监测变化的细胞内钙离子浓度和突触效能的软体动物海兔
2012年7月15日
我们演示了如何在细胞内游离钙离子浓度和突触效能的变化，可以同时监测神经节准备的海兔。我们的图像使用的荧光染料，钙奥兰治，用锋利的（细胞内）电极和诱导和监测突触传递的细胞内钙离子。
细胞内钙被认为是突触可塑性的几种机制的重要组成部分。这些想法可以通过同时监测钙的变化和突触功效的改变来测试。在这里，我们展示了如何通过将钙成像与细胞内记录相结合来实现这一点。
我们的实验是用软体动物 Aplysia Cahora 的神经节进行的。这种制剂具有许多优点，例如识别出的大神经元、顶端自然的低温、信号慢并有助于成像，但我们展示的通用技术很容易转移到其他系统。大家好，我是 Colin Evans，在纽约市西奈山医学院 Fishburg 神经科学系 Elizabeth Cropper 的实验室和 Freedman 脑研究所工作。
今天，我们将演示软体动物 Aplysia cahora 颊神经节细胞内钙浓度和突触功效变化的同步成像。为了检测细胞内钙，我们将用细胞 IMP 通透性钙指示剂染料钙橙注射突触前神经元。然后将制剂在显微镜下移动，并用锋利的电极刺穿突触前和突触后神经元。
重复的突触前刺激导致增强的突触后反应，表现为突触后电位或 PSP 振幅增加。测量钙指示剂染料的荧光信号将使我们能够检测突触前细胞内钙的同时变化。首先通过注射 150 密耳的等渗氯化镁溶液麻醉重约 75 克的成年动物，将麻醉的动物固定在蜡覆盖的培养皿上，然后使用大镊子和剪刀，在动物的脚上切开并暴露颊部肿块。
颊侧神经节位于颊侧肿块的腹侧，由两个相连的半神经节组成。它包含数百个神经元，这些神经元与其他神经节中的神经元一起有助于动物摄食行为的产生和控制。用细剪刀剪断所有弯曲的神经，小心地松开神经节，然后将其从动物身上取下。
然后将释放的神经节固定在装满人工海水的 sil guard 涂层培养皿的底部。神经节包裹在结缔组织鞘中，必须将其移除才能露出单个神经元。使用验证镊子、虹膜剪刀和极其小心地剪掉这个鞘。
为避免损坏神经元，请用大约 15 分钟的针固定鞘神经节，因为在成像过程中任何移动都会出现问题。为了准备用于细胞内记录和染料注射的锋利电极，请用微电极拉拔器拉动毛细管。我们使用外径为 1 毫米的薄壁细丝 boa 硅酸盐玻璃。
当填充 3 摩尔乙酸钾时，记录电极的电阻应约为 10 兆瓦，因此我们相应地调整拉拔器以填充 D 电极。将拉出的电极背面浸入 10 毫摩尔的钙橙染料毛细管溶液中，沿着电极内部的玻璃丝作用，将染料吸入尖端，然后用 200 毫摩尔的氯化钾回填电极，以确保良好的电接触。我们使用定制的 Bela 来改善电极特性并将记录电极电阻降低到大约 5 兆瓦。
电极以 45 度角固定在氧化铝悬浮液流中。将氯化钠混合到悬浮液中并连接 ome meter，可以监测电极电阻。在斜切过程中，我们将包含被欺骗的扣环神经节的培养皿转移到电生理学装置上，并通过用电极刺穿并验证其身份来定位感兴趣的神经元。
为了准备用于钙成像的神经元，我们首先将充满染料的电极插入细胞胞体，并在理论上用 30 分钟的超极化、15 纳安电流脉冲加载染料电。当 D 钙橙进入细胞时，SOR 将获得淡淡的粉红色。然后，我们小心地缩回记录电极，并将制备物静置至少 30 分钟，让染料扩散到神经元的精细过程中。
接下来，将装有制剂的培养皿转移到荧光显微镜上。我们在正置固定载物台显微镜上使用 10 倍 NA 0.3 水浸透镜，该显微镜通过移动透镜而不是载物台来聚焦。这使得安装纵器变得更加容易。
对于记录电极，选择合适的滤光片模块。一个 SI 三滤光片模块将为钙橙提供正确的激发和发射滤光片，使用中性密度滤光片和视场孔径调整相机参数和照明强度。更多的光线会产生更少的噪音，但可能会漂白制剂。
酷拍 CCD 相机可以以每秒约 30 帧的帧速率和良好的信噪比捕获 500 x 300 像素的视场。通过尽可能保持光源快门关闭来最大限度地减少 fil 神经元的照明。在成像软件中，选择感兴趣区域或 R ois。
这些区域定义了软件将进行强度测量的位置。我们通常对突触前神经元的初级、二级和三级分支进行成像。在 difi 神经元旁边放置一个额外的 ROI 以获得一个背景值，该值稍后从所有其他数据点中减去。
突触前和突触后神经元中的细胞内记录电极用于诱导和监测突触传递。如果使用相机的帧输出触发信号来启动数据采集软件，则可以确保电生理学和成像数据采集之间的同步。确保同步的另一种方法是在相机端口内安装 LED。
此 LED 在录制会话开始时短暂亮起，从而提供同步标记。在典型的实验中，通过注入短暂的电流脉冲来触发突触前神经元中的动作电位。在这个例子中，我们展示了钙信号的脉冲爆发和相应的增加，以检验特定的假设。
可以纵钙信号并确定对突触传递的影响。例如，钙螯合剂 EGTA 等药物可以在突触前注射或通过灌注系统应用。通过将数据从成像软件导出到文本文件，然后导出到用于获取电生理数据的软件中来分析数据，在我们的例子中，这是 Cambridge Electronic Design 的尖峰 2。
我们使用自定义编写的脚本来绘制 ROI 强度值和膜电位的相应变化，通过减去从背景 ROI 获得的背景信号并使用所示方程计算相对变化来量化钙信号的变化。F 零是刺激前的荧光，F 是刺激期间的荧光。在这里，我们展示了一项实验的结果，在该实验中，我们对已鉴定的神经元 B 21 中钙荧光的变化进行了成像。
我们成像的区域在 A 中表示，在 B 中，我们在 B 21 中诱导了一阵尖峰，这在 B 8 中诱导了突触后电位和钙信号的变化。B 2 显示了钙螯合剂注射的效果。B 21 中的 EGTA 尖峰不再诱导钙荧光的广泛增加，并且突触后电位振幅降低。
总之，我们已经展示了可用于同时监测细胞内钙浓度和评估突触传递功效的技术。与大多数功能性成像相比，这些技术只需要适度的设备，并且易于学习。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究展示了在海兔神经节制剂中同时监测细胞内游离钙浓度和突触效能的方法。使用钙橙进行成像和锐利的细胞内电极进行突触传递，该研究突出了钙动力学与突触可塑性之间的关系。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 突触可塑性
- 钙成像
背景
- 细胞内钙在突触可塑性机制中起着至关重要的作用。
- 同时监测钙和突触效能可以提供对这些机制的见解。
- 海兔神经节制剂为此类研究提供了优势。
- 所展示的技术可以适用于其他系统。
研究目的
- 调查细胞内钙在突触传递中的作用。
- 展示同时监测钙和突触效能的方法。
- 利用海兔作为神经科学研究的模型生物。
使用的方法
- 使用荧光染料钙橙进行钙成像。
- 使用锐利电极进行细胞内记录以监测突触传递。
- 在软体动物海兔的神经节上进行实验。
- 利用大型已识别的神经元进行有效成像。
主要结果
- 成功同时监测钙浓度和突触效能。
- 展示了钙动力学与突触传递之间的关系。
- 突出了使用海兔进行此类研究的优势。
- 提供了适用于其他生物系统的方法论。
结论
- 细胞内钙对于理解突触可塑性至关重要。
- 结合成像和记录技术对神经科学研究有效。
- 海兔作为研究突触机制的宝贵模型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding the mechanistic link between intracellular calcium dynamics and synaptic efficacy is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. This approach enables predictive confidence in pathway modulation by directly linking a key second messenger to functional synaptic output. The Aplysia ganglion model provides a disease-relevant system for probing conserved plasticity mechanisms with high signal-to-noise and experimental stability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether modulating intracellular calcium alters synaptic transmission in identified neurons.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of calcium flux and postsynaptic potential changes.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by establishing causal relationships between calcium signaling and synaptic efficacy.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with normal ion channel distribution and stable synaptic connections for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers ratiometric-free fluorescence intensity changes correlated with electrophysiological readouts for high-content analysis.
- Scalability: Uses long-wavelength dye Calcium Orange requiring no filter wheel, simplifying imaging setup and increasing throughput potential.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved synaptic plasticity mechanisms applicable to neuropsychiatric and neurodegenerative disorder targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism probing with preclinical validation through standardized calcium-synaptic readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how target modulation affects both calcium dynamics and functional synaptic output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking target engagement (via calcium modulation) to functional phenotypic outcomes (synaptic efficacy), supporting lead identification and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about calcium-dependent signaling pathways in synaptic plasticity using direct perturbation and dual-readout measurement.
- Screening: Enables assay standardization through stable preparations, low phototoxicity dyes, and synchronized electrophysiology-imaging data collection.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ΔF/F fluorescence and PSP amplitude) that allow comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by correlating intracellular calcium changes with synaptic efficacy in a disease-relevant invertebrate model of conserved neural mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing calcium-dependent synaptic mechanisms across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in calcium-synapse relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dye loading, electrode preparation, and synchronization via LED trigger.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets implicated in synaptic dysfunction.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on dual-modality readouts of target engagement and functional effect.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intracellular sharp electrode recording and calcium imaging techniques.
- Depends on fluorescence microscopy capable of 30 fps imaging and electrophysiology rigs with LED synchronization.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for synchronized data acquisition.
- Involves adaptation considerations when transferring the Aplysia ganglion preparation to other model systems with different neuronal sizes or synaptic properties.
- Limited by the inability of Calcium Orange to provide absolute calcium concentrations due to non-ratiometric nature and dye diffusion variables.
