Name: 编制质量肌醇Pyrophosphates (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习制备和纯化肌醇焦磷酸IP7的生化实验方法。该方案利用酶促反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，为研究癌症、糖尿病等疾病相关的细胞信号通路提供可靠的实验基础。

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感谢 A. Riccio 对本文提出的宝贵意见以及对稿件的审阅。本工作得到了医学研究理事会（MRC）对细胞生物学单元的资助，以及人类前沿科学计划基金（RGP0048/2009-C）的支持。

1. 酶促反应 - 第1天（下午1小时）
<ol>
	<li>第一步是制备10-20个独立的酶促反应，其中IP6K1或VIP1将IP6转化为焦磷酸化异构体。</li>
	<li>我们使用根据先前报道的方法从E. coli中纯化的His-IP6K1和GST-Vip1酶17,18。</li>
	<li>配制50 μL反应体系，包含1X反应缓冲液（30 mM Hepes pH 6.8、50 mM NaCl、6 mM MgSO4、1 mM DTT）、6 mM磷酸肌酸（PCr）、25 U/mL肌酸磷酸激酶（CPK）、5 mM ATP（Mg盐）、0.3 mM IP6以及0.05–0.1 μg His-IP6K1或GST-Vip1，用MiliQ ddH2O补足体积。</li>
	<li>短暂离心反应管，并在37°C下旋转孵育过夜。</li>
</ol>
2. 聚丙烯酰胺凝胶的制备与上样 - 第2天（下午4小时）
<ol>
	<li>使用24 cm长、18 cm宽的玻璃板和1.5 mm宽的垫片制备聚丙烯酰胺凝胶。通常使用16孔或制备用的单孔梳子。</li>
	<li>配制混合液（每块凝胶50 mL），包含以下成分：35.5% (w/v) 丙烯酰胺:双丙烯酰胺（19:1）、1X Tris/硼酸/EDTA（TBE）、0.05% (w/v) 过硫酸铵（APS）、0.05% (w/v) 四甲基乙二胺（Temed）。将混合液倒入预制的玻璃板之间，插入梳子，并在室温下聚合30–60分钟。</li>
	<li>凝胶聚合完成后，将装置转移至冷室，在1X TBE中以200–300伏电压预电泳约30–60分钟。</li>
	<li>向每个反应体系中加入1X的橙G染料（10 mM Tris-HCl pH 7.0、1 mM EDTA、30%甘油、0.1%橙G）。准备一个含有2 nmol IP6 的样品作为标准对照上样。</li>
	<li>使用注射器和21G针头，用电泳缓冲液彻底冲洗每个加样孔，以去除任何沉淀物，然后上样。避免在两侧的孔中加样。</li>
	<li>以450–550伏电压（每块凝胶7 mAmp）过夜电泳，直至橙G染料条带迁移至凝胶底部最后10 cm范围内。</li>
</ol>
3. IP7 的分离——第3天（4小时）和第4天（6-7小时的SpeedVac干燥过程）
<ol>
	<li>拆卸凝胶装置，小心取下一块玻璃板，使凝胶保留在另一块玻璃板上。从橙色G染料条带上方至底部切下一小部分凝胶，包含IP6 标准品及一个样品泳道，如图1所示。</li>
	<li>用甲苯胺蓝染色液（0.1% (w/v) 甲苯胺蓝，20% (w/v) 甲醇，2% (w/v) 甘油）对切下的凝胶部分染色数分钟（1–3 分钟），直至肌醇焦磷酸条带显现。将先前取下的玻璃板重新盖在凝胶上方，以防止未染色的凝胶干燥。</li>
</ol>
IP7 条带应可见，因其迁移速度略慢于免疫沉淀产物6 标准。ATP 的迁移速度比 IP 快6，也应可见（图1）。将凝胶的染色部分转移至脱色液（20% (w/v) 甲醇）中数分钟，洗去多余的甲苯胺蓝，然后将凝胶与未染色的凝胶重新对齐。
如果需要观察更高磷酸化的肌醇异构体（IP8 和 IP9），请在室温下用甲苯胺蓝染色液染色 20 分钟。随后用脱色液洗涤约 15 分钟，去除甲苯胺蓝染料。
<ol start="3">
	<li>使用剃刀刀片，参照染色凝胶上确定的 IP7 迁移位置（图1），在未染色的凝胶部分切下 IP7 条带。</li>
	<li>将从凝胶上切下的 IP7 条带放入一个 15 mL 离心管中，并加入 10 mL MilliQ ddH2O。将离心管置于旋转仪上，室温旋转 10 分钟。弃去液体以去除多余的 TBE 和微小的丙烯酰胺颗粒。</li>
	<li>随后进行两次脱水-再水化循环。向含有 IP7 凝胶的离心管中加入 5 mL 50% (w/v) 甲醇，室温旋转 2 小时。将凝胶块转移至另一个含有 5 mL MilliQ ddH2O 的新 15 mL 离心管中，室温旋转 2 小时。不要丢弃甲醇和 MilliQ H2O。通过将聚丙烯酰胺凝胶重新转移回先前使用的 15 mL 离心管中，再重复一次脱水-再水化循环。其中一次洗涤可过夜进行。</li>
	<li>为浓缩洗脱的 IP7，使用 60°C 加热的 SpeedVac 将 10 mL 溶液（5 mL MilliQ ddH2O 和 5 mL 50% (w/v) 甲醇）一起干燥。</li>
	<li>当样品接近干燥时，将剩余液体（300–600 μL）转移至一个 1.5 mL 离心管中，以 5000 rpm 离心 2 分钟。</li>
	<li>收集上清液并转移至新的 1.5 mL 离心管中；保留底部 20–30 μL 液体，因其可能含有丙烯酰胺颗粒。</li>
	<li>如有必要，可使用未加热的 SpeedVac 继续干燥。若样品完全干燥，IP7 的回收率将显著降低，因此当样品体积达到 100–300 μL 时应终止干燥过程。</li>
</ol>
4. 确定IP7的浓度和纯度。
<ol>
	<li>取 2–5 μL 回收的 IP7 样品，按照第 2.2–2.5 节的方法在 PAGE 胶上电泳。同时加载多个浓度梯度的 IP6（例如 0.5、1、2、4 nmol）作为浓度标准品，以及 4 nmol 的 Poly-P 标记物。电泳完成后，使用甲苯胺蓝溶液对整块凝胶进行染色和脱色，以显色肌醇焦磷酸异构体，具体操作步骤见第 3.2 节（图 2A）。</li>
	<li>经甲苯胺蓝染色后，可通过扫描凝胶并使用 Image-J 等成像软件比较 IP6 与 IP7 条带的强度差异，从而确定其浓度，如 图 2B 所示。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
IP的制备性酶促转化6 进行免疫沉淀7 使用 IP6K1 和 VIP1 酶可通过 PAGE 分析轻松分辨图1）。IP 的上样6 作为大小对照，与甲苯胺蓝凝胶染色结合，可鉴定焦磷酸化衍生物，因为其在凝胶中的迁移速率较慢，且迁移速度取决于肌醇环上磷酸基团的数量。上述步骤可实现IP的简便纯化7通过PAGE对纯化的肌醇焦磷酸进行分析，结果显示了其IP的纯度7 (图2A）。有趣的是，1/3PP-IP5 IP的异构体7 VIP1 产物的迁移速度略慢于 5PP-IP5 IP的异构体7 由IP生成的6K1. IP 的使用6 标准品可实现对纯化免疫沉淀物浓度的简便定量7 (图2B）。在使用 IP 之前7 为进一步实验，可评估其生物活性 (图35PP-IP5 与 VIP1 及免疫沉淀（IP）孵育7 磷酸酶 DDP1（二磷酸肌醇多磷酸磷酸水解酶）。通常，纯化的 IP7 转化为IP8 由 VIP1 免疫沉淀并进行 IP6 由DDP1（图3).
<img alt="显示ATP与肌醇磷酸盐IP6、IP7分离的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：PAGE凝胶的甲苯胺蓝染色及IP7条带的分离。 含标准品（IP6）的凝胶部分被切下，并用甲苯胺蓝溶液染色。三条条带从上至下分别为IP7、IP6和ATP。将染色后的凝胶部分与剩余凝胶对齐，从而定位含有IP7的凝胶区域，随后可将其切下并进行纯化（虚线框所示）。
<img alt="IP7浓度分析；显示IP6、5PP-IP5、1/3PP-IP5的线性回归图和电泳结果。" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：IP6K1 和 VIP1 反应产物的 PAGE 分析。A) 通过亚甲蓝染色分析 IP6（4、2、1、0.5 nmol），用于确定从 IP6K1（5PP-IP5）和 VIP1（1/3PP-IP5）反应中纯化的 IP7 浓度。B) 散点图分析以确定纯化后的 IP7 浓度。浓度根据条带强度（使用 ImageJ 软件计算）与已知量的 IP6 比较得出。X 轴表示强度，Y 轴表示以 nmol 为单位的浓度。
<img alt="电泳结果；多聚磷酸分析；IP6-IP8检测；DAPI；甲苯胺蓝；凝胶条带比较。" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3：IP7 生物活性分析。 为评估纯化所得 IP7 的质量，我们将 5PP-IP5（由 IP6K1 生成的 IP7）分别与 VIP1 或 IP7 磷酸酶 DDP1 共同孵育，随后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离反应产物。DAPI 和甲苯胺蓝染色结果显示，VIP1 能够催化生成预期的 IP8，而 DDP1 可将 IP7 转化为 IP6。

<ol><li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li>
<li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li>
<li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+structure%2C+enzymology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li>
<li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphosphoinositol+polyphosphates%3A+metabolic+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li>
<li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li>
<li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li>
<li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li>
<li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li>
<li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li>
<li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li>
<li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li>
<li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns%283%2C4%2C5%29P3+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li>
<li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li>
<li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plc1p%2C+Arg82p%2C+and+Kcs1p%2C+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis%2C+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li>
<li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+%28IP6K1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li>
<li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li>
<li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity%3A+analysis+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

由于缺乏商业化供应的化合物以及现有检测方法灵敏度较低，肌醇焦磷酸在生物化学中的应用受到严重限制。结合聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与甲苯胺蓝（图1）可实现对肌醇焦磷酸异构体的简便检测，其中PAGE能够分离具有不同数量磷酸基团的分子，而甲苯胺蓝是一种可与磷酸基团结合的异色性染料，该方法为相关研究开辟了新的途径20。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术纯化由IP6K1或VIP1催化的酶促反应生成的肌醇焦磷酸产物，是一种简单、经济且可靠的方案，可实现大量高纯度IP7的制备。上述方法不仅限于IP7的纯化，通过对接所述方案进行微小调整，亦可用于纯化其他种类的肌醇焦磷酸。使用IP7或不同量的IP6作为底物，可检测到含有超过八个磷酸基团的高磷酸化肌醇焦磷酸异构体20,6。这些肌醇焦磷酸可通过延长染色步骤的时间加以检测，并随后进行纯化（见3.2节）。此外，若以IP5作为酶促反应的底物，则可实现PP-IP5及其他在肌醇环上含有羟基的肌醇焦磷酸的纯化。
总之，这种简便的方法利用广泛可得的仪器即可实现对毫克级肌醇焦磷酸盐的可靠纯化，从而为这一令人兴奋的研究领域开辟了新的途径。

<table><tbody><tr><td>植酸（IP&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8810</td><td></td></tr><tr><td>多聚磷酸盐（六偏磷酸钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8510</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>橙黄G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸（PCr）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>肌酸磷酸激酶（CPK）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>His-Ddp1</td><td>实验室自备</td><td>实验室自备</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺:双丙烯酰胺 19:1（40%）</td><td>Flowgen</td><td>H16972</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Tris/硼酸/EDTA（TBE）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 9060</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>VWR</td><td>43083G</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪（SpeedVac）</td><td>Christ</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>Hoeffer Scientific Instruments</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>真空抽滤装置</td><td>Christ</td><td>Alpha 2-4</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>ABM Greiffenberger</td><td>4EKF63CX</td><td></td></tr></tbody></table>

高质量肌醇焦磷酸盐的制备

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

肌醇在自然界中以未修饰形式或更复杂的磷酸化衍生物形式存在。其中，在真核细胞中含量最丰富的两种衍生物是五磷酸肌醇（IP5）和六磷酸肌醇（植酸或IP6）。IP5和IP6是含一个或多个焦磷酸键的肌醇焦磷酸分子的前体1。IP6的磷酸化可生成二磷酸五磷酸肌醇（IP7或PP-IP5）和双二磷酸四磷酸肌醇（IP8或(PP)2-IP4）。迄今为止，所有已研究的真核生物中均分离出了肌醇焦磷酸。此外，负责肌醇焦磷酸合成的两类不同酶在进化过程中高度保守2-4。
IP6激酶（IP6Ks）具有极强的催化灵活性，可将IP5和IP6分别转化为PP-IP4和IP7，并进一步以这些产物为底物，促进更复杂分子的生成5,6。最近，另一类可生成焦磷酸盐的酶被鉴定出来，即酵母蛋白VIP1（也称为PP-IP5K），该酶能够将IP6转化为IP7和IP87,8。
肌醇焦磷酸盐调控多种不同的细胞过程，如胰岛素分泌9、端粒长度10,11、趋化性12、囊泡运输13、磷酸盐稳态14以及HIV-1 gag释放15。针对这类分子的作用机制已提出两种假说：它们可通过变构方式与特定蛋白质（如AKT16）相互作用从而影响细胞功能；或者，焦磷酸基团可将磷酸基团转移至预先磷酸化的蛋白质上17。然而，由于目前尚无商业来源的肌醇焦磷酸盐，该研究领域巨大的潜力受到限制，许多科研人员因此难以开展对这些分子及这种新型翻译后修饰的研究。现有用于分离肌醇焦磷酸盐的方法需要复杂的色谱设备18,19，且这些方法使用酸性条件，可能导致肌醇焦磷酸盐降解20，从而降低回收率。此外，繁琐的柱后脱盐步骤也限制了这些方法仅能在专业实验室中应用。
本研究描述了一种简便的方法，用于生成、分离和纯化IP6-激酶和PP-IP5-激酶反应的产物。该方法得以实现，得益于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）能够有效分离高度磷酸化的肌醇多磷酸盐20。在以IP6为底物进行IP6K1和PP-IP5K酶促反应后，采用PAGE分离生成的肌醇焦磷酸盐，并随后用水洗脱。

肌醇焦磷酸盐在癌症、糖尿病和肥胖等人类病理过程中发挥着重要作用；然而，其确切的作用机制仍存在争议。由于 commercially available 的肌醇焦磷酸盐缺乏，导致深入研究变得困难。本文介绍一种简单的方法，用于制备和分离毫克级的肌醇焦磷酸盐。

肌醇（Myo-inositol）在自然界中以未修饰形式存在，或以更复杂的磷酸化衍生物形式存在。其中，在真核细胞中含量最丰富的两种磷酸化衍生物是……

本实验的总体目标是生成并纯化高质量的焦磷酸肌苷（nool pyrophosphate）。首先，利用IP六（IP six）作为底物，在IP六激酶（IP six kinase）这一酶的作用下生成IP七（IP seven）。随后，将酶促反应产物上样至聚酰胺凝胶，切下对应于IP七的条带。随后通过连续的脱水-水合循环分离出IP七。该实验步骤的最后一步是确认产物的纯度并测定其浓度。最终，可通过孵育IP七获得显示其生物活性的结果。通过VIP单磷酸激酶和IP七磷酸酶DDP1，这些反应分别生成IP8和IP6。该Met方法可用于研究IP7信号通路，也可应用于其他系统，例如磷酸肌醇类分子如IP8或由IP5衍生的PPIP4。本方案首先准备酶促反应，其中IP六激酶一（IP six kinase one）或VIP一（VIP one）将IP六（IP six）转化为焦磷酸化相关的异构体。在本演示中，组胺标签标记的IP六激酶一（his-tagged IP six kinase one）和GST标签标记的VIP一（GST-tagged VIP one）酶按照先前描述的方法从大肠杆菌（E. coli）中纯化获得。开始时，根据书面方案准备10至20个独立的酶促反应体系，每个体系包含IP六以及his标签标记的IP六激酶一或GST标签标记的VIP一酶。用超纯双蒸水将体积调至 50 微升。短暂离心管子后，将反应物在 37 摄氏度下旋转孵育过夜。使用长 24 厘米、宽 18 厘米的玻璃板，1.5 毫米间隔和 16 个泳道的梳子制备聚丙烯酰胺凝胶装置。接下来，将预先配制的凝胶溶液注入预制的玻璃板之间，每块凝胶使用 50 毫升。插入梳子，并在室温下让凝胶聚合 30 至 60 分钟。凝胶聚合完成后，将装置转移至冷室。用1倍TBE缓冲液，以200至300伏电压预电泳约30至60分钟，同时加入1倍橙G染料。每个反应中，制备含有2摩尔IP六的标准对照样品。预电泳结束后，用运行缓冲液彻底冲洗每个加样孔。使用连接21号针头的注射器去除任何沉淀物。然后将样品加入凝胶中，避免使用凝胶的前两道和最后两道加样孔。最后以每块凝胶7毫安的电流过夜电泳，直至橙色G染料条带迁移至凝胶底部最后10厘米范围内。开始分离IP七时，拆卸凝胶装置并小心取下一块玻璃板，使凝胶保留在另一块板上。从橙色GD条带稍上方至凝胶底部切下一小部分，包含IP六标准品及一个样品泳道。将切下的凝胶部分用甲苯胺蓝染色数分钟，直至出现Anatol焦磷酸盐条带。 同时，将先前取下的玻璃板重新放回凝胶上方，以防止未染色部分的凝胶干燥。将已染色的凝胶部分转移至DES染色液中数分钟，以洗去多余的甲苯胺蓝，然后将凝胶连同未染色部分重新放置。IP七条带应可见，因其迁移速度略慢于IP六标准ATP；而迁移速度比IP六更快的条带也应可见。接下来，使用剃刀刀片切割凝胶未染色区域中 IP7 条带。利用染色凝胶确定的 IP7 迁移位置来估计其条带位置。为估算 IP7 条带的位置，将从凝胶上切下的 IP7 条带放入一个 15 毫升离心管中，并加入 10 毫升 Milli-Q 重蒸水。孵育后，在室温下旋转离心管10分钟，通过倾倒弃去液体，以去除多余的TBE及微小的丙烯酰胺颗粒。随后进行两次脱水-再水化循环：首先向含有IP七胶的离心管中加入5 mL 50%甲醇，在室温下旋转样品2小时。然后将凝胶切片转移至含有5毫升重蒸水的新15毫升离心管中，在室温下旋转孵育2小时。保留含甲醇的离心管，用于后续步骤。重复脱水-水化循环一次，以浓缩洗脱的IP seven。将先前加入的5 mL水和5 mL 50%甲醇混合。使用60°C加热的真空离心浓缩仪干燥混合溶液。当样品接近干燥时，将剩余液体转移至1.5 mL离心管中。将离心管在5,000转/分钟下离心2分钟。收集上清液，保留底部20至30微升，因其可能含有丙烯酰胺颗粒。将样品转移至新的1.5毫升离心管中。如有必要，可使用未加热的真空浓缩仪继续干燥过程。如果样品完全干燥，IP 七的回收率将显著降低。因此，当样品体积减少至 100 至 300 微升时，必须终止干燥过程。回收分离的IP七后，取2至5微升样品加入PAGE胶中，以测定其浓度和纯度。同时加载若干倍稀释的IP六作为浓度标准品，以及4 mol的多聚标记物。电泳完成后，通过亚甲蓝溶液对整个凝胶进行染色和脱色，以显现出初始的焦磷酸化异构体。按照上述刚描述的甲苯胺蓝染色后的步骤，可通过扫描凝胶并比较IP六与IP七之间条带强度的差异来确定浓度。利用Image J等成像软件，可对IP六至IP七的制备性酶促转化进行分析。使用IP六激酶一和VIP一酶的反应产物，可通过PAGE分析轻松分辨。将作为大小对照的 IP 六与甲苯胺蓝凝胶染色共同上样，可实现焦磷酸化衍生物的鉴定。由于其迁移速度较慢，迁移速率取决于初始分子上存在的磷酸基团数量，因此上述方法成功实现了 IP 七的简便纯化。此外，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的正构焦磷酸盐进行分析，证实了 IP 七的纯度。有趣的是，VIP1 生成的 IP7 产物中，其单三焦磷酸-IP5 异构体的迁移速度略慢于 IP6 激酶1 生成的 VIP7 中的五焦磷酸-IP5 异构体。使用 IP6 标准品可方便地对纯化后的 IP7 进行浓度定量，以便在使用 IP7 前确定其浓度。对于后续实验，可进一步评估其生物学活性。五。将五磷酸肌醇（IP5）与FIP1及七磷酸肌醇磷酸酶DDP1常规孵育。纯化的七磷酸肌醇（IP7）可由VIP1转化为八磷酸肌醇（IP8），或由DDP1转化为六磷酸肌醇（IP6）。通过此流程后，可进一步采用其他方法，如延长的托林蓝染色，以回答更多问题，例如八磷酸肌醇（IP8）或其他磷酸化肌醇异构体的分离。

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科研

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生物学

编制质量肌醇Pyrophosphates

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高质量肌醇焦磷酸盐的制备

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