2011年9月3日
肌醇pyrophosphates发挥重要作用,在人类病症如癌症,糖尿病和肥胖,但行动的确切机制是一个有争议的问题。缺乏市售肌醇pyrophosphates呈现详细的研究问题。在这里,我们描述了一个简单的协议,生产和隔离毫克肌醇pyrophosphates。
该程序的总体目标是生成和纯化优质和偏磷酸盐。这是通过首先使用 IP six 作为 IP six 激酶的底物来实现的,一种酶产生 IP seven。接下来,将酶促反应加载到聚酰胺凝胶上,并切除对应于 IP 7 的条带。
然后通过随后的脱水水合循环分离 IP 7。该程序的最后一步是确认产品的纯度并确定浓度。最终,通过培养 IP 7 可以获得显示 IP 7 生物活性的结果。
使用 VIP 1 激酶和 IP 7 磷酸酶 DDP 1,这些反应分别产生 IP 8 和 IP 6。这样做 Met 可以提供对 IP 7 信令的洞察。它也可以应用于其他系统,例如部分磷酸盐,如 IP 8 或 IP 5 衍生的 PPIP 4。
该方案从酶促反应的制备开始,其中 IP six 激酶 1 或 VIP 1 将 IP six 转化为焦磷酸相关亚型。在本演示中,根据先前描述的程序从大肠杆菌中纯化组胺标记的 IP 6、激酶 1 和 GST 标记的 VIP 1 酶。首先,按照书面方案中的说明,准备 10 到 20 个独立的酶反应,其中包含 IP 6 和他的 IP 6 激酶 1 或 GST VIP 1。
用 milli Q 双蒸水将体积调节至 50 μL。短暂旋转试管后,将反应物在 37 摄氏度下旋转孵育过夜。使用 24 厘米长、18 厘米宽的玻璃板、1.5 毫米宽的空间和 16 通道梳子制备聚丙烯酰胺凝胶装置。
接下来,将预先制备的凝胶溶液以每块凝胶 50 毫升的体积倒入预制玻璃板之间。插入电泳梳,让凝胶在室温下聚合 30 至 60 分钟。凝胶聚合后,将设备转移到冷藏室中。
将凝胶在 200 至 300 伏特的一次 TBE 中预泳约 30 至 60 分钟,同时一次使用橙色 G 染料。对于每个反应,制备含有 2 mol IP six 的标准对照样品。预运行后,用运行缓冲液彻底洗涤每个孔。
使用连接到 21 号针头的注射器去除任何沉淀物。然后将样品上样到凝胶中,避免上样凝胶的前两个和最后两个泳道。最后,以每块凝胶 7 毫安的浓度将凝胶电泳过夜,直到橙色 G 染料条带位于凝胶底部的最后 10 厘米范围内。
要开始分离 IP 7,请拆卸凝胶装置并小心地取出一块玻璃板,将凝胶留在另一块玻璃板上。从橙色 GD 条带上方切下一小部分凝胶到底部,包括 IP 6 标准泳道和 1 个样品泳道。用甲苯胺蓝对凝胶的切割部分染色几分钟,直到出现 Anatol 焦磷酸盐条带。
同时,将之前取下的玻璃板放回凝胶顶部,以防止未染色的凝胶干燥。将凝胶的染色部分转移到 DES 染色溶液中几分钟,以洗去任何多余的甲苯胺蓝,然后用未染色的凝胶重新定位凝胶。IP 7 频段应该是可见的,因为它的运行速度比 IP 6 标准 A TP 稍慢,而 IP 6 的运行速度比 IP 6 更快。
接下来,使用剃须刀片在凝胶未染色部分切割 IP 7 条带。利用染色凝胶测定的 IP 7 迁移位置。为了估计 IP 7 波段的位置,将从凝胶上切下的 IP 7 波段放入 15 毫升试管中,并加入 10 毫升 milli Q 双蒸水。
孵育后,在室温下旋转试管 10 分钟,倾析丢弃液体以去除多余的 TBE 和微小的丙烯酰胺颗粒。随后进行两次脱水水合循环,首先向含有 IP 7 凝胶的试管中加入 5 毫升 50% 甲醇。在室温下旋转样品 2 小时。
然后将凝胶切片转移到装有 5 毫升 milli Q 双蒸水的新 15 毫升试管中,并在室温下旋转 2 小时。保留含甲醇的试管,以便在孵育后进一步使用。再次重复脱水水合循环,以浓缩洗脱的 IP 7。
将先前添加的 5 毫升水和 5 毫升 50% 甲醇混合。使用在 60 摄氏度下加热的 speed vac 干燥组合溶液。样品几乎干燥后,将剩余液体转移至 1.5 mL离心管中。
将试管旋转 2 分钟,每分钟旋转 5, 000 次。收集 SUP 纳脱剂,留下底部 20 至 30 微升,因为它可能含有丙烯酰胺颗粒。将样品转移至新的 1.5 mL 离心管中。
如有必要,使用未加热的快速真空吸尘器继续干燥过程。如果样品完全干燥,IP 7 的回收率会大大降低。因此,当样品体积达到 100 至 300 微升时,必须终止干燥过程。
回收分离的 IP 7 后,将 2 至 5 μL 样品上样到页面凝胶上,以确定其浓度和纯度。加载几个 IP 6 稀释液作为浓度标准品和 4 mol 息肉标记物。凝胶电泳后,通过对整个凝胶进行染色和用甲苯胺蓝溶液进行脱染来观察初始焦磷酸盐亚型。
按照刚才描述的甲苯胺染色后的程序,可以通过扫描凝胶并比较 IP 6 和 IP 7 之间的强度差异来确定浓度。使用 Image J 等成像软件,将 IP 6 转化为 IP 7 的制备酶。使用 IP 6、激酶 1 和 VIP 1 可通过页面分析轻松解析酶。
将 IP six 作为大小对照上样与甲苯胺蓝凝胶染色一起可以鉴定焦磷酸化衍生物。由于它们的运行速度较慢,具体取决于初始上存在的磷酸基团数量,因此上述程序可以轻松纯化 IP seven。此外,通过页面对纯化的焦磷酸盐进行分析,揭示了 IP 7 的纯度。
有趣的是,VIP 1 的 IP 7 产物的 1 3 焦磷酸 IP 5 异构体的迁移速度略慢于 IP 6 激酶 1 产生的 VIP 7 的 5 焦磷酸 IP 5 异构体。使用 IP six 标准品可以在使用 IP 7 之前轻松定量纯化的 IP 7 的浓度。对于进一步的实验,可以评估其生物活性。五。
焦磷酸盐 IP 5 与 FIP one 和 IP 7 磷酸酶 DDP one 常规孵育。纯化的 IP 7 被 VIP 1 转换为 IP 8,通过 DDP 1 转换为 IP 6。按照此程序,可以执行其他方法,例如蓝色染色中的延长 tolin ,以回答其他问题,例如分离 IP 8 或其他以亚型形式磷酸化的方法。
本文介绍了一种生产和分离肌醇焦磷酸盐,特别是IP七的协议,这些化合物在各种人类病理中很重要。该方法涉及酶反应和凝胶电泳来纯化化合物。
Reliable access to high-purity inositol pyrophosphates such as IP7 is critical for elucidating their regulatory roles in cellular signaling and post-translational modification. The described PAGE-based isolation method addresses a key bottleneck in early discovery by enabling reproducible production and quantification of these signaling molecules. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in pathways relevant to metabolic regulation, vesicular trafficking, and disease-associated signaling.
This PAGE-based isolation method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and translational research.