Name: 微组织使用胶原蛋白的模块的制备凝胶含有细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 了解使用胶原蛋白凝胶制备模块化微组织的方法，通过聚乙烯管成型并包被内皮细胞。该技术适用于体外细胞相互作用研究及体内组织工程应用。

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资金由美国国立卫生研究院（EB 001013）、加拿大自然科学与工程研究理事会及加拿大健康研究院提供。我们感谢 A. P. McGuigan 博士在模块开发过程中提供的专业知识与帮助。

1）导管的制备
<ol>
<li>	剪取 2 至 3 米长的聚乙烯管（内径 0.76 mm × 外径 1.22 mm）。</li>
<li>	将一根 20 G1 针头穿入管的一端。</li>
<li>	将管盘绕成线圈状，放入自封式灭菌袋（7 1/2" × 13"）。管的两端应置于袋的未封口端，并用气体灭菌胶带固定。</li>
<li>	密封袋子并进行气体灭菌。</li>
</ol>
2) 胶原蛋白的中和
注意：1 ml 胶原蛋白可填充约 2 m 的聚乙烯管。
<ol>
<li> 将所需量的胶原蛋白放入15 ml锥形管中，置于冰上保存，以用于制备所需长度的管状结构。</li>
<li> 每毫升胶原蛋白中加入128 μL的10倍浓度α-MEM，并通过反复移液混合溶液。注意：（1）当α-MEM与酸化胶原蛋白混合后，溶液应变为黄色；（2）混合时应尽量减少气泡产生。</li>
<li> 加入0.8 M碳酸氢钠中和胶原蛋白，直至胶原蛋白pH达到7.4。作为pH值的粗略判断标准，当黄色胶原蛋白溶液变为浅粉色时即为中和完成。注意：通常每毫升胶原蛋白需要30至60 μL碳酸氢钠。</li>
<li> 中和后的胶原蛋白在使用前应始终置于冰上，因为若不在4°C条件下保存，中和后的胶原蛋白会发生凝胶化。</li>
</ol>
3）细胞包埋（可选）
注意：根据细胞类型的不同，可将细胞以每毫升100万至2000万个细胞的浓度包埋。请使用适合您要包埋细胞类型的培养基。
<ol>
<li> 吸去细胞培养液，加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。</li>
<li> 吸去 PBS，加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
<li> 将细胞在 37°C 下用胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育 5 分钟。</li>
<li> 用 7 mL 培养液重悬细胞。</li>
<li> 进行细胞计数。</li>
<li> 将所需数量的细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中用于包埋。</li>
<li> 在 300 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
<li> 吸去细胞沉淀上方的培养液。</li>
<li> 用中和的胶原溶液重悬细胞，并置于冰上保存。</li>
</ol>
4）胶原蛋白凝胶化
<ol>
<li> 在生物安全柜中，剪开装有聚乙烯管的袋子的密封端。</li>
<li> 使用无菌镊子将3 ml注射器连接到聚乙烯管一端的20G针头上。保持聚乙烯管置于袋内。</li>
<li> 使用无菌镊子将聚乙烯管的另一端插入中和后的胶原液中，直至管尖到达锥形管底部。保持锥形管置于冰上。</li>
<li> 缓慢回抽注射器活塞，将胶原液吸入聚乙烯管中。 
注意：若胶原液被过快吸入管中，则会在胶原内形成气泡。</li>
<li> 将胶原液吸入管后，拔出20G针头，并将两端重新放回袋中。用胶带密封袋子。</li>
<li> 将袋子在37°C孵育60分钟。若胶原中含有细胞，则每15分钟翻转袋子一次，以防止细胞沉降到模块的一侧。</li>
</ol>
5）切割含有凝胶化胶原的管路
<ol>
<li> 对切割装置的刀头、刀片以及用于盛放管路的托盘进行高压灭菌。</li>
<li> 组装切割装置。</li>
<li> 将管路放置于切割装置前方的无菌托盘中，并将管路装入切割装置内。</li>
<li> 在切割装置出口处放置一个50 mL锥形管，内含25 mL培养基，用于收集切割后的模块。 
注意：即使为仅含胶原的模块，也应使用含有胎牛血清（FBS）的培养基，因为若培养基中不含FBS，模块无法从管路中分离。若模块中含有细胞，则使用所包埋细胞所需的培养基；若模块中无包埋细胞，则使用内皮细胞的培养基。</li>
<li> 将切割装置设置为切割2 mm长度的管路，并进行切割。</li>
<li> 将切割后的模块置于50 mL锥形管中，在37°C下孵育60分钟。</li>
</ol>
6) 从管路中移除胶原模块
<ol>
<li> 将含有管道中模块的 50 mL 离心管涡旋震荡 10 秒。 
	注意：分离高细胞密度嵌入的模块时应轻柔操作，以避免破损。</li>
<li> 让模块沉降至管底，约需 5 分钟。</li>
<li> 使用宽口 10 mL 血清移液管将已沉降的模块转移至 15 mL 离心管中。</li>
<li> 重复步骤 6.1 至 6.3 两次。</li>
<li> 进入步骤 7 以用内皮细胞包被模块，或将模块转移至未经组织培养处理的培养板中。</li>
</ol>
7) 用内皮细胞包被模块
<ol>
<li> 将模块放入15 mL圆底离心管底部，加入5 mL培养基以浸没细胞。</li>
<li> 吸去内皮细胞的培养基，并用5 mL PBS洗涤。</li>
<li> 吸去PBS，加入3 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
<li> 在37°C条件下，将细胞在胰蛋白酶-EDTA中孵育5分钟。</li>
<li> 用7 mL培养基重悬细胞。</li>
<li> 进行细胞计数。每毫升紧密排列的模块底部需含有5×106个内皮细胞。</li>
<li> 在300 × g离心5分钟以收集细胞，并用5 mL内皮细胞培养基重悬。</li>
<li> 将含有内皮细胞的5 mL培养基加入模块中。 
注意：此操作可形成两种培养基各占50%的混合体系，我们发现该比例有利于两种细胞类型的存活与功能维持。若拟使用专门配制的共培养培养基，应先测试其是否可有效维持两种细胞的表型，再投入使用。</li>
<li> 将模块与内皮细胞在静态和动态条件下共同孵育。</li>
<li> 对于静态孵育，通过轻柔翻转混匀模块与内皮细胞，然后将离心管直立置于37°C环境中孵育15分钟，重复一次。</li>
<li> 动态接种内皮细胞时，在37°C下轻轻摇动离心管60分钟。</li>
<li> 重复进行两次静态孵育。</li>
<li> 将模块转移至未经组织培养处理的培养板中，在37°C下孵育过夜。</li>
<li> 次日，将模块转移至新的未经组织培养处理的培养板中，加入新鲜培养基（若使用共培养体系，则采用50:50混合培养基），以去除未贴附的内皮细胞。</li>
<li> 继续孵育已覆盖内皮细胞的模块，直至细胞完全覆盖模块表面（覆盖率100%）。此过程通常需要约7天。</li>
</ol>
8) 代表性结果：
模块刚从试管中取出时呈圆柱形。如果模块内含有包埋的细胞和/或表面包被有内皮细胞，则其体积可收缩达50%，并形成椭圆形（图1）。在光学显微镜下观察，模块也会变得更加致密和不透明（图1）。当模块表面的内皮细胞达到融合状态时，会形成紧密连接，可通过VE-钙黏蛋白（VE-Cadherin）的免疫荧光染色观察到（图2）。传质分析表明，这些模块能够在不形成因氧气传输不足导致的坏死核心的情况下，支持高密度细胞生长（8×107 个细胞/cm3），而这一问题在较大的组织中常常存在（例如，大直径模块，D = 1.4 mm）（图3）。
<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="显微镜：生物膜模块生长比较，第0天 vs 第3天，尺寸参数，荧光标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 模块的制备与收缩。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC-C）接种后的三天内，模块发生收缩，其直径和长度显著减小（p &lt; 0.001）（A）。在制备时，嵌入的HepG2细胞在模块内均匀分布，并保持高存活率（B）。[活细胞 绿色；死细胞 红色] [改编自Corstorphine 2010]

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="荧光显微镜图像；细胞结构可视化；绿色荧光蛋白标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 模块表面接种RAEC并培养10天后，内皮细胞紧密连接处的VE-钙黏蛋白免疫荧光染色。比例尺 = 50 μm。

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="细胞培养生长比较，显微镜图像显示小模块和大模块随时间的变化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： 典型模块（初始直径 0.76 mm）和大模块（初始直径 1.4 mm）的 Masson 三色染色结果展示了氧扩散限制的影响。构建七天后，大模块的核心区域（右下面板）已形成大量死细胞，仅剩一层薄薄的存活细胞边缘（约 200μm 厚）。相反，小模块则保持了均匀且高密度的活细胞分布。[模块内包埋 HepG2 细胞，并包覆内皮细胞。] [引自 Corstorphine 2010]

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="组织显微图像；A：荧光，B：暗场；细胞结构分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：（A）在泊洛沙胺-胶原模块上接种的HMEC-1细胞。接种后第1天，泊洛沙胺-胶原模块仍保持其圆柱形结构，与仅含胶原的模块相比，细胞附着性能有限。比例尺 = 200 μm。（B）含有基于PLGA的可生物降解微球的胶原模块的光学显微镜图像。比例尺 = 500 μm。

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="生物膜形成分析中的微生物生长形态与荧光显微镜观察" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5： 示例 体外 检测。(A) 血管生成检测：在与脂肪源性干细胞共培养5天后，可轻松检测并量化内皮细胞接种模块上形成的毛细血管样结构。(B) 模块上活/死细胞染色的共聚焦显微镜图像，其中活细胞染色呈绿色，死细胞染色呈红色。

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="组织学显微镜图像；组织样本分析；细胞结构观察；病理学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6： 含有嵌入式间充质干细胞并表面覆盖一层内皮细胞的胶原模块。该模块在微流控腔室中暴露于剪切应力（约0.64 dyn/cm2）下培养7天，开始在接触点处出现融合现象。内皮细胞经vWF染色呈棕色，间充质干细胞的细胞核呈蓝色（H&amp;E染色）。比例尺 = 100μm。

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="显示异常增生的组织显微图像，提示可能存在癌变。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7： 在小鼠皮肤下植入数百个含有脂肪源性干细胞（ASC）并由人微血管内皮细胞（HMEC）包被的胶原模块，以研究ASC与HMEC之间的相互作用 体内 用于脂肪再生应用。

<ol><li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li>
<li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li>
<li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li>
<li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+tissue+engineering%3A+fabrication+of+a+gelatin-based+construct%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li>
<li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen%2Fpoloxamine+hydrogels%3A+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们利用嵌入不同类型细胞的模块制备了多种不同的微组织1-11我们已成功包埋了原代心肌细胞、胰岛细胞、脂肪干细胞、间充质基质细胞，以及包括HepG2、NIH 3T3和克隆9肝细胞在内的多种细胞系。我们还使用多种内皮细胞对模块进行包被，包括大鼠主动脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人微血管内皮细胞。此外，已制备出由胶原与泊洛沙胺聚合物混合物构成，或含有药物缓释微球的模块（图4）。多种 体外 已证明这些检测方法可与多种模块兼容，包括免疫荧光、蛋白质印迹、血管生成、Alamar Blue 增殖检测以及活/死细胞染色（图5）。这些模块还已被用于微流控芯片（图6），并植入小鼠和大鼠体内（图7），以研究不同类型细胞之间的相互作用，以及宿主反应对微组织的重塑过程。这些模块具有广泛的应用前景，可用于研究三维组织培养对细胞的影响、不同细胞在三维构型中的相互作用、微组织在微流控芯片中的重塑过程 体内 宿主反应对微组织的重塑。

<table><tbody><tr><td>内径管PE60</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>可使用不同直径的导管来改变模块的直径</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>酸性化胶原蛋白，3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>20G针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>针头直径需与导管直径相近</td></tr><tr><td>3 mL注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Convertors 自封袋 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>10 ml宽口移液管</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>10 ml移液管</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml移液管</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

利用含细胞的胶原凝胶模块制备微组织

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

本方案描述了一种称为模块的微组织的制备方法。模块化方法可生成均一、可扩展且具有血管化的组织。模块可由胶原蛋白以及其他可凝胶化或可交联材料制成。制备完成时模块长约2 mm，直径约0.7 mm，但在包埋细胞后或经内皮细胞包被后会收缩。单个模块体积足够小，使包埋细胞处于氧气及其他营养物质的扩散极限范围内；但多个模块可堆叠组装形成更大的可灌注组织。由于可在模块中包埋或在其表面包被不同类型的细胞，再将其组装成复杂组织，因此该组织具有模块化结构。模块制备主要包括三个步骤：（1）中和胶原蛋白并将其与细胞混合；（2）在管中使胶原蛋白凝胶化并切割成模块；（3）用内皮细胞包被模块。

利用含有包埋细胞且表面涂覆内皮细胞的圆柱形胶原凝胶（称为模块）来构建微组织。

本方案描述了一种称为“模块”的微组织的制备方法。模块化方法可生成均一、可扩展且具有血管化的……

本实验的总体目标是制备可用于组织工程实验的模块化微组织。首先，使用注射器将胶原蛋白溶液吸入聚乙烯导管中，随后使胶原蛋白凝胶化，从而完成第一步。第二步是将聚乙烯导管切割成两毫米长的片段，以形成微组织模块。该操作流程的第三步是将模块与管路分离，最后用内皮细胞对模块进行包被。最终得到的微组织可用于体外细胞实验，通过微流控室研究细胞间的相互作用。此外，还可将这些微组织植入体内，以生成可用于研究微组织在活体中相互作用及重塑过程的组织。大家好，我是来自多伦多大学 Sepan 实验室的 Brendan Long。目前在构建大型三维组织替代物时面临的主要障碍之一，是在植入后缺乏快速的血管化。在本视频中，我们将向您展示如何构建由内皮细胞包被的模块化组织，以帮助克服这一限制。本次操作演示将由来自Septin实验室的术后研究员Deem Chamberlain完成。需要中和的胶原蛋白量取决于聚乙烯管的长度。在本演示中，我们将使用一根长度为2米、内径为0.76毫米、外径为1.22毫米的聚乙烯管。为准备导管，将一根20 G的针头插入导管一端，然后将导管放入自封式气体灭菌袋中进行灭菌。由于1毫升胶原蛋白溶液可填充约2米长的聚乙烯导管，我们将中和1毫升胶原蛋白溶液。将胶原蛋白溶液加入15毫升锥形管中，并将管子置于冰上保存。向管中加入128微升10倍浓度的α-MEM（每毫升胶原蛋白），并通过反复吹打混匀溶液。注意尽量减少气泡产生，随着α-MEM与酸化胶原混合，溶液应变为黄色。接下来，通过加入0.8摩尔的碳酸氢钠中和胶原蛋白。为大致估计pH值，加入碳酸氢钠直至黄色的胶原溶液变为浅粉色。通常每毫升胶原蛋白需要 30 至 60 微升以达到 pH 7.4。为防止中和后的胶原蛋白发生凝胶化，请将其置于冰上直至使用。开始胶原蛋白凝胶化操作时，将装有已灭菌聚乙烯管的袋子移至生物安全柜中，在保持管子仍在袋内的同时剪开袋子的封口端。使用灭菌镊子将一个3 mL注射器连接到先前插入管路一端的20号针头上。将管路的另一端插入中和后的胶原蛋白溶液中，直至管尖到达锥形管底部，锥形管需保持在冰上。下一步操作必须缓慢进行，否则会将气泡引入胶原蛋白溶液中。缓慢回拉注射器活塞，将胶原蛋白吸入聚乙烯管中。当胶原蛋白完全进入管内后，拔出20号针头，并将管子两端重新放回袋中。用胶带密封袋子后，在37摄氏度下孵育60分钟。将使用预组装的切割装置来切割导管。开始此操作时，将导管放置在切割装置前方的无菌托盘中，并从切割装置的出口处将导管装入切割装置内，同时准备一个含有25毫升内皮细胞培养基的50毫升锥形管。为收集切割后的模块，将切割装置设置为切割长度为2毫米的导管段，然后进行导管切割。将切割后的模块置于50毫升锥形管中，在37摄氏度下孵育60分钟。为从管壁上分离胶原模块，将含有模块的50毫升锥形管在中等速度下涡旋震荡10秒。随后静置约五分钟，使模块沉降至管底。在管底会形成松散的模块沉淀，而导管则会浮在培养基上方。待模块沉降后，使用宽口的10毫升血清移液管将其转移至15毫升锥形管中。涡旋混匀该15毫升锥形管，然后让模块再沉降两次。将第二和第三个涡旋中沉淀的模块也转移至15毫升离心管中。待所有模块从管路中取出并汇集后，将管内培养基体积补至5毫升。此时模块已准备好用于内皮细胞包被，接下来将展示如何制备用于包被模块的内皮细胞。首先，移除细胞中的培养基，并用 PBS 洗涤。移除 PBS 后，加入 3 mL 胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度孵育 5 分钟。接着，重悬细胞于 7 mL 培养基中，转移至 15 mL 离心管。使用血细胞计数板对细胞进行计数，每毫升锥形管底部的紧密细胞团需含有5 × 10⁶个内皮细胞。在300 × g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于5 mL内皮细胞培养基中。现在向模块中加入5毫升含有内皮细胞的培养基。将模块与内皮细胞共同孵育，孵育方式包括静态和动态两种。对于静态孵育，通过倒置混匀含有内皮细胞的模块，然后将离心管直立置于37摄氏度环境中孵育15分钟。15分钟后，再次倒置离心管，并在37摄氏度下继续孵育15分钟。为实现内皮细胞与模块的动态共孵育，将15毫升离心管在37摄氏度下轻轻摇动孵育60分钟。内皮细胞孵育完成后，将模块转移至未经组织培养处理的培养板中，在次日37摄氏度下继续孵育过夜。随后，将模块转移至新的未经组织培养处理的培养板中，并加入新鲜培养基，以去除未贴附的内皮细胞。将覆盖有内皮细胞的模块在37摄氏度下继续孵育，直至细胞完全覆盖模块表面的100%。这通常需要大约七天。模块刚从试管中取出时呈圆柱形。如果它们被内皮细胞包被，则体积可收缩达50%，并变为椭圆形，同时在光学显微镜下观察时变得更致密、更不透明。在这些图像中，模块的直径和长度分别用 d 和 l 表示。下一张图像显示了在制备时均匀分布在模块内的嵌入式 Hep G2 细胞。活细胞呈现绿色，表明细胞保持了较高的存活率。当内皮细胞融合时，死细胞会呈现红色。在模块表面形成了紧密连接，可通过免疫荧光观察到。VE-钙黏蛋白的染色及传质分析表明，这些模块能够支持高细胞密度，而不会因氧气传输不足而形成坏死核心，而这一问题在较大的组织中常常出现。本示例中，对典型小型模块进行的活死细胞三色染色显示，模块在制备后第七天仍保持均匀且高密度的活细胞分布。相比之下，大型模块核心区域形成了大量死细胞，仅剩外周薄层为活细胞。此外，还制备了含有胶原蛋白与丙烯酸聚合物混合物的模块，或包含载药微球的模块。当h hm EC一个细胞接种于含有palin的胶原模块上时，这些模块保持其圆柱形形态，与仅含胶原的模块相比，细胞附着性能有限。此处显示的是含有基于PLGA的可生物降解微球的胶原模块的光学显微镜图像。已有多种体外实验被证实可与这些模块兼容。例如，在血管生成实验中，将内皮细胞接种于模块上，并与脂肪来源的干细胞共培养五天后，可轻松检测并定量形成的毛细血管样结构。在另一个例子中，模块上活/死细胞染色实验的共聚焦显微镜图像显示，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。最后，这些模块还被用于微流控装置中，并植入小鼠和大鼠体内，以研究不同类型细胞之间的相互作用，以及宿主反应如何重塑微组织。按照该操作步骤，可将模块在培养皿或其他容器（如生物反应器或微流控装置）中进行培养。通过使用不同类型的细胞组合或不同直径的管路，该方法也可适用于构建不同的组织。感谢观看。

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生物工程

微组织使用胶原蛋白的模块的制备凝胶含有细胞

在此，我们演示了包含骨骼肌成肌细胞的胶原基组织工程构建物的制备方法。这些三维工程化构建物可用于组织的替代或修复 体内为实现这一目的，我们设计了房室电传导通路，用于完全性心脏传导阻滞的修复[1].

肌源性工程组织构建物的制备

本文描述了一种制备由I型胶原和原代人成纤维细胞组成的三维基质的方法。这种类器官凝胶能够模拟组织间质的基本特征，适用于多种显微镜观察，因此是评估细胞侵袭性迁移的有用基质。...

三维环境中的细胞行为评估：可调节的I型胶原类器官培养检测平台

该模型系统始于含有肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶，可用于以非破坏性方式实时研究内源性胶原蛋白的（再）组织过程。该模型系统具有高度可调性，可结合不同细胞来源和培养基添加剂使用，并能轻松适应特定研究需求。...

利用肌成纤维细胞构建纤维蛋白基组织工程支架并施加约束与应变以诱导细胞和胶原的重排

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

组织工程通常包括 体外 扩增以创建用于组织再生的自体移植物。本研究介绍了一种组织扩增、再生与重建的方法 体内...

压缩胶原中的组织匀浆：一种含细胞的生物移植物用于单阶段重建修复

在微流控装置中构建功能性微组织需要通过将传统细胞培养技术适应微器件的有限空间尺寸，以稳定细胞表型。对胶原蛋白进行修饰可实现超薄胶原组装体的逐层沉积，从而在微流控组织模型中稳定原代细胞（如肝细胞）。...

逐层胶原沉积微流控装置用于微组织稳定化

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。...

在细胞外基质中构建三维上皮组织

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外...

用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（&lt;250 µm...

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

以下方案介绍了一种基于剪切的挤出方法，用于制备具有纳米级图案化纤维的胶原蛋白水凝胶，该方法可广泛应用于多种组织工程领域。...

用于组织工程的纳米纤维图案化胶原蛋白的制备

了解使用胶原蛋白凝胶制备模块化微组织的方法，通过聚乙烯管成型并包被内皮细胞。该技术适用于体外细胞相互作用研究及体内组织工程应用。

利用含细胞的胶原凝胶模块制备微组织

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