应使用更多的细胞进行实验。

将不同的 par clip 光反应性尿苷类似物与传统的 UV 2 54 纳米交联或夹子进行比较，如图所示。UV 2 54 纳米 RNA 蛋白交联对交联效率有限。适当大小的放射性条带的强度表明 par clip 实验是否有效，以及是否分离出足够的 RNA 以通过小 RNA 测序方案。

生物信息学分析后测序读数中特征突变的频率表明交联序列成功。这些突变是使用 4 个 SU 时的 T 2 C 转换，使用 success 时是 G 2 个 A 转换。G.Park lip 的定义特征是通过对位于由回收的 RNA 制备的 CD NA 文库中的特征突变进行评分来推导出交联的位置。

这允许从来自特异性结合 RNA 的信号，以及来自丰度细胞 RNA 的共分离片段的序列的噪音中分离出来。因此，我们今天向您展示了如何分离 RNA 片段，特别是 RNA 结合蛋白识别的片段。执行此过程时。

不含 RNA 很重要。所以就是这样。感谢您的观看，祝您实验好运。