Name: 多级可变高度的光刻多层带瓣微流体装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习多步光刻技术制备微流控母模，包括片上膜阀和可变高度结构。该方法支持复杂几何形状的制造，便于控制微流控装置中的流体流动，适用于液滴生成和水凝胶微珠生产等生物应用。

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作者感谢 Scott Longwell 对稿件提出的有益评论和修改建议，以及 Robert Puccinelli 提供的设备照片。作者感谢贝克曼研究所技术开发资助项目提供的慷慨支持。K.B. 受美国国家科学基金会研究生科研奖学金（NSF GFRP）以及斯坦福临床与转化科学奖（Spectrum，NIH TL1 TR 001084）中 TLI 项目的支持；P.F. 感谢获得麦考密克和加比兰教员奖学金。

1. 多层装置设计
注意：在晶圆制造的不同工序中，必须依次添加不同高度和/或不同光刻胶的结构，以形成最终的复合结构。因此，晶圆上每种不同高度和光刻胶对应的图案设计必须分别制作在独立的掩模上（图4）。
<ol>
	<li>下载计算机辅助设计（CAD）制图软件例如， AutoCAD 教学版</li>
	<li>定义 4&#34; 通过绘制一个4来确定晶圆区域&#34; 圆。晶圆设计（图4， 附加资源) 作为示例提供。</li>
	<li>4内部&#34; 晶圆轮廓，使用300 µm多段线矩形标定器件边界。在光刻过程中利用这些器件边界进行对准。</li>
	<li>为最终设计所需的每个不同高度或光刻胶创建不同的层（即， 使用“图层”面板（Layers panel）进行设计中的流动环绕（flow round）、低流速（flow low）、高流速（flow high）以及控制设置。
	<ol>
		<li>在相应层上设计特定所需高度的结构特征。示例设计显示了4个不同的活性层，每层具有各自的颜色（图4). 
		注意：器件边界、全局文本和晶圆轮廓应分别置于独立的图层即， 1-在设计中为负相），随后将出现在所有层上以实现全局对准。不同光刻胶的特征（例如必须使用正性光刻胶制作的完全可密封阀门）必须出现在不同的层上，无论其高度如何。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在器件边界内，使用闭合的零宽度多段线设计器件特征。
	<ol>
		<li>考虑设计参数 表1 以提高成功制备的几率。</li>
		<li>对于每个高度，在“图层”面板中选择相应图层，并添加该高度的所有要素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用基础掩膜文件（附加资源）进行透明胶片打印的准备设计，其中每个4&#34; 晶圆圆片插入一个5&#34; 矩形边框。每一层将分别打印在独立的透明胶片上，以便依次添加各光刻胶层。 
	注意：此基础掩模文件代表用于打印的最终设计。
	<ol>
		<li>完成设计时，除1-Negative层和AZ50 XT阀层外，关闭所有其他图层。复制带有有源层的整个晶圆（即，阀门）和全局特征（即，设备边界。</li>
		<li>打开基础掩模文件，将此设计粘贴到标有 AZ50 XT 阀门的矩形区域中。使用晶圆外缘作为对齐基准，粘贴完成后将其删除。</li>
		<li>重复其余各层的操作（例如， 在示例设计中：流速低方、流速高方和对照组。提供了示例透明度文件（附加资源）。</li>
		<li>将文件发送至商业印刷公司（例如， FineLine Imaging）在透明胶片上打印，打印分辨率为 32,000 DPI &#62;10 µm 特征尺寸，小尺寸特征可达 50,000 DPI。若需要小于 7 µm 的特征，请订购铬版掩膜而非透明薄膜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
表1：设计参数与建议。 在微流控器件的CAD设计过程中，为避免常见问题而提出的设计注意事项。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55276/Jove_Table_1.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该表格。（右键单击可下载。）</a>
2. 光刻用晶圆的准备
注意：这些步骤在表2中也以表格形式列出。
<ol>
	<li>在洁净室或指定洁净区域中，清洗并脱水一个4&#34; 测试级硅片（单面抛光）
	<ol>
		<li>用甲醇充分冲洗晶圆。 
		注意：如果使用下文所述的 SU-8 粘附层，则无需进行额外的清洗步骤。若使用偏离本方案的其他粘附层（例如., HMDS）通常需要更彻底的清洗，例如 piranha 蚀刻。</li>
		<li>用 N 吹干2 或压缩空气。</li>
		<li>在铝制加热板上于 95 °C 加热 10 分钟，以完全蒸发溶剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备一层均匀的5 µm厚SU-8 2005，以改善后续光刻胶层的附着力。
	<ol>
		<li>将清洗后的晶圆放置在旋涂仪上，打开真空使其固定在旋转卡盘上，并用氮气吹去灰尘2 或压缩空气。</li>
		<li>在晶圆中心加入1–2 ml SU-8 2005负性光刻胶，并按以下参数进行旋涂：匀胶：500 rpm，10 秒，133 rpm/s 加速度；铸造：3,000 rpm，40 秒，266 rpm/s 加速度。</li>
		<li>将晶圆移除并在两块分别设定为 65 °C 和 95 °C 的加热板之间切换，按照以下程序进行软烘：65 °C：2 分钟，95 °C：3 分钟，65 °C：2 分钟。</li>
		<li>让晶圆冷却至室温。</li>
		<li>将晶圆置于紫外光掩模对准器的卡盘中，不使用掩模进行曝光（“泛光曝光”），总能量沉积为124 mJ（此处为~6.2 mW/cm²下20秒）2 灯强度）。如果可用，选择硬接触模式，以实现300 µm的晶圆与掩模分离。</li>
		<li>将晶圆在设定为65 °C和95 °C的两块热板之间切换，进行曝光后烘烤：65 °C下2分钟，95 °C下4分钟，65 °C下2分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
制备圆形阀门
<ol start="3">
	<li>使用在线 AZ50 XT 阀门预测工具资源26 根据所需的阀门尺寸和高度来规划旋转速度。 
	注意：以下步骤将沉积一层55 µm的正性光刻胶，用于阀门定义及回流成圆。</li>
	<li>将晶圆放置在旋涂仪上，打开真空使其固定在旋转卡盘上，并用氮气吹去灰尘2 或压缩空气。</li>
	<li>在晶圆中心滴加 2–3 mL AZ50 XT 正性光刻胶。旋涂程序如下：预扩散：200 rpm，10 s，加速度 133 rpm/s；主旋涂：1,200 rpm，40 s，加速度 266 rpm/s；去边珠甩胶：3,400 rpm，1 s，加速度 3,400 rpm/s。</li>
	<li>在5&#34; 培养皿中，小心放置晶片并静置20分钟。</li>
	<li>在热板上软烘晶圆：65 °C - 112 °C，22 分钟，升温速率为 450 °C/h。</li>
	<li>取出晶圆，置于培养皿中，在室温下静置过夜，以进行环境湿度下的再水合。</li>
	<li>将透明遮罩的边缘用胶带封圆至5&#34; 将玻璃板印刷面朝下（靠近晶圆）放入紫外光刻对准仪的掩模定位器中。将晶圆暴露于紫外光下，总剂量为930 mJ，分6个循环进行曝光（例如， 6个循环，每个循环25秒，功率密度约6.2 mW/cm²2 灯强度，每次曝光间隔30秒等待时间。</li>
	<li>立即通过将晶圆浸入装有25 mL AZ500k 1:3显影液的搅拌浴中进行显影&#34; 玻璃培养皿中孵育3-5分钟，或直至溶液变为紫色且特征显现。
	<ol>
		<li>取出晶圆，并用去离子水充分冲洗。</li>
		<li>使用轮廓仪（触针力为10.5 mg）评估焊前高度。 
		注意：根据制造商说明操作轮廓仪，在开始扫描前，小心地将测力触针放置在目标层上待测特征通道附近。本方案中使用的参数设置如下：触针作用力 10.5 mg，扫描长度 1,000 µm，扫描速度 200 µm/s，扫描模式为下-上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将晶圆进行回流热烘烤，以熔化并使阀体结构变圆，具体步骤如下：65 °C - 190 °C，15 小时，10 °C/小时升温速率。</li>
	<li>让晶圆冷却至室温。使用轮廓仪（触针力为10.5 mg）测量再流焊后的高度。对于该器件结构，预期高度为55 µm ± 2 µm。</li>
</ol>
3. 串联制备可变高度结构
<ol>
	<li>使用已开发的晶圆以及Bead Synthesizer设计中的Flow Low、Flow High和Herringbone Mixer透明掩模，进行可变高度结构的制备。</li>
	<li>为适配不同设计调整实验方案时，参考制造商提供的数据表25确定曝光能量、旋涂转速和烘烤时间参数，允许±5%的公差。 
	注意：本方案使用SU-8 2050负性光刻胶在阀门结构上旋涂，制备出55 µm高的Flow Low层。</li>
	<li>将清洗后的晶圆放置于旋涂仪上，开启真空使其固定在旋转卡盘上，并用N2或压缩空气吹去表面灰尘。
	<ol>
		<li>在晶圆中心滴加1–2 ml SU-8 2050负性光刻胶，按以下参数进行旋涂：低速展开：500 rpm，10秒，加速度133 rpm/sec；高速成膜：3,000 rpm，40秒，加速度266 rpm/sec。将光刻胶旋涂覆盖在已制备的阀门结构上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将旋涂后的晶圆放入5&#34;培养皿中，在水平面上静置20分钟，直至条纹状流痕消失。</li>
	<li>取出晶圆，进行软烘：依次置于设定为65 °C和95 °C的两块加热板上，程序如下：65 °C保持2分钟，95 °C保持8分钟，再回到65 °C保持2分钟。</li>
	<li>让晶圆自然冷却至室温。</li>
	<li>将Flow Low透明掩模用胶带固定在石英材质的5&#34;玻璃板上，印刷面朝下（靠近晶圆一侧），然后装入紫外光掩模对准仪的掩模定位装置中。</li>
	<li>将晶圆放入紫外光掩模对准仪的卡盘中，通过显微镜目镜或摄像头，仔细将新制备的Flow Low层结构与Flow Round阀门层结构对准。首先对准器件边界的水平、垂直和倾斜轴与掩模上的对应边界特征；然后对准各层之间的十字标记；最后确认阀门结构在相应位置与Flow Low结构相交。</li>
	<li>进行170 mJ的紫外曝光（在约6.2 mW/cm2条件下曝光28秒）。</li>
	<li>取出晶圆，进行曝光后烘烤：在65 °C和95 °C的两块加热板之间切换，程序如下：65 °C保持2分钟，95 °C保持9分钟，65 °C再保持2分钟。</li>
	<li>暂不进行显影，让晶圆冷却至室温后，继续制备Flow High层。该Flow High层将在未显影的55 µm光刻胶层上再增加30 µm厚度，从而在先前未曝光区域形成总高85 µm的结构。</li>
	<li>使用SU-8 2025光刻胶和Flow High层掩模，重复步骤3.3至3.10，旋涂参数调整如下：低速展开：500 rpm，10秒，加速度133 rpm/s；高速成膜：3,500 rpm，40秒，加速度266 rpm/sec。
	<ol>
		<li>进行198 mJ的紫外曝光（在约6.2 mW/cm2条件下曝光32秒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暂不进行显影，让晶圆冷却至室温后，继续制备混沌混合器（Chaotic Mixer）的Herringbone层。该层最终结构总高度为125 µm：其中Flow Low层贡献55 µm，Flow Square层贡献30 µm，Herringbone层贡献40 µm（见图3），并包含35 µm高的鱼骨状沟槽结构。</li>
	<li>使用SU-8 2025光刻胶和Herringbone层掩模，重复步骤3.3至3.10，并作如下调整，确保鱼骨沟槽完全位于Flow High通道轮廓之内。
	<ol>
		<li>采用以下软烘程序：65 °C保持2分钟，95 °C保持7分钟，65 °C再保持2分钟。</li>
		<li>进行148 mJ的紫外曝光（在约6.2 mW/cm2条件下曝光24秒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有层制备完成后，将晶圆浸入装有25 ml SU-8显影液的6&#34;玻璃皿中，在搅拌条件下显影3.5分钟，或直至结构清晰显现。使用体视显微镜检查各结构是否具有清晰、明确的边界。</li>
	<li>在加热板上进行硬烘以稳定所有光刻胶结构，程序如下：从65 °C升温至165 °C，升温速率为120 °C/h，总时长2小时30分钟。</li>
	<li>使用轮廓仪（探针力为10.5 mg）测量各层结构的高度。</li>
</ol>
4. 控制晶圆制备
<ol>
	<li>按照第4节中的步骤，在新的4&#34;硅片上清洗、脱水并制备5 µm的粘附层。</li>
	<li>使用SU-8 2025负性光刻胶制备25 µm的控制层。</li>
	<li>将硅片放置于匀胶机上，开启真空使其固定在旋转夹头上，并用N2或压缩空气吹去灰尘。</li>
	<li>在硅片中心滴加1–2 ml SU-8 2025负性光刻胶，按以下参数进行旋涂：低速涂布：500 rpm，10秒，加速度133 rpm/s；高速成膜：3,500 rpm，40秒，加速度266 rpm/s。</li>
	<li>取下硅片，通过在两个分别设定为65 °C和95 °C的加热板之间切换进行软烘：65 °C烘2分钟，95 °C烘5分钟，再回到65 °C烘2分钟。</li>
	<li>让硅片自然冷却至室温。</li>
	<li>将控制层透明掩模与5&#34;玻璃板对齐，并装入紫外光掩模对准仪中。</li>
	<li>将硅片放入紫外光掩模对准仪的夹具中，进行155 mJ的紫外曝光（在约6.2 mW/cm2的灯强度下照射25秒）。</li>
	<li>取下硅片，通过在两个分别设定为65 °C和95 °C的加热板之间切换进行曝光后烘烤：65 °C烘2分钟，95 °C烘6分钟，再回到65 °C烘2分钟。</li>
	<li>将硅片浸入盛有25 ml SU-8显影液的6&#34;玻璃皿中，在搅拌条件下显影1分钟，或直至图形显现。使用体视显微镜检查图形。</li>
	<li>对硅片进行硬烘以稳定光刻胶图形，条件如下：从65 °C升至165 °C，升温速率为120 °C/hr，总时长2小时30分钟。</li>
</ol>
5. 便于PDMS脱模的硅烷化晶圆处理
<ol>
	<li>将制备完成的晶圆放入通风柜内的钟罩式真空干燥器中的晶圆架上，确保环境中无水或水溶性试剂。</li>
	<li>在通风柜内，用滴管向载玻片上滴加一滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷（PFOTS），并将载玻片放入干燥器中。</li>
	<li>盖上干燥器盖子，抽真空1分钟。</li>
	<li>1分钟后，关闭真空泵，不重新加压或抽空钟罩。</li>
	<li>静置10分钟，使气溶胶化的PFOTS覆盖晶圆表面。</li>
	<li>打开钟罩盖子，用镊子取出晶圆，放入培养皿中用于PDMS复制模具制备。将硅烷涂层载玻片作为危险废物妥善处置。 
	注意：经氟化硅烷涂层处理的晶圆可重复使用数百至数千次而无需重新处理。首次硅烷化处理后，可在晶圆表面浇铸一层1:10比例的牺牲性PDMS层，固化后弃去，以去除晶圆表面多余的硅烷基团。</li>
</ol>
6. PDMS 复制模具
<ol>
	<li>制备多层微流控装置 &#34;推起&#34; 根据现有的开放获取协议在玻璃上制备几何结构16. 
	注意：详细方案还可参见网站27.</li>
	<li>通过目视检查，确保所有阀门均正确对准控制通道，并在继续操作前确认所有入口（包括流体层和控制层上的入口）均已完全打孔。</li>
</ol>
7. 从液滴制备水凝胶微球
<ol>
	<li>将装有水的管路（例如，Tygon管）连接至流量控制系统（例如，注射泵、流体控制器，或带有储液罐的开源电磁阀阵列28）。</li>
	<li>将金属针连接至管路，并接入装置控制通道的入口端口。通过将所选流量控制系统设定为每条通道25 psi，对装置的控制通道加压。在显微镜下观察，确保阀门能够关闭和重新打开。 
	注意：请遵循所选流量控制系统的制造商说明。本研究中使用的是定制的软件控制气动系统，通过电磁阀切换25 psi压缩空气（加压）与大气压（减压）来对每条通道施加压力。该系统的详细信息见讨论部分。</li>
	<li>准备用于试剂和油相加载的定制微流控压力容器。
	<ol>
		<li>使用图钉在冷冻管管盖顶部打两个孔，将毛细管PEEK管插入其中一个孔，将连接管路的金属针插入第二个孔。</li>
		<li>用环氧树脂密封固定管路，室温静置干燥1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等待期间，在一个微量离心管中，将3.9 mg LAP光引发剂悬浮于100 µl去离子水中（[LAP] = 39 mg/ml），以制备用于将液滴聚合为水凝胶微球的光引发剂溶液。避光保存。</li>
	<li>在第二个微量离心管中，加入132 µl去离子水、172 µl PEG二丙烯酸酯、12 µl LAP溶液和85 µl HEPES缓冲液，配制水凝胶液滴溶液。</li>
	<li>将水凝胶液滴溶液转移至已完成组装的冷冻管容器中。 
	注意：针对其他应用的添加剂（如纳米晶体、磁性颗粒或生物分子）可加入HEPES组分中。</li>
	<li>将冷冻管容器的管路连接至可控压力源，并将PEEK管连接至装置的试剂入口。</li>
	<li>配制10 mL轻质矿物油，加入2% v/v非离子表面活性剂（例如，Span 80）和0.05% EM90，用于油相乳液的形成。使用0.22 µm注射式滤器过滤，并将1 ml加载至第二个冷冻管容器中。</li>
	<li>在装置出口处插入PEEK管，用于收集液滴。</li>
	<li>通过向油相、水相或PEG混合物入口施加4 psi操作压力，排出装置中的气泡。打开所有阀门。在每条流体通路中，依次在1分钟后或当气泡完全通过PDMS装置后关闭各阀门。例如，为去除鲱鱼骨混合器中的气泡，先打开入口1、混合1出口和混合废液通道的阀门，然后对入口1、混合1出口和混合废液通道进行减压，直至所有气泡排尽。</li>
	<li>去气泡后重新对装置加压时，对Ro1油相阀门减压，并将油相压力设定为10 psi。</li>
	<li>将PEG混合物压力设为9 psi，对上游阀门（入口1、液滴1）减压，并根据需要调节，以生成所需尺寸的液滴。可通过配备50 fps或更高帧率相机的显微镜观察确定液滴大小。</li>
	<li>当液滴稳定后，将紫外光源（例如，带有液体光导（LLG）的紫外点固化系统或聚焦紫外LED）的5 mm光斑对准装置的聚合区域，并从紫外光源施加100 mW/cm2的紫外光（365 nm）。</li>
	<li>对微球筛分阀门加压，观察聚合后的微球聚集情况，确认液滴已固化成微球。根据需要调整液体光导（LLG），以实现完全聚合。</li>
	<li>对微球筛分阀门减压，通过出口PEEK管将微球收集至离心管中。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本研究展示了一种完整的多步光刻工艺流程，用于制备具有阀门结构和可变高度几何形貌的多层微流控器件。通过简单调整基于我们在线工具26和制造商说明25的加工参数，该工艺可适用于各种应用。本方案旨在帮助希望构建超越简单、被动单层模具的微流控器件的研究人员，消除多层光刻技术的复杂性。
多层微流控器件能够在单个软聚合物器件内实现先进功能，适用于从单细胞分析到高通量生化检测等多种“芯片实验室”应用1该构建的微珠合成装置采用单一流体层设计，并具备多种高度结构，同时集成了完全可密封阀和筛网阀两种几何构型，可用于生成可聚合为聚合物微珠的水凝胶液滴。阀门的存在使得芯片功能可实现自动化、可编程控制，并可通过任意脚本语言轻松实现即，MATLAB、LABVIEW 或 Python）与实验室的流体控制模块相连接即，注射泵和/或压力调节器）。在此演示中，使用定制的 MATLAB 软件（代码见参考文献）...

在过去15年中，微流控技术领域经历了快速发展，涌现出大量新技术，能够实现对微米尺度流体的操控1。微流控系统作为湿实验操作的平台具有显著优势，其微小体积有望提高反应速度和检测灵敏度，同时通过规模效应显著提升通量并降低成本2,3。多层微流控系统在高通量生化分析应用中产生了尤为重要的影响，例如单细胞分析4,5,6、单分子分析（例如，数字PCR7）、蛋白质晶体学8、转录因子结合实验9,10以及细胞筛选11。
微流控技术的一个核心目标是开发“芯片实验室”装置，使其能够在单个设备内完成复杂的流体操控，从而实现完整的生化分析12。多层软光刻技术的发展推动了这一目标的实现，使芯片上可集成阀门、混合器和泵，从而在微小体积内主动控制流体13,14,15。尽管这些微流控技术具有优势并已有实际应用，但许多技术仍未被非专业用户广泛采用。其广泛应用面临挑战，部分原因在于微加工设施的获取受限，同时也由于制造技术的传播不足。对于包含阀门结构或多层复杂几何构型的微流控装置而言，这一问题尤为突出：关于关键设计参数和制造工艺的详细、实用信息的缺乏，常常使新进入该领域的研究人员难以开展涉及此类装置设计与制备的研究项目。
本文旨在通过提供一套完整的多层微流控器件制备方案，弥补这一知识空白，该方案包含带有阀门和可变高度结构的器件，从设计参数出发，涵盖全部 fabrication 步骤。本方案聚焦于 fabrication 过程中的初始光刻步骤，从而与其他微流控技术方案形成互补16，后者主要描述从模具浇铸器件及开展特定实验的后续步骤。
具有一体式片上阀门的微流控装置由两层组成：一层是“流体”层，用于在微通道中操控目标液体；另一层是“控制”层，其中含有空气或水的微通道可选择性地调节流体层中的液体流动14。这两层各自在独立的硅模具母版上加工制备，随后通过一种称为“软光刻17”的技术用于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的复制成型。为了构建多层装置，将每层PDMS分别浇铸在对应的模具母版上，然后相互对准，从而形成一个每层均具有通道的复合PDMS装置。当流体通道与控制通道交叉且仅由一层薄膜隔开的位置即形成阀门；对控制通道加压会使该薄膜发生形变，从而阻断流体通道并局部置换其中的液体（图1）。
根据预期的最终应用，可在芯片上以多种方式制备有源阀门。阀门可配置为“下压式”或“上推式”结构，具体取决于控制层位于流体层的上方还是下方（图1）15。其中，“上推式”结构可实现更低的关闭压力，并提高器件抵抗脱层的稳定性；而“下压式”结构则使流体通道能够直接与键合的基底接触，从而有利于对基底表面进行选择性功能化或图案化，以实现后续功能18,19。
阀门可以是有意设计为渗漏的“筛网”阀门，也可以是完全可密封的阀门，具体取决于流道的横截面轮廓。筛网阀门可用于截留微珠、细胞或其他大分子分析物。1，并通过使用典型的负性光刻胶制备即， SU-8系列），其具有矩形轮廓。当控制通道在这些阀区上方加压时，控制层与流动层之间的PDMS膜会各向同性地偏转进入阀的矩形轮廓内，但不会密封角落，从而允许流体通过，同时截留宏观尺度的颗粒图1）。相反，通过在阀位置处加入一小块圆形光刻胶，可制备完全密封的微流控阀。采用这种结构，控制通道加压后会使膜变形并紧贴圆形流体层，从而完全封闭通道，阻止流体流动。流体层中的圆形轮廓是通过对正性光刻胶进行熔化和回流而形成的。例如， AZ50 XT 或 SPR 220）经过典型光刻步骤后。我们先前已证明，阀区的回流后高度取决于所选特征尺寸21本方案展示了在微珠合成装置中制备两种阀体几何结构的方法。
<img alt="推升阀几何结构示意图；筛状阀与全封闭阀的流体控制，微流控设计，流体层。" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：多层微流控阀的几何结构。 筛状阀与可完全密封阀在加压前（上）和加压后（下）典型的“推升式”装置结构。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55276/55276fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
设备还可包含复杂的被动结构，例如混沌混合器13 以及芯片上的电阻器20 需要在同一流动层内具有多种不同高度的结构特征。为实现可变高度的流动层，不同研究团队已采用多种方法，包括印刷电路板蚀刻22，多层PDMS微结构对准23或多步光刻24. 我们课题组发现，在同一块模具母版上进行多步光刻是一种高效且可重复的方法。实现该方法可通过一种简单的光刻技术，即构建厚的负性光刻胶通道例如， 采用在各层之间无需显影的 SU-8 系列光刻胶进行多层涂覆。每层根据其所需厚度，按照制造商说明，使用负性光刻胶旋转涂布25 在硅模板上。然后使用特定的透明掩模将此高度的结构图案化到该层上图2) 固定在玻璃掩模版上，并在曝光前与先前旋涂的图层进行精确对准。在多步光刻工艺中，各图层间的精确对准对于形成完整且具有可变高度的流道结构至关重要。对准完成后，每一层需进行与厚度相关的曝光后烘烤。在未进行显影的情况下，依次对下一层进行同样的图形化处理。通过使用多个掩模版，逐层在单个流控芯片基片上构建出高深宽比的结构。通过省略各步骤之间的显影过程，前一层的光刻胶可被用于生成复合高度的结构特征。即，两个 25 µm 层可以形成一个 50 µm 特征24此外，通道底部的特征结构，例如混沌混合器的人字形凹槽13 可以利用已曝光特征的层来制作。最后的显影步骤完成整个流程，形成具有不同高度特征的单一流体芯片。图3).
本文提供了一套完整的多步光刻技术实验方案，其中包含了在芯片上制备具有多种高度的阀和流体通道所需的所有操作步骤示例。该制备方案以一种多层微流控微珠合成装置为背景进行介绍，该装置的功能实现依赖于阀门及不同高度的结构特征。该装置包含用于在油相包膜中生成水相液滴的T型 junction 结构、通过调控泊肃叶阻力来调节流速的片上电阻器、用于均一化液滴组分的混沌混合器，以及可实现多试剂输入自动化工作流程的全密封阀和筛网阀。利用多步光刻技术，这些结构根据其高度或所用光刻胶的不同，分别在不同的层上进行加工制备。本方案中构建了以下各层：（1）Flow Round 阀层（55 µm，AZ50 XT）；（2）Flow Low 层（55 µm，SU-8 2050）；（3）Flow High 层（85 µm，SU-8 2025，附加高度30 µm）；以及（4）人字形沟槽层（125 µm，SU-8 2025，附加高度40 µm）（图3）。
水凝胶微珠可用于多种应用，包括下游检测中的选择性表面功能化、药物包封、放射性示踪和成像检测，以及细胞包埋；我们此前曾使用这些装置的更复杂版本制备了含有镧系纳米荧光粉的光谱编码聚乙二醇（PEG）水凝胶微珠20。本文讨论的设计方案已包含在附加资源中，可供任何实验室在其研究工作中按需使用。我们预期本实验方案将为专业和非专业研究人员提供一个开放资源，有助于降低微流控技术的入门门槛，提高多层微流控器件（含阀门或复杂几何结构）的制备成功率。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mylar 透明掩模，5&quot;</td><td>FineLine Plotting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&quot; 石英板</td><td>United Silica&amp;nbsp;</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>4&quot; 硅片，测试级</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU8 2005、2025、2050 光刻胶</td><td>Microchem</td><td>Y111045, Y111069, Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Az50XT&amp;nbsp;</td><td>Integrated Micromaterials</td><td>AZ50XT-Q</td><td></td></tr><tr><td>SU8 显影液</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>AZ400K 1:3 显影液</td><td>Integrated Micromaterials</td><td>AZ400K1:3-CS</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 150 mm 玻璃培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3140150-1EA</td><td></td></tr><tr><td>晶圆培养皿，150 mm</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>晶圆镊子&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>78410-2W</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 (PFOTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; × 3&quot; 玻片</td><td>Thomas Scientific&amp;nbsp;</td><td>6686K20</td><td></td></tr><tr><td>RTV 615 弹性体基料与固化剂 PDMS 套件</td><td>Momentive&amp;nbsp;</td><td>RTV615-1P</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 软管，外径 0.02&quot;&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-171-284</td><td></td></tr><tr><td>毛细管 PEEK 软管，外径 510 &amp;#956;m，内径 125 &amp;#956;m</td><td>Zeus</td><td>定制</td><td>Idex 可提供外径为 360 &amp;#956;m 的 PEEK 管（目录号：1571）</td></tr><tr><td>Cyro 4 ml 管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>127279</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂，30 分钟固化</td><td>Permatex</td><td>84107</td><td></td></tr><tr><td>金属针，外径 0.025&quot;，内径 0.013&quot;</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1310-02</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇二丙烯酸酯，Mn 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>光引发剂二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰)次磷酸锂&amp;nbsp;</td><td>Tokyo Chemical Industry Co.</td><td>L0290</td><td>我们通常在实验室内部合成 LAP。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-25G</td><td></td></tr><tr><td>轻质矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779-1L</td><td></td></tr><tr><td>Span-80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>ABIL EM 90</td><td>UPI Chem</td><td>420095</td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;&amp;nbsp;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td>同等性能的设备或自制装置同样适用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>掩模对准器</td><td>Karl Suss</td><td>MA6</td><td></td></tr><tr><td>台阶仪</td><td>KLA-Tencor</td><td>Alpha-Step D500</td><td></td></tr><tr><td>匀胶机</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-23</td><td>任何可容纳 100 mm 晶圆的匀胶机均可使用</td></tr><tr><td>钟罩式真空干燥器</td><td>Bel-Art</td><td>420100000</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Cole-Palmer</td><td>WU-52120-02</td><td></td></tr><tr><td>带 3 mm LLG 选项的紫外点固化系统</td><td>Dymax</td><td>41015</td><td>相同强度的紫外 LED、氙弧灯或其他紫外光源同样适用</td></tr><tr><td>MFCS 微流控流体控制系统</td><td>Fluidgent</td><td>MFCS-EZ</td><td>也可使用注射泵、自制气动系统或其他控制装置</td></tr><tr><td>自动化控制脚本</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Tory Pines Scientific</td><td>HP30</td><td>任何具有均匀加热性能（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，铝板或陶瓷板）的加热板均可满足要求</td></tr></tbody></table>

多步变高光刻法制备带阀多层微流控器件

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

微流控系统为高通量生化与生物学分析提供了强大的新方法。然而，对于希望自主开发微流控装置以解决科研问题的非专业人员而言，仍存在较高的入门门槛。尤其缺乏的是与光刻技术相关的公开实验方案，而光刻是制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件复制模具的关键步骤。尽管文献中已广泛探讨了单层高度硅母版的制备，但对于实现多种重要器件功能所必需的更复杂光刻特征（例如通过特征圆化制备阀结构、单模具多层高度图案化或高深宽比结构定义）的制备步骤，往往未被明确阐述。
本文提供了一种完整的多层微流控器件的制备方案，该器件包含阀门及复杂的多高度结构，可针对不同应用进行调节。这些制备步骤以微流控水凝胶微珠合成装置为例进行说明，展示了生成含有聚乙二醇（PEG二丙烯酸酯）和光引发剂的液滴的过程，这些液滴可进一步光聚合形成固体微珠。本方案及配套讨论为微流控器件的设计原理与加工方法提供了基础，有助于开发多种类型的微流控装置。文中详述的技术细节可使非专业研究人员也能设计并制备新型器件，从而将一系列新近发展的技术应用于生物实验室中最具前景的研究领域。

在此，我们演示了通过制备能够从液滴生成聚乙二醇（PEG）水凝胶微球的装置，来构建带有阀门的可变高度多层微流控模具的方法 (图2）。完整制造过程的概述包含在 图3. 利用先前研究的设计元素，该微珠合成装置在其流体层中采用4种不同高度，包括（1）用于调节层流的圆形AZ50 XT阀55 µm) (2) 高流阻通道，用于引入试剂55 µm）（3）高流阻通道，用于以较低阻力引导流体流向出口和混合器（85 µm）以及（4）一种人字形对流混合器（125 µm）用于将聚乙二醇（PEG）和交联剂混合成均一溶液（图4A 和 4B）。本设计所采用的设计参数表及建议的设计约束条件如下所示。 表1. 设计文件和掩模转移文件包含在 材料 Table.
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多层微流控器件通常需要制造具有复杂几何结构的母模以实现其功能。本文介绍了一种完整的多步光刻技术方案，可实现阀门及可调高度特征结构的加工，且可根据不同应用需求进行调节。作为示例，我们制备了一种能够生成水凝胶微球的微流控液滴发生器。

微流控系统为高通量生物化学与生物学分析提供了强大的新方法。然而，仍存在一定的障碍……

本视频方案的总体目标是展示如何通过完整的多步光刻技术，制备具有片上阀门及多种高度特征的微流控母模，且其结构可根据不同应用灵活调节。该方法系统地概述了如何制备具有复杂几何结构（包括片上薄膜阀门）的微流控器件母模。该技术的主要优势在于，能够简便地控制微流控器件中的流体流动，从而克服了在生物学应用中进入微流控领域的重大障碍。该技术的可视化演示至关重要，因为初学者通常难以掌握光刻步骤。正确的对准、显影和曝光依赖于视觉提示和洁净室操作经验。首先，设计您的器件，并为多层结构准备各自的光掩模。此外，准备约四片带有5 µm厚SU-8 2050负性光刻胶层的晶圆，并按照随附的文字方案进行泛光曝光。将涂覆好的晶圆放置在旋涂仪上，开启真空以将其固定在旋转卡盘上。使用氮气或压缩空气吹去表面的任何灰尘。然后，将 2 至 3 毫升 AZ 50XT 正性光刻胶涂覆在晶圆中心。通过旋涂法使光刻胶形成 55 微米厚的薄膜。涂覆完成后，小心地将晶圆放置于一个 5 英寸的培养皿中，并静置 20 分钟。接下来，将晶圆置于热板上进行软烘烤，持续22分钟，同时以每小时450摄氏度的升温速率将温度从65摄氏度逐步升至112摄氏度。然后取出晶圆，置于培养皿中，在室温下静置过夜，以实现环境湿度下的再水合。将流动圆形透明掩模用胶带固定在五英寸玻璃板上，确保印刷面朝向晶圆一侧，并将其装入紫外光掩模对准仪的掩模定位装置中。将晶圆暴露于六次循环、总计930毫焦的紫外光下。显影时立即将晶圆浸入搅拌中的显影液中，持续三至五分钟，或直至溶液变为紫色且图形显现。显影完成后，取出晶圆并用去离子水充分冲洗。然后，对晶圆进行硬烘焙，以熔化并使阀体结构变圆。在15小时内以每小时10摄氏度的速率将温度从65摄氏度逐步升至190摄氏度。完成后，关闭加热板，让晶圆冷却至室温。晶圆上的图形现已呈圆润状。此步硬烤对将矩形阀结构正确回流为圆滑的阀轮廓至关重要。时间过短可能导致开裂或不稳定。为了制备具有不同高度结构的器件，将清洗后的晶圆放置在旋涂仪上，如前所示。在晶圆中心滴加一到两毫升 SU-8 2050 负性光刻胶，然后在已成型的阀结构区域上旋涂光刻胶。随后，小心地将旋涂后的晶圆放入一个五英寸的培养皿中，并在平坦表面上静置 20 分钟，或直至任何条纹状图案消失。接下来，将两块加热板分别预热至 65 摄氏度和 95 摄氏度，然后将晶圆置于 65 摄氏度的加热板上加热 2 分钟，再转移至 95 摄氏度的加热板上加热 8 分钟，最后放回 65 摄氏度的加热板上继续加热 2 分钟，以完成晶圆的软烘。待晶圆冷却至室温后，将流道低透明度掩模版用胶带固定在一块 5 英寸石英玻璃板上，确保其印刷面朝向晶圆，并将其装入紫外光掩模对准仪的掩模定位器中。随后，将晶圆放置于紫外光掩模对准仪的卡盘上，通过显微镜目镜或相机仔细将新流道低层的图形与流道圆阀层的图形对准。首先将设备边界的水平、垂直和倾斜轴与掩模上的设备边界特征对齐。接着，对齐各层之间的十字线特征。最后，确认阀体特征在预期位置与流道特征相交。接下来，将晶圆暴露于170毫焦的紫外光沉积。完成后，取出晶圆，并通过在两个分别设定为65摄氏度和95摄氏度的加热板之间切换，进行曝光后烘烤。无需显影晶圆，待其冷却至室温后，按照随附文本方案中的描述，依次使用SU-8 2025添加高流层，然后添加混沌混合器人字形层。完成所有层的制备后，将晶圆浸入含有25毫升SU-8显影液的搅拌浴中显影3.5分钟，或直至微结构清晰显现。使用体视显微镜确认微结构具有清晰、明确的边界。在显影过程中，应每隔20秒检查一次，确保微结构已完全成形且光刻胶已彻底去除。过度显影可能导致特征结构受损，尤其是在复杂的模具设计上。随后，对晶圆进行硬烘烤，以稳定所有光刻胶特征。接着，按照随附文本方案中的描述制备控制层。根据现有的开放获取方案，在玻璃上制备具有俯卧撑结构的多层微流控装置，并通过目视检查确保所有阀门均正确对准控制通道，且所有进样口均已完全打孔，然后继续后续操作。将装有水的Tygon管路连接至流体控制系统，例如注射泵、流体控制器，或带有储液器的开源电磁阀阵列。接着，将金属针连接至管路，并将金属针与装置控制通道入口处的端口相连。然后，将每条管路的流量控制系统设定为25 PSI，以对装置的控制通道加压。在显微镜下观察，确保阀门能够关闭和重新打开。在微量离心管中，将3.9毫克光引发剂悬浮于100微升去离子水中，以制备用于将液滴聚合为水凝胶微珠的光引发剂溶液。避光覆盖溶液。在另一个微量离心管中，加入132微升去离子水、172微升聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG diacrylate）、12微升光引发剂溶液和85微升HEPES缓冲液，配制水凝胶液滴溶液。将水凝胶液滴溶液转移至定制的冷冻管容器中。然后，将低温管容器的管路连接至可控压力源，并将PEEK管路连接至装置的试剂入口。接着，将PEEK管路插入装置出口以收集液滴。排出装置中的气泡，重新对系统加压，随后打开放油阀RO1并减压，将油压设定为10 PSI。接下来，将 PEG 混合物的压力设置为 9 PSI，释放上游阀门压力，并根据需要调节压力以生成所需尺寸的液滴。使用配备 50 帧/秒或更高帧率相机的显微镜测定液滴大小。当液滴稳定后，将紫外光源置于装置的聚合区域上方，并从光源施加 100 毫瓦/平方厘米、波长为 365 纳米的光照射至直径 5 毫米的区域。加压珠粒筛分阀，观察聚合珠粒的收集情况，并确保液滴已固化成珠粒。最后，释放珠粒筛分阀的压力，通过PEEK出口管路将珠粒收集到离心管中。本方案首先演示一种使流路阀门圆润化的方法。此处使用轮廓仪测定该方法回流后形成的典型阀门圆角轮廓，结果显示高度约为55微米。在左侧图像中，阀门处于关闭状态，液体可流经通道。当通过加压激活阀门后，流经这些阀门的液体即被切断。在此可以观察到微珠合成装置正在运行，在T型 junction 液滴发生器处于油相乳液中生成水凝胶液滴。通过使用筛网阀部分关闭下游流路，液体可继续流动，而微珠则被截留在阀门后方。采用此工艺制备的微珠平均直径为52.6 µm，标准偏差仅为1.6 µm。在近 3,000 个微珠中，仅有不到 1% 的偏差超过三个标准差。一旦掌握，该技术可在三天内完成从设计到测试的全过程，从而实现快速的设计迭代。通过此操作流程，即使缺乏微加工经验的研究人员也能自行构建复杂的微流控装置，并将其应用于各自的生物学问题研究中。观看本视频后，您应能够充分掌握制作任意复杂程度微流控装置所需的光刻步骤，包括具有复杂变高度结构或阀门的装置。

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