Name: 微流控芯片控制，弹性微阀阵列 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: 学习使用PDMS弹性微阀阵列制造微流控芯片，实现亚纳升级精准流体操控与自动化混合。该技术可提升细胞生物学高通量实验效率，适用于药物筛选和化学趋化性研究。

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本工作得到了生物医学成像与生物工程国家研究所资助项目 #EB003307 以及美国国家科学基金会职业奖对 A.F. 的支持。

使用 CorelDraw 或 AutoCAD 软件设计微流控装置
基于PDMS微阀装置的原理：该装置由三层组成：包含不同尺寸微腔的流体层、包含用于通过微阀驱动流体通路所需微通道的“控制层”，以及位于中间并与控制层键合的薄PDMS膜。在静止状态下，由于PDMS具有柔韧性和疏水性，该膜可逆地紧贴其阀座，从而在无需能量输入的情况下使各微腔彼此隔离。通过施加负压（例如，使用实验室真空系统）可打开阀门，此时PDMS膜向下弯曲，并与分隔两个流体腔室的壁面分离，从而连通流体通路。通过将压力从真空切换至大气压，即可实现阀门关闭。
使用 CorelDraw 或 AutoCAD 软件设计流体层和控制层的图案。通过商业服务（CAD/Art 服务，美国俄勒冈州班顿）将包含这些设计的图案以高分辨率（8,000 至 20,000 dpi）打印在透明薄膜上（未展示掩模）。
使用标准 SU-8 光刻技术制备硅模板
<ol>
<li>采用标准的 SU-8 光刻方法在洁净室中制备微流控层和阀门控制层的 SU-8“母模”（SU-8 2050，MicroChem，Newton，MA）（本视频中未展示）。 </li>
<li>为便于脱模，在 PDMS 复型前，将 SU-8 母模置于干燥器罐（不加干燥颗粒）中，并暴露于氟硅烷蒸气（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷，TFOCS）进行硅烷化处理，该干燥器罐需连接真空源。由于 TFOCS 蒸气具有腐蚀性，干燥器腔体必须放置在化学通风橱内。 </li>
<li>在干燥器腔体内放入一小块吸水性纸巾，将一滴 TFOCS 加到纸巾上，然后抽真空。抽真空 1 分钟后关闭真空泵，关闭真空管路，静置 30 分钟以完成沉积。将母模保存在密闭容器中以备后续使用。</li>
</ol>
从模具复制成型PDMS
<ol>
<li>流体层和控制层通过PDMS在SU-8模具上的复制成型工艺制备。 </li>
<li>将PDMS预聚物与交联剂按10:1（重量比）充分混合，在真空干燥器中脱泡10–15分钟，直至气泡完全消除。 </li>
<li>将硅胶管剪成1–2 cm长的小段。根据具体应用选择合适尺寸的管材。本实验中采用内径为1.14 mm的硅胶管，以便后续与外径为1/16英寸的管材实现便捷连接。 </li>
<li>使用Duco®胶水将硅胶管粘接到控制层SU-8模具的进样区域。注意避免使用过多胶水，因为硅胶管的材质与PDMS成分相同，管材将嵌入PDMS微流控装置中，从而形成气密和液密的进出口。 </li>
<li>在本装置中，进样区域在流体层和控制层的掩模上均有设计，但硅胶管仅被模塑到其中一层（例如控制层）中。为了实现流体层的进样口，我们手动移除或刺穿覆盖在进样区域上方的局部薄膜。因此，在对齐和组装后，所有微通道（包括用于流体输送和控制阀门的通道）均可从装置顶部接入，使底面保持平整，便于在常规显微镜载物台上对装置进行成像。 </li>
<li>将脱泡后的PDMS小心地浇注到两个模具上，尤其注意控制层模具中硅胶管周围的区域。再次在真空干燥器中脱泡。脱泡完成后，放入65°C烘箱中固化&gt; 1小时。 </li>
<li>将已固化的PDMS覆盖模具从烘箱中取出。 </li>
<li>从模具上切割下单个装置（每个模具包含三个相同的装置），并小心剥离。 </li>
<li>使用针头或镊子清除进样区域的残留胶水。 </li>
<li>将控制层PDMS带入洁净室。</li>
</ol>
薄PDMS膜的制备
<ol>
<li>如装置原理所示，中间层由一层约 12 μm 厚的 PDMS 膜组成。 </li>
<li>将 PDMS 预聚物与固化剂按 10:1 重量比混合，并加入正己烷（正己烷与 PDMS 混合物的重量比为 3:1），通过涡旋混合均匀。 </li>
<li>转移至洁净室。（无尘环境对于确保 PDMS 膜无缺陷至关重要；灰尘颗粒可能导致膜上出现孔洞，或与复制模具结合不良。） </li>
<li>将一片经硅烷化处理的 3 英寸直径硅片放置于 Solitec 甩胶机的真空卡盘上。该硅片需在 PDMS 旋涂前进行硅烷化处理（用氟硅烷进行衍生化），以促进 PDMS 从硅表面顺利剥离。卡盘外侧的聚四氟乙烯（Teflon）容器用塑料薄膜包裹，便于清洁。 </li>
<li>使用 18 号针头注射器将 2–3 ml PDMS/正己烷混合液滴加到硅片上（以尽量减少气泡产生）。 </li>
<li>设定甩胶参数：以 7000 rpm 转速旋转 30 秒，形成厚度约为 12 μm 的 PDMS 薄膜。 </li>
<li>将硅片置于加热板上，在 85°C 下加热 4 分钟，以固化 PDMS 薄膜。</li>
</ol>
多层PDMS器件的键合与组装
<ol>
<li>将控制层和PDMS膜放入氧气等离子体腔室中。开启等离子体处理30秒（氧气压力30 psi，流速3-5 SCFH，功率550 W）。在氧气活化后立即（5分钟内）将控制层与PDMS膜接触。系统参数（如氧气压力、流速、等离子体功率和处理时间）需根据不同的应用经验性地进行配置。 </li>
<li>等待5分钟后，将控制层连同膜一起从晶圆上取下。 </li>
<li>去除入口区域的膜，以便通过管路从顶部同时接触控制层和流体层。 </li>
<li>在体视显微镜下将控制层（带有作为入口的管路）与流体层（平面层）对齐。由于PDMS会与PDMS密封，因此无需永久性键合。</li>
</ol>
通过真空或压力实现对PDMS微阀的计算机控制开关
<ol>
<li>设备对准并组装后，将外径1/16英寸（内径1/32英寸）的Tygon管插入内径为1.14 mm的硅胶入口，并将入口连接至压力源或流体储液池。 </li>
<li>为打开和关闭阀门，通过两个压力调节器将真空管线和气压管线连接至一组微型三通电磁阀，以控制压力。 </li>
<li>电磁阀连接至国家仪器公司（National Instruments）的数据采集硬件，并通过Labview软件进行控制。 </li>
<li>使用彩色CCD相机（SPOT RT，Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI）观察设备运行情况和膜的形变。</li>
</ol>
两种不同颜色染料在不同定义的纳升级体积中的并行混合
我们演示了一种并联混合器的操作，该混合器可用于储存并以不同混合比例精确混合亚纳升级别的水溶液：
<ol>
<li>流体层包含两组微腔阵列：沿阵列 A，微腔尺寸从左侧开始逐渐减小，从 200 µm × 400 µm 减小至 200 µm × 40 µm；A10 是一个 500 µm × 40 µm 的腔室，仅用于阵列 A 中的流体连接；在腔室 A10 右侧是一组尺寸对称递增的腔室。阵列 B 中的腔室设计为：不同行中任意两个相邻腔室的总体积始终保持相等。A0、A0r 和 B10、B10r 分别设计为溶液 A 和溶液 B 在未混合状态下的对照组。 </li>
<li>控制层具有两组独立控制的阀门。一组阀门 {V1} 用于将两个腔室阵列分别与其对应的入口连接，而第二组阀门 {V2} 用于连接两个阵列中每一对对应的腔室。 </li>
<li>打开阀门组 {V1}，使两种染料溶液分别流入阵列 A 和阵列 B，从而填充微腔。溶液流动可通过手动方式或通过电磁阀控制的真空抽吸实现。若微腔中形成气泡，可推动更多溶液以排除气泡，或静置装置数分钟，由于 PDMS 具有透气性，气泡将自行消失。 </li>
<li>关闭阀门组 {V1}，以隔离两个阵列中的各个腔室。 </li>
<li>打开阀门组 {V2}，使不同阵列中相邻腔室之间的液体发生混合。对于这些体积，混合过程仅需约 1–2 分钟即可完成。 </li>
<li>关闭 {V2}，将液体推回各个流体腔室，腔室随之恢复至原始形状。由于两个流体阵列均设计有 11 种不同尺寸的腔室，因此在单次混合步骤中即可产生 11 种不同的混合比例。</li>
</ol>
一种用于计算机控制微流控细胞培养灌注的集成微流控系统
我们展示了一种微流控系统，该系统能够自动向单个细胞培养腔室灌注多种溶液。入口由微阀控制，可按任意顺序单独开启、组合开启或同时开启。该装置能够生成各种溶液的浓度梯度或混合液。
该装置还包含三层结构：流体层、控制层和中间的薄PDMS膜。
该设备的替代制备步骤：
<ol>
<li>使用直径为 1.2 mm 的 Harris Micro-Punch（Ted Pella, Inc.）在流体通道和控制通道的入口处“打孔”。通过将钝化的 18 号针头插入控制层的 PDMS 中，将管路连接至入口。这种方法相比硅胶管可实现更密集的入口排布。PDMS 的弹性使针头周围形成紧密密封，从而有效输送液体或气压。 </li>
<li>如前所述，通过氧等离子体处理实现薄 PDMS 膜与控制层的键合。 </li>
<li>流体层通过 PDMS 预聚物与交联剂按 5:1 的比例进行复制模塑制备，并在对流烘箱中 60°C 下部分固化 25 分钟。此时，流体层已部分固化但仍具有黏性，可从模具上取下。 </li>
<li>在体视显微镜下，将流体层手动对准预先组装好的控制层和膜层。然后将组装好的器件置于加热板上，在 80ºC 下加热 5 分钟。接着，将阀控管线连接至自动控制器，并通过施加真空使膜在所有阀座处与流体层分离，从而“打开”阀门。在“分离”阀门后，将计算机控制器设置为循环开关阀门，同时器件在加热板上于 80ºC 继续固化至少 1 小时。 </li>
</ol>
我们集成化微流控系统的特点：该装置采用多路阀控方案，可自动向细胞培养腔灌注16种不同的溶液。通道设计确保所有入口的流体阻力保持平衡。我们的微阀设计通过集成通道将不同溶液相互隔离，并控制冲洗过程以快速清除液体，从而减少交叉污染。集成的鱼骨形混合器可被激活，用于混合来自不同入口的液体。此外，还有四个具有不同流体阻力的通道可供激活，以调节流速。

<ol><li>Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+mixing+of+photolithographically-defined+nanoliter+volumes+using+elastomeric+microvalve+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays.</a> Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li>
</ol>

我们微阀设计的主要优势：
<ol>
<li>关闭流体通路无需额外能量来源，因此装载后的装置具有很高的便携性；且</li>
<li>该装置可通过光刻图案化SU-8模具的PDMS复制品制备，能够微加工出深达1 mm、具有垂直侧壁的通道（即结构的高度可独立于其宽度设定），从而实现极为精确的结构特征。</li>
</ol>
平行混合器的优点：
<ol>
<li>易于制备且控制简单。</li>
<li>体积通过光刻技术定义，因此非常精确。</li>
<li>流体和试剂可在微装置中储存数天，从而实现高度便携的检测。</li>
<li>值得注意的是，PDMS 具有生物相容性，因此该装置在微型化诊断检测以及基于细胞的检测（如药物筛选和基于酶的生物分子检测）中具有广泛的应用前景。</li>
</ol>
集成微流控灌注室的优点：
<ol>
<li>它能够向单个细胞培养腔室自动灌注多种化学溶液。</li>
<li>入口由微阀控制，可按任意顺序单独、组合或同时开启各个入口。</li>
<li>该装置能够生成各种溶液的浓度梯度或混合液...

<table><tbody><tr><td>洁净硅片</td><td>耗材</td><td>Silicon Sense Inc.</td><td>3P0110TEST</td><td>直径3英寸，P型/硼掺杂</td></tr><tr><td>&quot;含有SU-8图案的“主模板”&quot;硅片</td><td>耗材</td><td></td><td></td><td>使用标准光刻工艺在实验室内部制备</td></tr><tr><td>干燥器（2个）</td><td>设备</td><td>VWR international</td><td>24987-048</td><td>一个用于硅烷化处理，另一个用于PDMS除气泡</td></tr><tr><td>天平</td><td>设备</td><td>OHAUS Corp.</td><td>SC6010</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>设备</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>1330GM</td><td></td></tr><tr><td>微型涡旋仪</td><td>设备</td><td>VWR international</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>匀胶机</td><td>设备</td><td>Headway Research Inc.</td><td>PWM32</td><td></td></tr><tr><td>等离子刻蚀仪</td><td>设备</td><td>Plasmatic Systems, Inc.</td><td>Plasma Preen II-973</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>设备</td><td>Torre Pines Scientific</td><td>HP30A</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>设备</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>SPOT RT</td><td></td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>设备</td><td>Lee Company</td><td>LHDA0511111H</td><td></td></tr><tr><td>数据采集板</td><td>硬件</td><td>National Instruments</td><td>PCI 6025E, CB-50LP</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>软件</td><td>National Instruments</td><td>版本 8.0</td><td></td></tr><tr><td>十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷</td><td>试剂</td><td>United Chemical Technologies</td><td>T2492</td><td>硅烷化处理必须在化学通风橱中进行</td></tr><tr><td>PDMS预聚物与交联剂</td><td>试剂</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0295-6</td><td></td></tr><tr><td>食用色素染料</td><td>试剂</td><td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td><td>FD&amp;C 110, 135, 150</td><td>蓝色#1、黄色#5、红色#3</td></tr><tr><td>3 ml一次性移液管</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td>耗材</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>称量舟</td><td>耗材</td><td>VWR international</td><td>12577-027</td><td></td></tr><tr><td>压舌板</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-700-555</td><td></td></tr><tr><td>P100培养皿</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管（内径1.14 mm）</td><td>耗材</td><td>Cole-Parmer</td><td>07625-30</td><td></td></tr><tr><td>Tygon管（外径1/16英寸；内径1/32英寸）</td><td>耗材</td><td>Cole-Parmer</td><td>06418-02</td><td></td></tr><tr><td>Duco胶水</td><td>耗材</td><td>Devcon Inc.</td><td>6245</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>工具</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>0053482（25号规格）</td><td></td></tr><tr><td>#5镊子</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>50 ml离心管</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>密封膜（Seal wrap film）</td><td>耗材</td><td>AEP Industries Inc.</td><td>0153877</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml微量离心管</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-406-16</td><td></td></tr><tr><td>15 ml离心管</td><td>耗材</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>紫色无粉腈手套</td><td>耗材</td><td>VWR international</td><td>40101-348</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mm Harris活检打孔器</td><td>工具</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15074</td><td></td></tr></tbody></table>

由弹性微阀阵列控制的微流控芯片

Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

微型化的微流控系统为低成本的即时诊断和高通量生物医学检测提供了简单而有效的解决方案。这些应用的两个关键要求是稳定的流体控制和精确的液体体积。我们开发了具有弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS）微阀阵列的微流控芯片，其特点包括：1）无需额外能源即可关闭流体通路，因此装载后的装置具有高度便携性；2）可实现深达1 mm、侧壁垂直的微通道加工，从而获得极为精确的结构特征。

基于PDMS微阀的装置由三层组成：包含不同尺寸流体通道和微腔的流体层、包含用于通过微阀驱动流体通道所需微通道的控制层，以及与控制层键合的中间薄PDMS膜。流体层和控制层通过SU-8光刻胶模具对PDMS进行复制 molding 制备，而薄PDMS膜则通过在特定高度下旋涂PDMS制成。将控制层和薄PDMS膜经氧气活化后键合在一起，再与流体层组装。微阀在静止状态下处于关闭状态，可通过施加负压（例如，实验室真空）打开。微阀的关闭和开启通过计算机软件控制的电磁阀实现自动化。

本文展示了两种基于微阀的微流控芯片，分别用于两种不同的应用。第一种芯片能够以不同的混合比例储存和混合精确的亚纳升级水溶液。第二种芯片可实现计算机控制的微流控细胞培养灌注。

这些器件易于制备且操控简便。由于PDMS具有良好的生物相容性，这些微芯片在微型化诊断检测以及基础细胞生物学研究中具有广泛的应用前景。

我们展示了制造和自动化弹性聚二甲基硅氧烷（PDMS）微阀阵列的方案，该阵列无需额外能量即可关闭，并具有光刻定义的精确体积。同时介绍了并行亚纳升级体积混合器和集成式微流控灌注系统。

微型化微流控系统为低成本即时诊断和高通量生物医学检测提供了简单而有效的解决方案。

微流控技术为细胞生物学家提供了需要精确流体操控的高通量实验手段。大家好，我是来自华盛顿大学生物工程系Folk实验室的Nin Chen Lee。今天我将向您展示如何利用PDMS微阀阵列来制备可控的微流控移液头。该装置由三层组成。第一层为流体层，包含不同尺寸的微腔室；第二层为控制层，位于两层之间，包含通道。由于PMS具有疏水性和柔顺性，因此中间有一层薄的PMS膜。膜与基底密封，从而将各个流体腔室相互隔离开。若通过控制通道施加真空，PDMS膜便会发生形变，连通原先彼此隔离的流体腔室。今天我将向您展示一种并行混合器，可实现不同混合比例的亚纳升级别水溶液的混合。接下来，来自我们实验室的Crisp将向您展示一种集成化的微流控系统，该系统可将多种溶液持续灌注到细胞培养环境中。让我们开始吧。在这里，我向您展示的是一个主模具，其顶部硅晶圆上具有SUH结构的微细特征。该模具采用标准的SUH摄影工艺从这些母模制作而成。我们可以反复制作PDMS复制品。为了便于将PDMS从母模上脱模，我们首先需要对母模进行硅烷化处理。我们通常使用F食品对模具进行处理，因为我们正在与佛罗伦萨岛合作。首先将晶圆放入涂布仪中，滴加森林溶液的液滴，然后关闭台面旋涂腔室，开启真空泵，抽真空1、2、3分钟后关闭真空。让其蒸发半小时，然后取出液滴。在复制PDMS之前，我们需要先将PDMS预聚物与固化剂按10比1的比例进行预混合。首先称取31克预聚物，然后称取3.1克固化剂，充分混合五分钟。所得混合物如图所示。随后将混合物放入真空烘箱中脱泡5至10分钟，直至材料变得透明。在等待 PMS 去除气泡的过程中，我可以将硅胶管粘接到控制层的相应区域。我们选择硅胶管是因为其材质与 PMS 相同，因此后续可将其嵌入装置中，形成气密且防液体泄漏的密封。现在，我在一小段硅胶管的末端涂上少量 D 型胶水，然后将其压接到母模的进样区域。因此，为了避免管路过度延伸，切割硅胶管时必须使其切面非常平整，且不要在顶部涂抹过多胶水，同时需说明按压胶水的方式。我们来看一下。在通风口两侧均形成区域后，将盖子取下。现在PS已经制备完成。我将把PS倒在母模上方。注意小心拉出环绕在管路周围的PGAs。现在我将聚苯乙烯（PS）倒入另一个具有流体层结构的模具中。将PS倒入模具后，需在防尘脱泡仪中再次脱泡5到10分钟。脱泡完成后，将PMS置于65至70摄氏度的烘箱中固化，时间从1小时至24小时不等。很好，经过两小时后，PMS 已完成固化。现在我们将 PMS 器件从 SU 母模上切下，并制备控制层的周期结构。开启管路模式后，我们清除进样区域的胶水。在我们的装置中，进样区域位于三层结构层和控制层上，但我们仅将硅胶管路连接到其中一层。例如，此处仅在控制层进行操作。为了实现对流体层的通路，我们可以在硅胶管路下方刺穿膜以创建通道。这样，我们就可以从顶部接触所有这些装置，

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