液滴数字TRAP（ddTRAP）：端粒重复扩增实验方案在液滴数字聚合酶链式反应中的应用

ddTRAP 检测法能够灵敏、稳健且高度定量地测量细胞中端粒酶的酶活性。该方法可在中等通量模式下每轮运行多达 96 个样本，具有显著优势。我们可同时运行对照和重复样本，从而对所收集的数据进行适当的统计学分析。

在细胞裂解前立即解冻一份冷冻的NP-40裂解缓冲液。待完全解冻后，将裂解缓冲液置于冰上。向NP-40裂解缓冲液中加入PMSF蛋白酶抑制剂，使其终浓度达到0.2毫摩尔。

然后，向含有细胞沉淀的离心管中加入 40 微升裂解缓冲液，使细胞浓度达到每微升 25,000 个细胞。轻轻吹打裂解液上下混合，以充分裂解细胞。尽量避免产生气泡。

将细胞置于冰上裂解30分钟。每10分钟轻轻涡旋裂解液一次，以防止细胞碎片聚集成团。在细胞裂解过程中，于微量离心管中配制端粒酶延伸反应的预混液，并置于冰上保存。

细胞裂解后，将48微升延伸反应主混合液加入每个PCR管中。向每个PCR管中加入2微升稀释后的裂解液，使最终细胞浓度达到每微升50个细胞，然后按照论文所述继续进行端粒酶延伸反应。在微量离心管中为ddTRAP反应配制主混合液，并将其置于室温下保存。

将19.8微升ddPCR主混合液移液至每个PCR管中。向每管中加入2.2微升上一步延伸反应溶液，最终总体积为22微升。设置液滴生成卡盒时，首先将20微升已制备的溶液加入卡盒中间的样品孔中。

轻轻敲击 cartridge 侧面，使溶液中的任何气泡移动到顶部。在加载油之前，必须先向 cartridge 的所有孔中加入样品。然后，向左侧油孔中加入 70 微升的液滴生成油。

通过将垫圈固定在芯片的两端来将其固定到位，并将装载并组装好的芯片放入液滴生成仪中。当芯片正确放置后，生成仪会显示稳定的绿灯以示提示。60 至 90 秒后，当生成仪的指示灯停止闪烁时，表示循环已完成。

现在移除卡盒。轻轻将垫圈从卡盒上取下。使用多通道移液器从右侧孔中吸取约40微升新生成的液滴，转移至96孔PCR板中。

将所有样品加入96孔板后，使用铝箔PCR板密封膜对板进行热封，以防止蒸发。然后，将96孔板放入热循环仪中进行PCR反应。开始时，将96孔板装入液滴读取仪中。

正确放置样品板，使 A1 样品与支架上的位置相对应。打开与液滴读取仪配套的软件。双击第一个孔 A01，以打开样品孔编辑界面。

点击“实验”，然后从下拉菜单中选择要使用的检测类型。选择 QX200 ddPCR EvaGreen Supermix 作为正确的检测方法。点击井板编辑器屏幕右下角的“应用”，以将用户自定义设置保存到所有已选中的孔中。

接下来，在孔板编辑界面中点击“靶标”（Target），然后点击靶标下拉菜单，选择未知样本（unknown）、参考样本（reference）或无模板对照（no-template control），以定义样本类型。在样本名称（Sample Name）部分，为所有样本标注名称，然后点击应用（Apply）。最后点击运行（Run）以读取酶标板数据。

在运行选项界面中，当提示选择读取方向时，选择“列”或“行”，以指定微孔板的读取方向。通过双击各个孔或列与行的标题，获取信息表格，以确定每个样本的可接受液滴数量。对于ddTRAP实验，每个样本中可接受液滴数达到10,000个或以上时，方可用于后续分析。

标记代表样本重复孔和NTC样本的孔位。通过点击屏幕左下角的阈值设置图标，手动为样本设置阈值。在本实验方案中，端粒酶活性在包含九种肺癌细胞系和端粒酶阴性成纤维细胞的细胞系面板中进行测定。

对于SHP77、H2887和NTC的三个生物学重复样本，均将阈值设定在约2,000荧光强度。阳性液滴的荧光强度约为6,000荧光强度单位，在图中形成位于上方的清晰群体，而阴性液滴的荧光强度约为1,100荧光强度单位，与之明显分离。各样本每细胞当量的总端粒酶延伸产物数量通过测定核酸浓度进行估算，该浓度代表了肺癌细胞系中的端粒酶活性。

在裂解或延伸反应步骤中，任何RNase污染都会破坏端粒酶的酶活性，因为端粒酶是一种核糖核蛋白复合物。可对细胞中hTERT mRNA的表达水平在ddTRAP之后进行ddPCR检测。这两组数据使我们能够将hTERT的表达与端粒酶活性相关联，并进一步深入研究潜在的端粒酶调控机制，例如选择性剪接。

我们可以探索对特定剪接因子进行干预及其对端粒酶活性的影响。目前，我们正在设计靶向端粒酶活性的寡核苷酸剪接调节剂作为潜在药物。