使用纳米流体芯片进行基于芯片的数字PCR检测稀有转录变体

基于芯片的数字PCR技术将单个反应分配到纳米流体芯片的各个反应室中。对分区后的序列进行扩增，可实现对稀有转录本变异体的检测——即低频出现的非经典转录本。

首先，取一个含有目标稀有转录本变体和常见变体的cDNA样本。加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs和引物的溶液。

加入针对常见和罕见转录本变体的特异性寡核苷酸探针——这些探针标记有不同的荧光报告分子和淬灭分子。当淬灭分子与报告分子紧密相邻时，会吸收报告分子的荧光信号。

将混合物加载到纳米流体芯片上。溶液被分割成大小均匀的纳米腔室。每个含有cDNA的腔室作为一个独立的反应容器。

启动热循环过程。高温变性使双链DNA解离为单链。降低温度，使引物和寡核苷酸探针与单链DNA上的互补区域退火结合。

升高温度以进入延伸步骤，此时DNA聚合酶延伸引物并切割探针。报告基团与淬灭基团之间的距离增加，使报告基团的荧光得以发射。读取荧光信号。

创建一个散点图，显示含有扩增的稀有转录本靶标的微腔室以及不含该靶标的微腔室。靶标的阳性信号表明样本中存在该稀有转录本变异体。

首先，将预混液和检测试剂在室温下解冻至少20分钟。然后，将cDNA样品以每管6微升分装至0.5毫升离心管中。同时，设置一个无模板对照管。接着，轻轻涡旋混匀预混液，并将8.7微升分装至每根无菌离心管中用于各反应体系。

然后，每份反应体系中加入 0.87 µL 的定制检测引物，并加入 1.83 µL 无核酸酶水。轻轻混匀后，取 11.4 µL 加入各含有 cDNA 的离心管中，以及无模板对照管中。随后轻轻混匀各管，并通过瞬时离心汇集管内液体。为获得最佳结果，应尽快加载芯片。

插入芯片加载器，并等待指示灯变为绿色。然后，通过轻轻拉动浸液注射器的活塞至1到2毫米处，取下帽盖，装上针头。

接下来，注意记录新芯片盖子上标注的代码，然后小心地从侧面捏住盖子，撕去保护膜，并将盖子粘性面向上放置于盖子卡槽中。现在，压下杠杆以打开夹具，然后小心地将芯片装入芯片卡槽中。

接下来，将新的上样刀片放入加载器中。轻轻推动，确保其牢固就位。现在，将 14.5 µL 反应混合液转移至加载刀片上。注意不要产生气泡，也不要使刀片发生偏转。然后，按下黑色的 “Loading” 按钮，将液体分配至芯片上。

务必确认加样刀片已安装到位。在向刀片中加样时，切勿将移液器按压至第二档，以免引入气泡。同时，移液枪头不要触碰刀片造成偏转。

使用注射器将约20滴浸油转移至芯片表面。注意勿使针头接触表面，确保完全覆盖芯片表面但不溢出。接着，旋转转子臂使盖子与芯片接触，并向下按压15秒。然后按下盖子按钮释放芯片，将加载臂恢复至静止位置。现在打开夹具，将组装好的芯片保持45度角，通过填充口小心地排出浸油。 通过 注射器。然后，轻微旋转芯片以去除气泡，再用无菌擦拭纸除去多余的液体。

避免将浸油溅到尖端边缘。如果发生此情况，应在封片前小心去除多余的浸油。

最后，轻轻撕去盖子上的标签，封闭加样孔至少5秒钟，以密封芯片外壳。现在，应在两小时内使用该芯片，在此之前将其避光保存。

设置反应时，打开盖子并在两个模块上安装适配器，即使仅使用一个模块也是如此。然后将芯片放置在样品模块上，使其加样口朝向PCR仪前方，并略微抬高加样口。使用空芯片来平衡两个模块。

接下来，将导热垫放置在装置上方，完全覆盖芯片。然后设定循环程序，盖上盖子，开始反应。

反应结束后，关闭热循环仪，取下导热垫，然后取出芯片。将芯片置于避光环境中，静置至少10分钟，使其升至室温，并在1小时内完成分析。使用异丙醇清洁芯片表面，同时检查是否存在泄漏或其他问题。

为保存数据，请将U盘插入检测系统以存储数据。然后打开检测系统的芯片托盘，将芯片正面朝上放入。关闭托盘并等待30秒，以便系统处理数据。随后取出芯片，并对下一张芯片重复上述步骤。

接下来，将U盘从检测器移至计算机，并传输文件。打开基于云的软件，创建一个项目并导入所有目标芯片的数据文件。然后，在“已定义芯片”选项卡下，选择所使用的染料和检测方法。在“数据审查”选项卡中查看芯片图像，以确定芯片是否合格。如果样品加样良好，至少应有13,000个数据点可用。

接下来，查看所选芯片的散点图。在此应用由检测类型定义的阈值。对于荧光素氨基修饰报告染料信号，使用 6,000 的阈值。现在，去除可能导致假阳性的可疑信号。使用 “套索” 工具在散点图上选择可疑斑点，并选择 “未确定” 选项。

所有其余的阳性斑点均表明所分析的稀有靶标cDNA拷贝的存在。