细菌感染定量测定:一种量化细菌性眼内炎小鼠模型中眼内细菌负荷的方法

细菌性眼内炎是一种炎症性眼病，当蜡样芽孢杆菌（一种致病菌）感染眼内区域时就会发生。

为了量化细菌感染，将细菌性眼内炎的安乐死小鼠模型横向放在手术台上。在眼睛下方施加轻微的压力，以帮助将眼球从眼窝中分离出来。将眼球转移到含有补充有蛋白酶抑制剂混合物的适当缓冲液的管中。

眼组织均质化以分解，释放悬浮液中的细菌。缓冲液中存在的蛋白酶抑制剂使释放的细胞蛋白酶失活，以维持细菌活力。接下来，连续稀释细菌悬浮液以获得不同浓度的蜡样芽孢杆菌。

取一个含有富集琼脂培养基的倾斜培养板，划定与每种稀释浓度相对应的行。从指定行顶部的细菌悬浮液中滴出几滴，让它向动，直到到达板的末端，有助于细菌的均匀传播。压平板并孵育。

孵化过程中，每种细菌都利用琼脂中的营养物质增殖并形成单独的菌落。菌落数量减少，对应于细菌悬浮液稀释度的增加。计算特定行中的菌落数量以量化眼部细菌负荷。

在适当的实验终点，在冰上每只眼睛加入一个标记的高压灭菌收获管中补充有蛋白酶抑制剂的 400 微升 PBS，并将打开的细尖镊子放在受感染眼睛的两侧。将尖端向下推向头部以固定眼睛。

一旦钳子位于眼球后面，将钳子挤压在一起，然后将镊子从头部拉开以分离眼球。然后，立即将眼球放入适当标记的收获管中。在样品采集后 60 分钟内，将封闭的收获管放入组织均质器中，并将样品均质化两个 1 分钟的均质期，中间休息 30 秒。

均质化后，将样品置于冰上，并使用20微升匀浆等分试样在每次稀释的180微升PBS中连续稀释样品，直到达到1乘10至负8的倍数。接下来，用适当的稀释浓度标记方形预热的BHI板的每一行，并在板倾斜45度角的情况下，将10微升每种稀释液加入板顶部的单独行中。让每个样品运行，直到它几乎到达板底部，然后将板平放。当样品被琼脂吸收后，将板转移到37摄氏度的培养箱中。菌落应在孵化八小时后开始可见。

为了准确表示样品中的浓度，请计算具有 10 到 100 个菌落的行。