微组织使用胶原蛋白的模块的制备凝胶含有细胞
2010年12月13日
使用圆柱胶原凝胶，称为模块，其中包含嵌入细胞表面的微组织的创建是涂有内皮细胞。
该程序的总体目标是生产可用于组织工程实验的模块化微组织。这是通过首先使用注射器将胶原蛋白溶液拉入聚乙烯管中，然后将胶原蛋白胶凝来实现的。第二步是将聚乙烯管切成两毫米长，以形成微组织模块。
该程序的第三步是将模块与管道分离，最后，模块涂有内皮细胞。最终，所得微组织可用于体外细胞测定，以研究细胞通过微流体室的相互作用。此外，可以植入微组织以产生用于研究体内微组织相互作用和重塑的组织。
大家好，我是来自多伦多大学 Sepan 实验室的 Brendan Long。创建大型 3D 组织替代品的一个主要障碍是植入后缺乏快速血管形成。在本视频中，我们将向您展示如何创建涂有内皮细胞的模块化组织，以帮助克服这一限制。
演示该程序的将被视为 Chamberlain，他是 Septin 实验室的术后研究员。要中和的胶原蛋白的量取决于聚乙烯管的长度。在本演示中，我们将使用内径为 0.76 毫米、外径为 1.22 毫米的 2 米聚乙烯管。
准备管路时，将 20 G 一根针穿入管路的一端，然后将管路放入转化器自愈袋中进行气体灭菌。由于一毫升胶原蛋白填充了大约两米长的聚乙烯管，我们将中和一毫升胶原蛋白。将胶原蛋白放入 15 毫升锥形管中，并将管子放在冰上。
向试管中加入每毫升胶原蛋白 128 微升 10 x α，MEM 并通过反复移液溶液进行混合。注意尽量减少产生气泡，当 α MEM 混合到酸化胶原蛋白中时，溶液应变为黄色。接下来，通过添加 0.8 摩尔碳酸氢钠来中和胶原蛋白 为了对 pH 值进行一般估计，加入碳酸氢钠，直到黄色胶原蛋白溶液变成浅粉红色。
通常需要每毫升胶原蛋白 30 到 60 微升才能达到 7.4 的 pH 值。为防止中和的胶原蛋白胶凝，请将其保存在冰上，直到准备好使用。要开始将胶原蛋白凝胶化的程序，请将装有灭菌聚乙烯管的袋子带到生物安全柜中，切掉袋子的密封端，同时将管子放在袋子中。
使用消毒过的镊子将 3 毫升注射器连接到之前插入管子一端的 20 号针头上。将管子的另一端插入中和的胶原蛋白中，直到尖端位于锥形管的底部，锥形管保持在冰上。下一步你必须慢慢做，否则，你会把气泡引入胶原蛋白。
慢慢缩回注射器的柱塞，将胶原蛋白拉入聚乙烯管中。当胶原蛋白通过管道拉出后，将 20 号针头拉出，然后将管道的两端放回袋子中。用胶带封上袋子后，在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。
将使用预组装的切割装置来切割管材。要开始此过程，请将管子放在切割装置前面的无菌托盘中，然后将管子装入切割装置出口处的切割装置中，设置一个 50 毫升的锥形管，其中包含 25 毫升内皮细胞培养基。要收集切割的模块，请将切割装置设置为切割两毫米长的管材，然后切割管材。
将切割的模块在 50 毫升锥形管中于 37 摄氏度孵育 60 分钟。要从管道中取出胶原蛋白模块，请以中等速度涡旋包含模块的 50 升锥形管。10 秒钟，让模块沉降到试管底部，大约需要 5 分钟。
在管底部会形成松散的模块颗粒，而管子会在介质顶部形成一层。模块沉淀后，使用宽口 10 毫升血清移液器将它们转移到 15 毫升锥形管中。涡旋，将 15 mL 锥形管浸透，然后让模块再稳定两次。
来自第二个和第三个涡旋的沉降模块也被转移到 15 mL 试管中。从管中取出所有模块并混合后，将管中的培养基体积增加到 5 mL。模块现在已准备好用内皮细胞包被，接下来将显示准备用于包被模块的内皮细胞。
首先，从细胞中取出培养基并用 PBS 洗涤。去除 PBS 后，加入 3 毫升胰蛋白酶 EDTA，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。接下来，复苏，将细胞悬浮在 7 毫升培养基中，并转移到 15 毫升试管中。
使用血细胞计数器对细胞进行计数，锥形管底部每毫升填充模块需要 5 乘以 10 到 6 个内皮细胞。以 300 G 的浓度沉淀细胞 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 5 mL 内皮细胞培养基中。
现在将 5 毫升含有内皮细胞的培养基添加到模块中。模块与内皮细胞静态和动态孵育以进行静态孵育，通过倒置将模块与内皮细胞混合，然后将试管直立在 37 摄氏度下放置 15 分钟。15 分钟后，再次倒置试管并在 37 摄氏度下再孵育 15 分钟。
要使模块与内皮细胞动态孵育，请在 37 摄氏度下轻轻摇动 15 毫升试管 60 分钟。与内皮细胞孵育完成后，将模块转移到未经组织培养处理的板中，并在第二天在 37 摄氏度下孵育过夜，将模块放入带有新鲜培养基的新非组织培养处理的板中，以去除未附着的内皮细胞。在 37 摄氏度下孵育涂有内皮细胞的模块，直到细胞覆盖 100% 的模块表面。
这通常需要大约 7 天。当模块第一次从管中取出时，它们看起来会呈圆柱形。如果它们被内皮细胞覆盖，它们的体积可以收缩高达 50% 并形成椭圆形，并且在通过光学显微镜观察时会变得更致密和更不透明。
在这些图像中，模块的直径和长度分别用 d 和 l 表示。下一张图显示了在制造时均匀分布在模块内的嵌入式 Hep G 两个电池。活细胞的绿色表明，细胞保留了高活力。
当内皮细胞汇合时，死细胞会呈红色。在模块的表面，形成了紧密的连接，这可以通过免疫荧光看到。VE 钙粘蛋白传质分析的染色表明，模块能够支持高细胞密度，而不会因氧转运不足而形成坏死核心，这在较大的组织中通常是有问题的。
在这个例子中，典型小模块的 massen Tri chro 染色表明，模块在制造后 7 天保留了均匀且高分布的活细胞。相比之下，在大型模块的核心内形成了大量死细胞，只留下了一层薄薄的活细胞边缘。模块也由胶原蛋白和 ine 聚合物的混合物或含有药物洗脱的微球制成。
在这里，当 h hm EC one 细胞位于 palin 胶原蛋白模块上时，模块保持其圆柱形，并且与仅胶原蛋白模块相比，细胞附着特性有限。此处显示了包含基于 PLGA 的可生物降解微球的胶原蛋白模块的光学显微镜图像。几种体外检测已被证明与模块兼容。
例如，在血管生成测定中，与脂肪来源的干细胞孵育 5 天后，可以很容易地检测和定量与内皮细胞一起放置的模块上的毛细血管状形成。在另一个示例中，模块上活死细胞检测的共聚焦显微镜图像显示活细胞染成绿色，死细胞染成红色。最后，模块也被用于微流控室并植入小鼠和大鼠体内，以研究不同细胞类型之间的相互作用以及微组织如何被宿主反应重塑。
按照该程序，模块可以在培养皿或其他容器（如生物反应器或微流体装置）中培养。这种方法也可以通过使用各种细胞类型的组合或使用不同直径的管道来产生不同的组织。感谢观看。
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概述
本文描述了一种使用嵌入细胞的圆柱形胶原凝胶创建模块化微组织的程序。这些微组织可用于各种组织工程实验。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 细胞生物学
- 微流体技术
背景
- 微组织对于研究细胞相互作用至关重要。
- 胶原凝胶为细胞生长提供支持性基质。
- 内皮细胞在组织发育中起着至关重要的作用。
- 探索体外和体内应用。
研究目的
- 为组织工程生产模块化微组织。
- 在受控环境中研究细胞相互作用。
- 促进体内研究的组织发育。
使用的方法
- 将胶原溶液拉入聚乙烯管中。
- 胶原凝胶形成固体模块。
- 将模块切割成两毫米长的段。
- 在模块表面涂覆内皮细胞。
主要结果
- 成功地从胶原凝胶中创建微组织模块。
- 模块可用于体外细胞检测。
- 微组织可用于体内研究植入。
- 促进细胞相互作用和组织重塑的研究。
结论
- 该程序允许创建功能性微组织。
- 这些微组织对体外和体内研究都很有价值。
- 在再生医学和组织工程中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Modular micro-tissue fabrication addresses the vascularization bottleneck in 3D tissue engineering by enabling scalable, perfusable constructs with embedded or coated endothelial cells. This approach supports predictive modeling of cell-cell interactions and tissue remodeling in both in vitro and in vivo settings, reducing late-stage attrition in regenerative medicine programs. The method provides a tunable platform for de-risking therapeutic hypotheses through standardized, reproducible tissue modules.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled co-culture of multiple cell types within diffusion-limited modules.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining high cell viability and uniform distribution without necrotic cores.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by modeling vascularized tissue microenvironments relevant to drug response.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized micro-tissue substrates compatible with angiogenesis, live/dead, and microfluidic assays for quantitative readouts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through uniform module dimensions and consistent endothelial coating efficiency.
- Scalability: Allows parallel preparation of hundreds of modules for high-content screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems for studying host-tissue interaction and remodeling post-implantation in rodent models.
- Operational Value: Bridges in vitro findings to in vivo studies using identical module batches, enhancing translational continuity.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of vascular integration and tissue stability prior to costly preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The module fabrication process fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, supporting assay-ready tissue generation and preclinical continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise spatial arrangement of cell types to study paracrine signaling and dependency.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissues with quantifiable outputs such as capillary formation and viability metrics.
- Analytics: Generates measurable dependent variables including module dimensions, cell density, oxygenation status, and endothelial coverage for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro angiogenesis and microfluidic assay results to in vivo implantation outcomes, supporting risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform adaptable to various cell types, gel materials, and tubing diameters across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tissue-level drug responses through vascularized models.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via defined module fabrication and coating protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of vascularization failures and necrotic core formation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of leads based on tissue-level performance in perfusable, modular systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, sterile technique, and microfluidic handling.
- Depends on access to biological safety cabinets, precision cutting devices, and incubators for gelation and cell culture.
- Necessitates standardization of collagen neutralization, tubing preparation, and endothelial cell seeding density across teams.
- Involves adaptation considerations when substituting collagen with crosslinkable gels or altering tube diameters for different module sizes.
- Limited by diffusion constraints in uncoated modules and the time required to achieve full endothelial coverage (up to seven days).
