Name: 聚合酶链反应：基本协议加上故障排除和优化策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学习聚合酶链反应（PCR）的基本操作流程，掌握DNA扩增技术的关键步骤与优化策略。本视频详细演示试剂配制、热循环条件设置及故障排除方法，帮助研究人员提高实验成功率。

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特别感谢加州大学洛杉矶分校的Kris Reddi协助准备试剂和灌胶，感谢加州大学洛杉矶分校的Erin Sanders在本研究中的启发、指导与支持，并对稿件进行了校对。同时感谢Giancarlo Costaguta和Gregory S. Payne提供用于扩增GAL3基因的酵母基因组DNA及引物。还感谢Bhairav Shah拍摄了用于制作图2至图4的实验仪器和试剂照片。本项目经费由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）提供（HHMI资助号：52006944）。

<ol><li>Albert, J., Fenyo, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+sensitive%2C+and+specific+detection+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+clinical+specimens+by+polymerase+chain+reaction+with+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 1560-1564 (1990).</li>
<li>Baskaran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+amplification+of+a+mixture+of+deoxyribonucleic+acids+with+varying+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content.</a> Genome Res. 6, 633-638 (1996).</li>
<li>Blanchard, M. M., Taillon-Miller, P., Nowotny, P., Nowotny, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+buffer+optimization+with+uniform+temperature+regimen+to+facilitate+automation%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">PCR buffer optimization with uniform temperature regimen to facilitate automation.</a> PCR Methods Appl. 2, 234-240 (1993).</li>
<li>Borer, P. N., Dengler, B., Tinoco, I. Jr, Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+ribonucleic+acid+double-stranded+helices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.</a> J. Mol. Biol. 86, 843-853 (1974).</li>
<li>Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H., Marky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+DNA+duplex+stability+from+the+base+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Predicting DNA duplex stability from the base sequence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3746-3750 (1986).</li>
<li>Chou, Q., Russell, M., Birch, D. E., Raymond, J., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+pre-PCR+mis-priming+and+primer+dimerization+improves+low-copy-number+amplifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications.</a> Nucleic Acids Res. 20, 1717-1723 (1992).</li>
<li>Coleman, W. B., Tsongalis, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColeman%2C+WB+%22Diagnostics+for+the+clinical+laboration%22">Diagnostics for the clinical laboration</a>. , Humana Press. (2005).</li>
<li>D'Aquila, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+sensitivity+and+specificity+of+PCR+by+pre-amplification+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3749(1991).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Touchdown%27+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4008(1991).</li>
<li>Erlich, H. A., Gelfand, D., Sninsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the polymerase chain reaction.</a> Science. 252, 1643-1651 (1991).</li>
<li>Frey, U. H., Bachmann, H. S., Peters, J., Siffert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-amplification+of+GC-rich+regions%3A+%27slowdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">PCR-amplification of GC-rich regions: 'slowdown PCR.</a> Nat. Protoc. 3, 1312-1317 (2008).</li>
<li>Haqqi, T. M., Sarkar, G., David, C. S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+amplification+with+PCR+of+a+refractory+segment+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specific amplification with PCR of a refractory segment of genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 16, 11844(1988).</li>
<li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR Protocols: A guide to methods and applications</a>. , Academic Press, Inc. San Diego. (1990).</li>
<li>King, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+N+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 630, Humana Press. (2010).</li>
<li>Kleppe, K., Ohtsuka, E., Kleppe, R., Molineux, I., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+polynucleotides.+XCVI.+Repair+replications+of+short+synthetic+DNA%27s+as+catalyzed+by+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.</a> J. Mol. Biol. 56, 341-361 (1971).</li>
<li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nat. Protoc. 3, 1452-1456 (2008).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Appendix 3, 1-14 (2001).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, Appendix 4J(2002).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Kwok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+immunodeficiency+virus+sequences+by+using+in+vitro+enzymatic+amplification+and+oligomer+cleavage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection.</a> J. Virol. 61, 1690-1694 (1987).</li>
<li>McConlogue, L., Brow, M. A., Innis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-independent+DNA+amplification+by+PCR+using+7-deaza-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-independent DNA amplification by PCR using 7-deaza-2'-deoxyguanosine.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9869(1988).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unusual+origin+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">The unusual origin of the polymerase chain reaction.</a> Sci. Am. 262, 56-65 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+amplification+for+DNA+analysis+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biol.+Clin.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.</a> Ann. Biol. Clin. (Paris). 48, 579-582 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction+in+an+anemic+mode%3A+how+to+avoid+cold+oligodeoxyribonuclear+fusion%29%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion).</a> PCR Methods Appl. 1, 1-4 (1991).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Paabo, S., Gifford, J. A., Wilson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+sequences+from+a+7000-year+old+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9775-9787 (1988).</li>
<li>Rees, W. A., Yager, T. D., Korte, J., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+can+eliminate+the+base+pair+composition+dependence+of+DNA+melting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting.</a> Biochemistry. 32, 137-144 (1993).</li>
<li>Roux, K. H., Hecker, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optimization+using+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One-step optimization using touchdown and stepdown PCR.</a> Methods Mol. Biol. 67, 39-45 (1997).</li>
<li>Rychlik, W., Spencer, W. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239, 487-491 (1988).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Sambrook, J. A. R., David, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+JAR+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual</a>. 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Sarkar, G., Kapelner, S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formamide+can+dramatically+improve+the+specificity+of+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formamide can dramatically improve the specificity of PCR.</a> Nucleic Acids Res. 18, 7465(1990).</li>
<li>Smit, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+codon+12+mutations+occur+very+frequently+in+pancreatic+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS codon 12 mutations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas.</a> Nucleic Acids Res. 16, 7773-7782 (1988).</li>
<li>Wilson, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+facilitation+of+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 3741-3751 (1997).</li>
<li>Wu, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+R+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 218, Academic Press, Inc. San Diego. (1993).</li>
</ol>

我无任何披露事项。

聚合酶链式反应（PCR）已成为生物科学研究工具中不可或缺的一部分。PCR 改变了科学的发展进程，使生物学家能够操控基因组，构建具有新功能的杂合基因，实现特异且准确的临床检测，深入理解基因组与多样性，以及简单地克隆基因以进行后续的生物化学分析。PCR 的应用范围仅受限于使用其技术的科学家的想象力。已有大量书籍和论文描述了 PCR 的新型专门用途，而在下一代生物科学研究中还将开发出更多应用。然而，无论预期采用何种方法，其基本框架始终未变。PCR 无论形式如何，本质上都是一种在体外（in vitro）扩增特定 DNA 片段以获得大量拷贝的技术。
设计 PCR 实验需要周密的思考与耐心。图 3 所示结果体现了在设计 PCR 优化策略时面临的主要挑战之一：当改变 PCR 的一个参数时，可能会影响其他参数。例如，若初始 PCR 在次优的退火温度（58°C）下进行，尽管 Mg2+ 浓度处于最佳的 2.0 mM，结果仍会产生如图 3c 所示的弥散条带。为消除弥散条带，可能尝试设置包含 2.0 mM MgCl2 的 PCR 体系，并将退火温度调整至 61°C。然而，如图 3a 所示，这将导致无任何扩增产物生成。因此，在排查非特异性结果时，建议对试剂进行梯度滴定，而不是仅在单个反应中加入某一固定浓度。此外，优化 PCR 实验最常需要的调整是改变 Mg2+ 浓度和校正退火温度。然而，如果这些调整仍无法减少或消除异常结果，则可尝试对添加剂进行滴定，和/或如表 2-6 所述改变循环条件方案，以缓解问题。如果所有方法均无效，则需重新设计引物，并再次尝试、反复尝试。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; 聚合酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545-25UN</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Qiagen</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml 薄壁管 PCR 管</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9469</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml 薄壁管管盖</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9472</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>定制噬菌体引物</td><td>Invitrogen</td><td>25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG</td><td></td></tr><tr><td>定制噬菌体引物</td><td>Invitrogen</td><td>26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT</td><td></td></tr><tr><td>定制酵母引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>SacI-Gal3(-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG</td><td></td></tr><tr><td>定制酵母引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Gal3(1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG</td><td></td></tr><tr><td>PCR 扩增仪</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9703</td><td>My Cycler</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>ISC BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>Hoeffer Scientific Instruments</td><td>Model HE33</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA 标准分子量标记</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 电源装置</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>PowerPac Basic</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Fotodyne Incorporated</td><td>FOTO/Analyst Investigator FX Workstation</td><td></td></tr></tbody></table>

聚合酶链式反应：基础方案及故障排除与优化策略

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

在生物科学领域，技术进步推动该学科进入发现的黄金时代。例如，随着安东尼·范·列文虎克（Anton van Leeuwenhoek）发明显微镜，微生物学领域发生了根本性变革，科学家首次得以观察原核生物。聚合酶链式反应（PCR）的发展正是此类改变分子科学进程的重大创新之一，其影响遍及生物学众多分支学科。该反应的理论构想最早由凯佩（Keppe）及其同事于1971年提出；然而，直到14年后的1985年，凯利·穆利斯（Kary Mullis）在塞图斯公司（Cetus Corporation）工作期间才首次完整描述并实验应用了完整的PCR技术。随着从细菌Thermus aquaticus中分离出耐热DNA聚合酶，这一技术得以实现自动化和优化，因此该酶被命名为Taq DNA聚合酶。
聚合酶链式反应（PCR）是一种强大的扩增技术，仅需少量起始材料（即DNA模板或目标序列），即可生成大量特定的DNA片段（即扩增子）。尽管该技术操作简单且通常顺利，但仍存在一些可能导致产生错误结果的陷阱。当PCR失败时，可能会产生多种非特异性DNA产物，其大小不一，在琼脂糖凝胶上表现为梯状或弥散的条带；有时甚至完全不产生任何产物。另一个潜在问题是在扩增子中意外引入突变，导致PCR产物群体具有异质性。除非耐心地进行仔细排查并解决相关问题，否则PCR失败可能令人沮丧。本实验方案概述了PCR的基本原理，提供了一种适用于大多数目标序列扩增的方法，并提出了反应优化的策略。通过遵循本PCR指南，学生应能够： 
 
● 设置常规PCR实验的反应体系和热循环条件 
● 理解各种反应组分的功能及其对PCR实验的整体影响 
● 针对任意DNA模板设计并优化PCR实验 
● 对失败的PCR实验进行故障排查

聚合酶链式反应（PCR）已成为许多分子生物学实验室中常用的技术。本文提供若干常规PCR方案的快速指南。由于每个反应都是一个独特的实验，因此生成产物所需的最适条件各不相同。理解反应中的各种变量将极大提高故障排除的效率，从而增加获得预期结果的可能性。

在生物科学领域，技术进步已将该学科推向了发现的黄金时代。例如，……

本实验的总体目标是演示聚合酶链式反应（PCR）的各个步骤，该技术可用于从少量起始材料中扩增出足量的特定DNA片段。首先，准备好PCR反应所需的各种试剂和材料，然后配制反应体系，包括四种脱氧核糖核苷酸、DNA模板、引物以及DNA聚合酶。接下来设定热循环程序并运行PCR反应。随后，通过检测结果来判断反应是否成功。最终，聚合酶链式反应应产生特定大小的目标扩增片段。通常，初次接触该实验方案的研究人员在计算各种可变试剂的用量时会遇到一些困难，有时在移液操作和准确量取体积方面也会出现问题，尤其是含有甘油的聚合酶。实验开始前应准备装满新鲜冰块的冰桶。佩戴手套以避免污染反应体系。混合物与试剂。将 PCR 组分置于冰上，使其完全解冻。这些组分包括 DNA 模板引物、DNA 聚合酶 10 x 反应缓冲液（含或不含氯化镁）、脱氧核苷酸、无菌水和氯化镁。如果使用不含氯化镁的缓冲液，则需要添加氯化镁。将一个96孔板放入装有冰的容器中，用作0.2毫升薄壁PCR管的支架。现在在工作台上准备好PCR管和管盖。一个PCR管架、一支耐乙醇标记笔和一套微量移液器。始终创建试剂表格，详细列出反应混合物，并用定量无菌蒸馏水补足至终体积50 µL。例如，使用5 µL不含镁的缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs，以及优化后的4.0 mM氯化镁。每种20微摩尔引物取1微升，两纳克每微升模板取0.5微升，聚合酶取0.5微升，仅需加入33微升无菌水。如果10×缓冲液中不含氯化镁，或PCR优化需要时，需添加氯化镁。使用耐乙醇标记笔在每个PCR管上做好标记。首先加入计算好的无菌水体积，然后加入10×缓冲液和10毫摩尔的dNTPs。本反应中，我们将对氯化镁进行梯度浓度滴定。由于镁离子浓度不会保持恒定，需向各PCR管中单独加入氯化镁，并用无菌水将体积调至10微升，使每管PCR反应中加入40微升终末主混合液。为完成50微升反应体系并补足氯化镁，继续加入DNA模板和引物。最后，在1.8毫升微量离心管中，每50微升反应体系加入0.5至2.5单位的DNA聚合酶。准备足够量的预混液，以容纳对照样本以及移液过程中的损耗。将微量移液器调至总体积的一半左右，通过移液操作轻轻混匀。将每份检测样本的预混液加入 PCR 管中。对于不含模板 DNA 的阴性对照，加入所有试剂，并使用无菌水补足缺失的 DNA 体积。对于阳性对照，则使用一组模板 DNA 和引物，在与实验性 PCR 样本相同的条件下扩增已知片段。PCR 扩增仪可快速加热和冷却反应混合物，从而实现双链 DNA 的热变性、引物与 DNA 模板正链和负链的退火，以及 PCR 产物的延伸。循环次数根据模板大小和DNA的GC含量按通用公式确定。首先对模板进行初始变性，然后进行25至35轮三步温度循环程序。这些循环的第一步是使DNA模板变性。然后设置最佳程序，退火温度比引物的表观熔解温度低约五摄氏度，随后进行延伸步骤，使聚合酶结合到DNA模板并合成PCR产物。现在输入循环次数。接下来设置程序。延长延伸步骤以完成扩增子的合成。最后加入终止步骤，将反应混合物冷却至4°C。如果标准PCR条件未能获得目标扩增子，则需要进行PCR优化以获得更好的结果。因此，如果反应首次未成功，您需要尝试对反应进行故障排查。首先，您应确保问题并非由人为操作失误造成。例如，加样时出现移液错误，或在某个试管中遗漏添加了某种试剂，都可能导致此类问题。接下来，您可以尝试调整反应条件中的一些严格性参数，例如改变PCR仪的设置，或者改变镁离子浓度是另一种可选方法。您还可以尝试在试剂中添加一些添加剂，以解决出现的问题。或者，可以考虑采用热启动PCR这一灵活的改进方法，该方法显著延长了初始变性时间。随后采用AROS凝胶电泳分离酿酒酵母基因组DNA中GAL三基因的PCR产物，以确定该组试剂的最佳镁离子浓度。注意观察是否出现预期大小的PCR产物。在镁浓度为2.5毫摩尔时，开始出现大小为2098个碱基对的PCR产物，最佳浓度为4毫摩尔；而在不同DNA模板上扩增目标PCR产物并形成清晰条带时，需要2毫摩尔的镁离子。降低反应严谨性至亚 optimal 扩增条件会导致出现非特异性产物的弥散条带。此外，随着反应严谨性的整体提高，形成扩增子所需的镁离子量减少。因此，在优化PCR时注意各种变量，可以获得特异的目标产物。观看本视频后，您应能够充分理解如何设置和准备聚合酶链式反应。目标是了解每种 PCR 的变量及其如何被调控以产生所需的扩增片段。

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