免疫荧光法检测原代组织中的两种胸腺嘧啶类似物（CldU 和 IdU）

您好，欢迎观看Calor D-U-I-D-U染色实验方案。今天我们的视频将从第三步——复水、通透与抗原修复开始。首先，将载玻片放入染色架中。

载玻片放入后，将其置于二甲苯溶液中浸泡5分钟。随后进行第二次二甲苯浸泡，同样持续5分钟。

继续通过将玻片移入乙醇溶液中进行复水，先使用100%溶液，最后降至50%。然后将玻片放入1×PBS中5分钟，以通透细胞膜。将玻片浸入0.2% Triton X溶液中5分钟。为进行微波组织抗原修复，将玻片放入玻璃染色缸中，并加入足量的0.01摩尔柠檬酸钠缓冲液，使液面高出玻片顶部5厘米。

为防止蒸发损失，将载玻片放入微波炉加热至溶液沸腾。此过程在全功率下大约需要 3 到 10 分钟。检查载玻片上的溶液是否已沸腾。

将微波功率降低至10%到80%之间，继续缓慢煮沸载玻片20分钟。煮沸后，将盛有载玻片的烧杯置于实验台面上，使其缓慢冷却约两个小时，直至达到室温。确认载玻片已降至室温。

将切片浸入1.5倍自然浓度的盐酸中，在室温下处理40分钟。从盐酸中取出切片，放入A液XPBS缓冲液中洗涤5分钟，随后进行第二次XPBS缓冲液洗涤。

用液体阻断蜡笔从一倍磷酸盐缓冲液中取出载玻片，圈出每一片组织区域，然后将载玻片放回磷酸盐缓冲液中。通过在密闭容器底部放置一张湿润的纸巾，制备一个湿化孵育室。

用1倍PBS稀释10%的封闭血清，配制封闭液。对于典型的约1厘米×1.5厘米的组织切片，需确保完全覆盖组织切片，每个切片使用50 µL封闭液即可。

通过将小鼠抗BRDU抗血清用5%驴血清稀释，配制一抗溶液，稀释比例为1:250。用移液器将一抗溶液滴加至每张切片上。

将载玻片放入4°C的冰箱中。若需过夜孵育，请准备高严谨性洗涤液。TBST效果良好。

将载玻片背对背放置。将载玻片放入约 35 至 40 毫升 TBST 溶液中。将试管置于 37 摄氏度的摇床式细菌培养箱中。

在 225 RPM 条件下振荡 20 分钟。现在将载玻片放入载片架中，并将载玻片置于一份 XPBS 中，进行 5 分钟的 PBS 洗涤。

随后用 XPBS 再次洗涤五分钟。通过将大鼠抗 BRDU 抗体用 5% 驴血清稀释，配制一抗 CLDU 溶液。以 1:250 的浓度加入，将切片点在纸巾上，然后用蜡笔进行划圈标记。

使用移液器将每张组织切片覆盖上一抗 CLDU 溶液。每张切片使用约 50 µL 溶液，以确保每张组织切片完全被覆盖。将载玻片置于 4 °C 冰箱中过夜孵育。

将载玻片放入载片盒中，然后置于第一缸1×PBS中洗涤5分钟。将载玻片转入第二缸1×PBS中，继续洗涤5分钟。用5%驴血清稀释CY2驴抗RAD和PS5驴抗Muse二抗，用于后续孵育；DPI也将用于细胞核染色。用二抗溶液完全覆盖组织切片。

50 微升溶液应足以完全覆盖您的组织。将再水化室置于室温避光处孵育一小时。将载玻片放入支架中，然后将其置于一份 XPBS 洗涤液中洗涤五分钟。

将切片放入第二个盛有1×PBS的容器中，洗涤5分钟。用纸巾轻轻吸去多余的PBS溶液。然后取抗褪色金标封片剂，每张组织切片上滴加一小滴。

取一片盖玻片，轻轻放置在切片上。用纸巾作为压片工具，挤出切片与盖玻片之间可能残留的多余气泡。最后，使用移液器枪头进一步排除可能残留的气泡。使用配备高能量光源和多个荧光通道的荧光显微镜观察目标组织，并对结果进行定量分析。

首先计数Dabi阳性细胞的数量。使用SI双通道图像计数CLDU阳性细胞的数量。使用SCI五通道图像计数IDU阳性细胞的数量。

最后，通过在SCI二通道和SCI五通道图像文件之间切换，计数双阳性标记的细胞。