Name: 液滴数字 TRAP (ddTRAP): 对端粒重复放大协议的适应性, 以实现液滴数字聚合酶链反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 了解液滴数字TRAP（ddTRAP）技术，用于高灵敏度定量检测人体细胞中的端粒酶活性。该方法支持每轮96个样本的中通量分析，可同时进行对照和重复实验，实现可靠的统计学评估，为细胞衰老和癌症研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）（NCI-R00-CA197672-01A1）提供的经费支持。小细胞肺癌细胞系（SHP77 和 H82）由德克萨斯大学西南医学中心的 John Minna 博士和 Adi Gazdar 博士慷慨惠赠。

1. 缓冲液的制备与保存
<ol>
	<li>配制 50 mL 1x 去RNase/DNase的NP-40裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0]，1 mM MgCl₂，1% NP-40，0.5% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]丙磺酸，10% 甘油，5 mM 2-巯基乙醇，1× 蛋白酶抑制剂混合物）2，1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），1% [体积/体积] NP-40，10% [体积/体积] 甘油，150 mM NaCl，5 mM &#946;-巯基乙醇和0.1 mM 4-苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF））。该缓冲液可分装后于-20℃保存 &#176;C 以备将来使用。为获得最佳的细胞裂解效果，应避免反复冻融。</li>
	<li>配制 50 mL 10 倍浓缩的无 RNase/DNase TRAP 延伸缓冲液（200 mM Tris-HCl [pH 8.0]，15 mM MgCl₂，630 mM KCl，10 mM EGTA，50 mM DTT，5% CHAPS）2，630 mM KCl，0.5% [体积/体积] Tween 20，以及10 mM 乙二醇双(&#946;-氨基乙基醚-N,N,N&#8242;，N&#8242;四乙酸（EGTA））。该缓冲液可分装为每份1 mL，于-20℃保存。 &#176;C 以供将来使用。</li>
</ol>
2. 细胞裂解
<ol>
	<li>细胞的制备
	<ol>
		<li>解冻一份冷冻的NP-40裂解缓冲液。解冻后，将裂解缓冲液置于冰上。向NP-40裂解缓冲液中加入苯甲基磺酰氟（PMSF蛋白酶抑制剂），使其终浓度达到0.2 mM。 
		注意：应在裂解细胞前立即进行此步骤。</li>
		<li>从收集的细胞沉淀中去除多余的液体，以确保细胞沉淀干燥。注意，无论是 freshly collected 还是 previously frozen (-80 &#176;C 或在液氮中速冻2），不得含有先前离心步骤中残留的任何溶液，因为这些溶液可能会干扰后续实验操作。</li>
		<li>培养、收集并冻存端粒酶阳性与端粒酶阴性细胞系（BJ成纤维细胞、IMR-90或U2OS），用作阳性和阴性对照。每次进行实验时均应使用新鲜的对照裂解物，以确保实验的可重复性。 
		注意：建议在冷冻前大量培养端粒酶阴性细胞并进行分装，以消除细胞系长期培养过程中可能引入的组织培养相关干扰因素，从而确保阴性对照样本结果的可重复性。</li>
		<li>将细胞沉淀置于冰上。如果细胞 previously 经冷冻，请在冰上短暂解冻。 
		注意：ddTRAP 实验中典型的细胞沉淀量为 500,000 至 1,000,000 个细胞。必要时也可使用较小的细胞沉淀，但必须/最好已知细胞数量。ddTRAP 也可根据蛋白投入量进行，通过 BCA 蛋白测定法确定投入量（通常为 1 &#181;g).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>在NP-40裂解缓冲液中裂解细胞，保持每微升25,000个细胞的等效浓度&#181;微升缓冲液中。例如，将含有1,000,000个细胞的沉淀物溶于40 &#181;NP-40裂解缓冲液L。轻柔吹打裂解液上下混合，以充分裂解细胞。尽量避免产生气泡。</li>
		<li>将细胞置于冰上裂解30分钟。为防止细胞碎片聚集成团，需轻轻涡旋混匀裂解液，每隔10分钟操作一次，以保持裂解液的均匀混合状态。</li>
		<li>稀释细胞裂解物（25,000 个细胞/μL）&#181;L) 用NP-40裂解缓冲液按1:20稀释，使新的细胞当量为1,250个细胞/μL&#181;例如，稀释 5 &#181;L 细胞裂解液加入 95 &#181;L 裂解缓冲液</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 端粒酶延伸反应
<ol>
	<li>准备端粒酶延伸反应的预混液（每反应体系）（表1）。 
	注意：建议在细胞裂解过程中配制延伸反应预混液，并将其置于冰上保存。
	<ol>
		<li>将48 µL延伸反应预混液移入每个PCR管中。</li>
		<li>向延伸反应体系中加入2 µL稀释后的裂解液（1,250个细胞/µL）。此时总体积应为50 µL，最终细胞浓度相当于50个细胞/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行端粒酶延伸反应（表2）。</li>
	<li>延伸产物可在4 °C保存3–5天；但建议在24小时内使用，以获得最佳效果。</li>
</ol>
4. 微滴数字PCR设置
<ol>
	<li>准备ddTRAP的主混合液（每反应体系，见表3）。 
	注意：试剂恢复至室温后，请勿将其或主混合液置于冰上。将混合液置于冰上可能会增加黏度，导致液滴形成不良。ddPCR超级混合液中的DNA聚合酶为热启动型，可在室温下保持稳定。ddPCR超级混合液在从-20 °C初次解冻后可保存于4 °C。
	<ol>
		<li>向每个PCR管中加入19.8 µL ddPCR主混合液。</li>
		<li>向每管中加入2.2 µL延伸反应产物。注意此时总体积应为22 µL。 
		注意：进行ddTRAP检测所需的样品总量为20 µL（相当于100个细胞）。额外体积是为了防止移液误差或样品损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置液滴生成卡盒。 
	注意：卡盒包含三个标有标签的不同列孔。
	<ol>
		<li>将根据步骤4.1.2制备的20 µL反应液加入卡盒的样品孔（中间孔）中。移液时避免产生气泡。 
		注意：若出现气泡，可轻轻敲击卡盒侧面，使气泡上升至溶液表面。</li>
		<li>向油孔（左侧孔）中加入70 µL液滴生成油。 
		注意：为避免污染，务必使用独立的移液器和吸头进行ddPCR液滴生成步骤。加样顺序至关重要：必须先加入样品再加入油，因为油密度较大，若先加油会填充微流控腔室，导致液滴生成不佳。最少可运行8个样品。卡盒的所有孔都必须加样，任何空孔都会导致液滴生成仪停止生成液滴。若样品数量不足以填满卡盒中的全部8个孔，可在剩余孔中加入20 µL ddTRAP主混合液（步骤4.1）。</li>
		<li>通过将垫圈固定在卡盒两端，确保其位置正确。 
		注意：若未安装垫圈或安装不当，将导致仪器无法生成液滴。</li>
		<li>将装载并组装好的卡盒放入液滴生成仪中。 
		注意：卡盒通过仪器内的磁铁识别，当卡盒放置正确时，仪器会提示用户。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>待液滴生成完成且程序结束（约60–90秒）后，取出卡盒。
	<ol>
		<li>小心地从卡盒上取下垫圈。使用多通道移液器将新生成的液滴（右侧孔）转移至96孔PCR板中。 
		注意：新生成的液滴乳液体积约为40–43 µL。</li>
		<li>当所有样品均加入96孔板后，立即使用铝箔PCR板封膜进行热封，以防止PCR过程中发生蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将96孔板放入热循环仪，并执行以下PCR反应（见表4）。 
	注意：各温度步骤之间的升温速率必须设置为2.5 °C/s，以确保反应体系充分受热。</li>
</ol>
5. 端粒酶延伸产物的检测
<ol>
	<li>将96孔板放入液滴读取仪中。 
	注意：确保正确放置孔板，使A1样本与支架上的位置对应。
	<ol>
		<li>打开液滴读取仪配套的软件。双击第一个孔A1，打开样本/孔编辑界面。</li>
		<li>点击Experiment，然后从下拉菜单中选择ABS。 
		注意：Experiment用于定义所使用的检测类型（即绝对定量或基因拷贝数检测）。ABS代表绝对定量。</li>
		<li>选择QX200 ddPCR Evagreen Supermix，以确保读取仪采用正确的检测方法。点击孔编辑界面右下角的Apply，将用户定义的设置保存至所有高亮显示的孔中。 
		注意：SUPERMIX用于定义读取仪将识别的PCR混合液类型及检测化学体系。</li>
		<li>在软件的孔编辑界面中点击TARGET，以定义样本。</li>
		<li>通过点击TARGET下拉菜单并选择unknown、reference或NTC（无模板对照），来定义样本的TYPE。 
		注意：Unknown指实验样本，reference可为已知端粒酶活性的对照样本，而NTC是判断检测有效性（如污染和背景信号）的关键对照。</li>
		<li>在Sample Name部分为所有样本命名，并点击Apply，以确保高亮孔被正确编辑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击Run以运行/读取孔板。当系统提示时，在RUN OPTIONS界面中选择Columns或Rows，以告知仪器应按何种方向读取孔板。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>通过单击各个孔来确定每个样本的“已接受液滴”数量。双击各个孔或列/行标题以查看和分析样本数据。 
	注意：判断是否继续分析某个样本的最重要标准是“已接受液滴”的数量。对于 ddTRAP，若样本的已接受液滴数达到 10,000 或以上，则可用于进一步分析。系统可向用户提供多种格式的数据，包括 .csv 表格、.jpg 图像、直方图等。目前已有多种资源可用于深入分析 ddPCR 数据，包括 ddTRAP11,13。这些资源提供了分析 ddTRAP 数据的指南，涵盖阈值设定11,13、选择用于进一步分析的样本11,13、识别假阳性与假阴性结果13以及常规故障排查13等内容。</li>
	<li>高亮显示代表样本重复孔及无模板对照（NTC）样本的孔。将样本与 NTC 或阴性对照组（如步骤 2.1.2 中列出的 BJ 细胞）进行比较分析。
	<ol>
		<li>通过点击屏幕左下角的“设置阈值”图标，手动为样本设置阈值。可为单个孔设置阈值，也可同时为多个孔设置阈值（推荐做法）。 
		注意：若在 NTC 中检测到背景信号，可将其从所有其他样本中扣除，以“归一化”信号，确保仅分析真实的阳性信号。在 NP-40 裂解缓冲体系中，NTC 的典型值范围为 0.2–1 分子/µL。其他缓冲体系及组分需另行测试（例如 CHAPS 缓冲液）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li>
<li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li>
<li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+telomeres+solve+the+end-protection+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li>
<li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li>
<li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression%3A+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+%28TPE-OLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li>
<li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+position+effect%3A+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Development%22%5BJournal%5D)">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li>
<li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+and+immortalization%3A+role+of+telomeres+and+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li>
<li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li>
<li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104(2014).</li>
<li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28%2B+T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785(2017).</li>
<li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddTRAP%3A+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

端粒酶活性的测定对于众多研究领域至关重要，包括但不限于癌症、端粒生物学、衰老、再生医学以及基于结构的药物设计。即使在癌细胞中，端粒酶核糖核蛋白复合物（telomerase RNPs）的丰度也很低，这使得该酶的检测与研究具有挑战性。本文中，我们详细描述了新开发的数字液滴式TRAP（ddTRAP）检测技术的逐步操作流程，以可靠地定量细胞中的端粒酶活性。通过将传统的端粒酶延伸反应与数字液滴PCR（ddPCR）相结合，我们能够在肺癌细胞中定量检测端粒酶活性（即端粒酶延伸产物）。
ddTRAP 检测基于与 TRAP 检测相同的原理。通过在非离子型去污剂（NP-40）裂解缓冲液中裂解细胞获得细胞裂解物，以保持端粒酶活性，随后用于对“TS”底物/引物进行端粒酶延伸反应。ddTRAP 的创新之处在于 PCR 前形成微滴。将样本分割成微滴可实现对每个细胞中端粒酶活性的绝对定量。
使用数字液滴式TRAP（ddTRAP）检测了肺癌细胞系中的端粒酶活性。基于凝胶的TRAP检测方法的一个主要局限性是单次可处理的样本数量。大多数凝胶梳子最多只能容纳20个...

端粒是位于线性染色体末端的动态DNA-蛋白质复合物。人类端粒由一系列5'-TTAGGGn六核苷酸重复序列组成，其长度在出生时约为12–15千碱基（kb）1。人类端粒酶是一种维持端粒结构的核糖核蛋白酶，最初在HeLa细胞裂解液（癌细胞系）中被发现2。端粒与端粒酶共同在基因组保护、基因调控以及癌细胞永生化等多种生物学过程中发挥重要作用3,4,5,6。
人类端粒酶主要由两个关键组分构成，即端粒酶逆转录酶和端粒酶RNA（分别为hTERT和hTERC）。其中，蛋白质亚基hTERT是端粒酶中具有催化活性的逆转录酶组分。RNA模板hTERC则为端粒酶提供模板，用于延伸和/或维持端粒。大多数人类体细胞中无法检测到端粒酶活性。由于DNA聚合酶无法延伸DNA滞后链的末端，加之缺乏端粒酶，导致每次细胞分裂后端粒逐渐缩短。这些现象使得大多数体细胞的端粒持续缩短，直至达到临界长度，细胞由此进入复制性衰老状态。细胞可分裂的最大次数由其端粒长度决定，这种对持续分裂的阻断被认为可防止向肿瘤发生发展7。癌细胞能够克服端粒诱导的复制性衰老，通过利用端粒酶维持其端粒长度而持续增殖。大约90%的癌症会激活端粒酶，因此端粒酶活性在癌症的检测与治疗中具有至关重要的意义。
20世纪90年代TRAP检测技术的发展对于鉴定端粒酶所必需的组分，以及在多种正常和癌变细胞与组织中测量端粒酶活性起到了关键作用。最初的基于凝胶的PCR检测方法采用放射性标记的DNA底物来检测端粒酶活性。2006年，该检测被改进为使用荧光标记底物的非放射性形式8,9。通过使用荧光标记的底物，用户可通过将凝胶暴露于适当的激发波长下，观察到端粒酶延伸产物在凝胶上呈现的条带。TRAP检测具有较高的灵敏度，并可在粗制细胞裂解液中检测端粒酶活性，因此成为目前应用最广泛的端粒酶活性检测方法。然而，TRAP检测也存在局限性。该方法依赖凝胶电泳，使得在中高通量研究中难以完成必要的重复实验，因而很少能实现适当的统计学分析。此外，由于无法可靠检测样品间小于两倍的端粒酶活性差异，基于凝胶的检测方法难以进行准确的定量分析。克服上述两项局限性，对于将TRAP等酶活性检测技术应用于临床或工业环境——例如在患者样本分析或药物设计研究中检测端粒酶活性——至关重要。
数字PCR最初于1999年开发，旨在将PCR的指数级模拟特性转化为线性数字化检测方法10。微滴数字PCR（ddPCR）是原始数字PCR技术的最新发展。随着先进微流控技术和水包油乳液化学的进步，能够稳定生成大小均一的微滴，从而实现了ddPCR。与基于凝胶的方法甚至定量PCR（qPCR）不同，ddPCR可对输入材料进行绝对定量。ddPCR的关键在于通过将样品分割成微滴，生成约20,000个独立的反应。在终点PCR完成后，微滴读取仪以类似流式细胞仪的方式逐个扫描每个微滴，计数、测量大小，并记录每个微滴中荧光的有无（即每个微滴中是否存在PCR扩增子）。随后，利用泊松分布，根据阳性微滴数与总微滴数的比例估算输入分子的数量。该数值代表了每个PCR反应中输入分子数量的估计值。此外，ddPCR在96孔板上进行并完成分析，使用户能够同时运行多个样本，并进行生物学重复和技术重复，以实现适当的统计分析。因此，我们将ddPCR强大的定量能力与中等通量特性相结合，并与TRAP检测技术整合，开发出ddTRAP检测方法11。该检测方法旨在帮助用户研究并稳健地定量来自生物样本的端粒酶绝对活性11,12。ddTRAP的高灵敏度使其能够从数量有限且珍贵的样本中定量端粒酶活性，包括单细胞水平的测量。此外，用户还可利用该方法以绝对定量方式研究端粒酶调控和/或药物处理的影响，检测小于两倍的变化（约50%的差异）。ddTRAP是TRAP检测技术顺应现代实验室实验和临床环境中数字化与高通量需求的自然演进。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>无RNA酶/DNA酶</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td>无RNA酶/DNA酶</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td>无RNA酶/DNA酶</td></tr><tr><td>Surfact- Amps NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>100% 超纯甘油</td><td>Invitrogen</td><td>15514011</td><td>无RNA酶/DNA酶</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>粉末</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>516732</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水（Nuclease Free H20）</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>无RNA酶/DNA酶</td></tr><tr><td>2.5 mM dNTP 混合液</td><td>Thermo Scientific</td><td>R72501</td><td>每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5 mM</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td>无RNA酶/DNA酶</td></tr><tr><td>100% Tween-20</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>50-255-956</td><td>无RNA酶/DNA酶</td></tr><tr><td>端粒酶底物（TS）引物</td><td>Integrated DNA Technology (IDT)</td><td>定制引物（HPLC纯化）</td><td>5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'</td></tr><tr><td>ACX（反向）引物</td><td>Integrated DNA Technology (IDT)</td><td>定制引物（HPLC纯化）</td><td>5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'</td></tr><tr><td>薄壁（250 µl）PCR级管</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>条板、板、管等</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>Twin-Tec 96孔板</td><td>Fisher</td><td>Eppendorf 951020362</td><td></td></tr><tr><td>可穿刺铝箔热封膜</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>液滴生成器芯片（DG8）</td><td>Bio Rad</td><td>1863008</td><td></td></tr><tr><td>液滴生成油</td><td>Bio Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>液滴生成器垫圈</td><td>Bio Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>96孔热循环仪 T100</td><td>Bio Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜机</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 液滴读取仪及Quantasoft软件</td><td>Bio Rad</td><td>1864001 和 1864003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR液滴读取仪用油</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶滤芯吸头</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10 µl、20 µl、200 µl 和 1000 µl</td></tr></tbody></table>

液滴数字trap（ddtrap）：端粒重复扩增实验方案在液滴数字聚合酶链式反应中的应用

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

端粒重复扩增程序（TRAP）是检测特定样本中端粒酶活性最常用的实验方法。这种基于聚合酶链式反应（PCR）的方法能够对大多数细胞裂解液中的酶活性进行可靠的测定。传统的基于凝胶的TRAP方法使用荧光标记引物，限制了样本通量，且仅能检测酶活性两倍或更大的变化。而液滴数字TRAP（ddTRAP）是一种高灵敏度的方法，由传统TRAP assay改进而来，使用户能够在单次运行中对96个样本进行稳健分析，并实现对每个PCR反应中DNA（即端粒酶延伸产物）输入量的绝对定量。因此，新开发的ddTRAP assay克服了传统凝胶基TRAP assay的局限性，在实验室和临床环境中提供了更高效、更准确和更定量的端粒酶活性检测手段。

使用ddTRAP，在以下细胞系组成的细胞面板中检测了端粒酶活性（图1）：非小细胞肺癌（H2882、H1299、Calu6、H920、A549 和 H2887）、小细胞肺癌（H82 和 SHP77）以及端粒酶阴性的成纤维细胞（BJ）。将一百万个细胞的沉淀用NP-40裂解缓冲液裂解后，以生物学三复孔进行端粒酶延伸反应。一个常用且强烈推荐的阴性对照是“NTC”（无模板对照）。该样本通过向端粒酶延伸反应体系中加入NP-40裂解缓冲液（2 µL），并以与其他含实际细胞裂解液的样本相同的方式处理延伸产物而获得。此样本可帮助使用者扣除背景信号（如有），从而更准确地定量端粒酶活性。尽管本图未显示，另一种阴性对照方法是在端粒酶延伸反应前将细胞裂解液在95°C加热失活5分钟。若细胞或样本量充足，建议优先采用此阴性对照方法。
通过测量液滴乳液中每个液滴的荧光强度，液滴读取仪可利用泊松分布估算输入分子的浓度（分子/微...

我们成功将标准的端粒重复扩增方案（TRAP）检测改造为可用于微滴数字聚合酶链式反应。这种新检测方法称为ddTRAP，具有更高的灵敏度和定量能力，可更有效地检测多种人类细胞中的端粒酶活性，并进行更可靠的统计分析。

液滴数字TRAP（ddTRAP）：端粒重复扩增实验方案在液滴数字聚合酶链式反应中的应用

端粒重复扩增程序（TRAP）是检测特定样本中端粒酶活性最常用的实验方法。聚合酶链式反应……

ddTRAP 检测法能够灵敏、稳健且高度定量地测量细胞中端粒酶的酶活性。该方法可在中等通量模式下每轮运行多达 96 个样本，具有显著优势。我们可同时运行对照和重复样本，从而对所收集的数据进行适当的统计学分析。在细胞裂解前立即解冻一份冷冻的NP-40裂解缓冲液。待完全解冻后，将裂解缓冲液置于冰上。向NP-40裂解缓冲液中加入PMSF蛋白酶抑制剂，使其终浓度达到0.2毫摩尔。然后，向含有细胞沉淀的离心管中加入 40 微升裂解缓冲液，使细胞浓度达到每微升 25,000 个细胞。轻轻吹打裂解液上下混合，以充分裂解细胞。尽量避免产生气泡。将细胞置于冰上裂解30分钟。每10分钟轻轻涡旋裂解液一次，以防止细胞碎片聚集成团。在细胞裂解过程中，于微量离心管中配制端粒酶延伸反应的预混液，并置于冰上保存。细胞裂解后，将48微升延伸反应主混合液加入每个PCR管中。向每个PCR管中加入2微升稀释后的裂解液，使最终细胞浓度达到每微升50个细胞，然后按照论文所述继续进行端粒酶延伸反应。在微量离心管中为ddTRAP反应配制主混合液，并将其置于室温下保存。将19.8微升ddPCR主混合液移液至每个PCR管中。向每管中加入2.2微升上一步延伸反应溶液，最终总体积为22微升。设置液滴生成卡盒时，首先将20微升已制备的溶液加入卡盒中间的样品孔中。轻轻敲击 cartridge 侧面，使溶液中的任何气泡移动到顶部。在加载油之前，必须先向 cartridge 的所有孔中加入样品。然后，向左侧油孔中加入 70 微升的液滴生成油。通过将垫圈固定在芯片的两端来将其固定到位，并将装载并组装好的芯片放入液滴生成仪中。当芯片正确放置后，生成仪会显示稳定的绿灯以示提示。60 至 90 秒后，当生成仪的指示灯停止闪烁时，表示循环已完成。现在移除卡盒。轻轻将垫圈从卡盒上取下。使用多通道移液器从右侧孔中吸取约40微升新生成的液滴，转移至96孔PCR板中。将所有样品加入96孔板后，使用铝箔PCR板密封膜对板进行热封，以防止蒸发。然后，将96孔板放入热循环仪中进行PCR反应。开始时，将96孔板装入液滴读取仪中。正确放置样品板，使 A1 样品与支架上的位置相对应。打开与液滴读取仪配套的软件。双击第一个孔 A01，以打开样品孔编辑界面。点击“实验”，然后从下拉菜单中选择要使用的检测类型。选择 QX200 ddPCR EvaGreen Supermix 作为正确的检测方法。点击井板编辑器屏幕右下角的“应用”，以将用户自定义设置保存到所有已选中的孔中。接下来，在孔板编辑界面中点击“靶标”（Target），然后点击靶标下拉菜单，选择未知样本（unknown）、参考样本（reference）或无模板对照（no-template control），以定义样本类型。在样本名称（Sample Name）部分，为所有样本标注名称，然后点击应用（Apply）。最后点击运行（Run）以读取酶标板数据。在运行选项界面中，当提示选择读取方向时，选择“列”或“行”，以指定微孔板的读取方向。通过双击各个孔或列与行的标题，获取信息表格，以确定每个样本的可接受液滴数量。对于ddTRAP实验，每个样本中可接受液滴数达到10,000个或以上时，方可用于后续分析。标记代表样本重复孔和NTC样本的孔位。通过点击屏幕左下角的阈值设置图标，手动为样本设置阈值。在本实验方案中，端粒酶活性在包含九种肺癌细胞系和端粒酶阴性成纤维细胞的细胞系面板中进行测定。对于SHP77、H2887和NTC的三个生物学重复样本，均将阈值设定在约2,000荧光强度。阳性液滴的荧光强度约为6,000荧光强度单位，在图中形成位于上方的清晰群体，而阴性液滴的荧光强度约为1,100荧光强度单位，与之明显分离。各样本每细胞当量的总端粒酶延伸产物数量通过测定核酸浓度进行估算，该浓度代表了肺癌细胞系中的端粒酶活性。在裂解或延伸反应步骤中，任何RNase污染都会破坏端粒酶的酶活性，因为端粒酶是一种核糖核蛋白复合物。可对细胞中hTERT mRNA的表达水平在ddTRAP之后进行ddPCR检测。这两组数据使我们能够将hTERT的表达与端粒酶活性相关联，并进一步深入研究潜在的端粒酶调控机制，例如选择性剪接。我们可以探索对特定剪接因子进行干预及其对端粒酶活性的影响。目前，我们正在设计靶向端粒酶活性的寡核苷酸剪接调节剂作为潜在药物。

droplet-digital-trap-ddtrap-adaptation-telomere-repeat-amplification

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

液滴数字 TRAP (ddTRAP): 对端粒重复放大协议的适应性, 以实现液滴数字聚合酶链反应

在本视频中，我们介绍了一种逐步生成乳化纳米液滴的实验方法，用于通过数字聚合酶链式反应（dPCR）检测目标核酸。...

微滴数字聚合酶链式反应：一种生成纳米微滴PCR反应以检测稀有肿瘤突变的方法

本视频展示了数字滴液聚合酶链式反应在鉴定DNA样本中插入缺失突变（indel突变）中的作用。ddPCR具有高精度和高灵敏度，能够准确且一致地检测样本中罕见的突变，即使其含量极低也能识别。该技术可鉴定并定量基因组不同区域中的插入缺失突变，为突变机制及其功能影响提供重要见解。...

用于靶基因中插入缺失突变检测的数字滴定聚合酶链式反应

在本视频中，我们演示双通道数字PCR（ddPCR）技术——这是传统PCR技术的一种改进方法，可用于同时检测两种不同的遗传标志物。单个PCR反应被分割成纳升级大小的乳化液滴，每个液滴独立进行扩增，通过检测部分液滴中不同颜色的荧光扩增信号，计算出目标序列的初始浓度。...

双重数字PCR同时定量双基因标志物

本研究提供了一种用于制备基于液滴的微流控平台的方法，并应用聚丙烯酰胺微球进行微球-PCR扩增。微球-PCR方法能够在无需分离双链DNA的情况下获得单链DNA扩增产物。...

基于液滴的微流控方法与微球PCR扩增用于单链DNA扩增子

本文介绍一种利用液滴式数字PCR（drop-off...

单液滴数字聚合酶链式反应用于热点区域突变的全面同步检测

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

通过定量DNA甲基化模式，表观遗传标记可用于白细胞（WBC）亚型分型。本方案介绍了一种基于热塑性弹性体（TPE）微流控装置的多重液滴聚合酶链式反应（mdPCR）方法，用于生成液滴，从而实现对白细胞分类计数中甲基化特异性靶标的精确定量和多重检测。...

使用聚合物微滴生成装置进行甲基化特异性多重微滴PCR用于血液学诊断

油包水液滴检测在分析化学、酶进化和单细胞分析中具有重要应用价值，但通常需要微流控技术来生成液滴。本文中，我们描述了一种基于颗粒模板的乳化方法，这是一种无需微流控设备即可进行液滴检测的技术。...

颗粒模板乳化实现无需微流控的液滴分析

本工作总结了使用双色数字PCR（ddPCR）系统开发不同SARS-CoV-2检测方法的步骤。这些步骤详尽，并包含了如何改进检测方法和实验性能的说明。这些检测方法可用于多种SARS-CoV-2逆转录-数字PCR（RT-ddPCR）应用。...

用于SARS-CoV-2检测与定量的两步法逆转录微滴数字PCR方案

本文介绍了一种用于建立和验证良好实验室规范的方案，通过数字液滴式聚合酶链式反应法对人体泪液中的腺相关病毒载体进行合规性检测，以支持基因治疗载体的临床开发。...

一种可验证的微滴数字聚合酶链式反应检测方法用于腺相关病毒载体在泪液生物脱落研究中的检测

本研究介绍了一种利用多孔膜插入物分离轴突mRNA的稳健方法，可实现全神经元与神经突起的分离及RNA纯化。结合RTddPCR技术，该方法能够对低拷贝转录本进行绝对定量，以高灵敏度、高重复性和广泛的实验适用性促进mRNA运输和局部翻译的研究。...

使用多孔膜插入物和RTddPCR分离与定量轴突mRNA

了解液滴数字TRAP（ddTRAP）技术，用于高灵敏度定量检测人体细胞中的端粒酶活性。该方法支持每轮96个样本的中通量分析，可同时进行对照和重复实验，实现可靠的统计学评估，为细胞衰老和癌症研究提供重要工具。

液滴数字TRAP（ddTRAP）：端粒重复扩增实验方案在液滴数字聚合酶链式反应中的应用

探索更多视频