利用含细胞的胶原凝胶模块制备微组织

本实验的总体目标是制备可用于组织工程实验的模块化微组织。首先，使用注射器将胶原蛋白溶液吸入聚乙烯导管中，随后使胶原蛋白凝胶化，从而完成第一步。第二步是将聚乙烯导管切割成两毫米长的片段，以形成微组织模块。

该操作流程的第三步是将模块与管路分离，最后用内皮细胞对模块进行包被。最终得到的微组织可用于体外细胞实验，通过微流控室研究细胞间的相互作用。此外，还可将这些微组织植入体内，以生成可用于研究微组织在活体中相互作用及重塑过程的组织。

大家好，我是来自多伦多大学 Sepan 实验室的 Brendan Long。目前在构建大型三维组织替代物时面临的主要障碍之一，是在植入后缺乏快速的血管化。在本视频中，我们将向您展示如何构建由内皮细胞包被的模块化组织，以帮助克服这一限制。

本次操作演示将由来自Septin实验室的术后研究员Deem Chamberlain完成。需要中和的胶原蛋白量取决于聚乙烯管的长度。在本演示中，我们将使用一根长度为2米、内径为0.76毫米、外径为1.22毫米的聚乙烯管。

为准备导管，将一根20 G的针头插入导管一端，然后将导管放入自封式气体灭菌袋中进行灭菌。由于1毫升胶原蛋白溶液可填充约2米长的聚乙烯导管，我们将中和1毫升胶原蛋白溶液。将胶原蛋白溶液加入15毫升锥形管中，并将管子置于冰上保存。

向管中加入128微升10倍浓度的α-MEM（每毫升胶原蛋白），并通过反复吹打混匀溶液。注意尽量减少气泡产生，随着α-MEM与酸化胶原混合，溶液应变为黄色。接下来，通过加入0.8摩尔的碳酸氢钠中和胶原蛋白。为大致估计pH值，加入碳酸氢钠直至黄色的胶原溶液变为浅粉色。

通常每毫升胶原蛋白需要 30 至 60 微升以达到 pH 7.4。为防止中和后的胶原蛋白发生凝胶化，请将其置于冰上直至使用。开始胶原蛋白凝胶化操作时，将装有已灭菌聚乙烯管的袋子移至生物安全柜中，在保持管子仍在袋内的同时剪开袋子的封口端。

使用灭菌镊子将一个3 mL注射器连接到先前插入管路一端的20号针头上。将管路的另一端插入中和后的胶原蛋白溶液中，直至管尖到达锥形管底部，锥形管需保持在冰上。下一步操作必须缓慢进行，否则会将气泡引入胶原蛋白溶液中。

缓慢回拉注射器活塞，将胶原蛋白吸入聚乙烯管中。当胶原蛋白完全进入管内后，拔出20号针头，并将管子两端重新放回袋中。用胶带密封袋子后，在37摄氏度下孵育60分钟。

将使用预组装的切割装置来切割导管。开始此操作时，将导管放置在切割装置前方的无菌托盘中，并从切割装置的出口处将导管装入切割装置内，同时准备一个含有25毫升内皮细胞培养基的50毫升锥形管。为收集切割后的模块，将切割装置设置为切割长度为2毫米的导管段，然后进行导管切割。

将切割后的模块置于50毫升锥形管中，在37摄氏度下孵育60分钟。为从管壁上分离胶原模块，将含有模块的50毫升锥形管在中等速度下涡旋震荡10秒。随后静置约五分钟，使模块沉降至管底。

在管底会形成松散的模块沉淀，而导管则会浮在培养基上方。待模块沉降后，使用宽口的10毫升血清移液管将其转移至15毫升锥形管中。涡旋混匀该15毫升锥形管，然后让模块再沉降两次。

将第二和第三个涡旋中沉淀的模块也转移至15毫升离心管中。待所有模块从管路中取出并汇集后，将管内培养基体积补至5毫升。此时模块已准备好用于内皮细胞包被，接下来将展示如何制备用于包被模块的内皮细胞。

首先，移除细胞中的培养基，并用 PBS 洗涤。移除 PBS 后，加入 3 mL 胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度孵育 5 分钟。接着，重悬细胞于 7 mL 培养基中，转移至 15 mL 离心管。

使用血细胞计数板对细胞进行计数，每毫升锥形管底部的紧密细胞团需含有5 × 10⁶个内皮细胞。在300 × g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于5 mL内皮细胞培养基中。

现在向模块中加入5毫升含有内皮细胞的培养基。将模块与内皮细胞共同孵育，孵育方式包括静态和动态两种。对于静态孵育，通过倒置混匀含有内皮细胞的模块，然后将离心管直立置于37摄氏度环境中孵育15分钟。15分钟后，再次倒置离心管，并在37摄氏度下继续孵育15分钟。

为实现内皮细胞与模块的动态共孵育，将15毫升离心管在37摄氏度下轻轻摇动孵育60分钟。内皮细胞孵育完成后，将模块转移至未经组织培养处理的培养板中，在次日37摄氏度下继续孵育过夜。随后，将模块转移至新的未经组织培养处理的培养板中，并加入新鲜培养基，以去除未贴附的内皮细胞。将覆盖有内皮细胞的模块在37摄氏度下继续孵育，直至细胞完全覆盖模块表面的100%。

这通常需要大约七天。模块刚从试管中取出时呈圆柱形。如果它们被内皮细胞包被，则体积可收缩达50%，并变为椭圆形，同时在光学显微镜下观察时变得更致密、更不透明。

在这些图像中，模块的直径和长度分别用 d 和 l 表示。下一张图像显示了在制备时均匀分布在模块内的嵌入式 Hep G2 细胞。活细胞呈现绿色，表明细胞保持了较高的存活率。

当内皮细胞融合时，死细胞会呈现红色。在模块表面形成了紧密连接，可通过免疫荧光观察到。VE-钙黏蛋白的染色及传质分析表明，这些模块能够支持高细胞密度，而不会因氧气传输不足而形成坏死核心，而这一问题在较大的组织中常常出现。

本示例中，对典型小型模块进行的活死细胞三色染色显示，模块在制备后第七天仍保持均匀且高密度的活细胞分布。相比之下，大型模块核心区域形成了大量死细胞，仅剩外周薄层为活细胞。此外，还制备了含有胶原蛋白与丙烯酸聚合物混合物的模块，或包含载药微球的模块。

当h hm EC一个细胞接种于含有palin的胶原模块上时，这些模块保持其圆柱形形态，与仅含胶原的模块相比，细胞附着性能有限。此处显示的是含有基于PLGA的可生物降解微球的胶原模块的光学显微镜图像。已有多种体外实验被证实可与这些模块兼容。

例如，在血管生成实验中，将内皮细胞接种于模块上，并与脂肪来源的干细胞共培养五天后，可轻松检测并定量形成的毛细血管样结构。在另一个例子中，模块上活/死细胞染色实验的共聚焦显微镜图像显示，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。最后，这些模块还被用于微流控装置中，并植入小鼠和大鼠体内，以研究不同类型细胞之间的相互作用，以及宿主反应如何重塑微组织。

按照该操作步骤，可将模块在培养皿或其他容器（如生物反应器或微流控装置）中进行培养。通过使用不同类型的细胞组合或不同直径的管路，该方法也可适用于构建不同的组织。感谢观看。