الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج ركائز زراعة خلوية محاكية حيويًا لهندسة بنية ووظيفة أنسجة قلبية عيانية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع قالب رئيسي من السيليكون بالبنية الطبوغرافية المطلوبة باستخدام النقش الأيوني التفاعلي العميق. وتتمثل الخطوة الثانية في نقل النمط الطبوغرافي المطلوب من القالب الرئيسي السيليكوني إلى قالب PUA باستخدام الليثوغرافيا بقوة الخاصية الشعرية بمساعدة الأشعة فوق البنفسجية UV.

بعد ذلك، يُستخدم قالب PUA كنموذج لتصنيع ركائز زراعة الخلايا من مواد بوليمرية متنوعة بناءً على التطبيق المطلوب، وذلك عبر تقنية الليثوغرافيا بقوة الخاصية الشعرية المدعومة بالأشعة فوق البنفسجية UV أو بوساطة المذيبات. وتتمثل الخطوة النهائية في زراعة الخلايا العضلية القلبية، سواء كانت أولية أو مشتقة من الخلايا الجذعية، على ركائز زراعة الخلايا ذات الأنماط النانوية لإجراء التحليلات اللاحقة. وفي النهاية، يُستخدم مجهر المجال المضيء والمجهر الفلوري المناعي لإظهار التغييرات في مورفولوجيا الخلايا وترتيب البروتينات الانقباضية داخل الخلايا العضلية القلبية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الطباعة بالتلامس الدقيق، في أن الليثوغرافيا بقوة الخاصية الشعرية تُنتج ركائز لزراعة الخلايا بأنماط نانوية يمكنها تحفيز الاصطفاف الهيكلي لطبقات الخلايا القلبية الأحادية دون الاعتماد على تكاثر الخلايا أو هجرتها. وبالرغم من إمكانية استخدام هذه الطريقة لتوفير رؤى حول العلاقة بين البنية والوظيفة في الأنسجة القلبية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الميكانيكا الحيوية للسرطان. ولدراسة تأثير تضاريس المصفوفة على هجرة الخلايا، ابدأ هذا الإجراء بتنظيف سطح القالب السيليكوني باستخدام 100%ethanol أو الزايلين والتجفيف تحت غاز الأكسجين والنيتروجين.

بعد ذلك، ضع قالب السيليكون الأساسي بحيث يكون جانب النمط متجهًا للأعلى في طبق بتري؛ وبالنسبة لقالب سيليكون أساسي بنمط سطحي قياسه 2 cm × 2 cm، يتم سحب 40 µL من PUA وإضافتها إليه. ثم ضع ورقة من فيلم البوليستر الشفاف قياس 4 cm × 4 cm فوق PUA الموزعة، واضغط على ورقة PET وقم بتوزيع PUA تحت الورقة عبر وجه النمط باستخدام أسطوانة أو سطح مستوٍ بحيث يتم تغطية النمط بالكامل بواسطة البوليمر الأولي PUA. بعد ذلك، ضع قالب السيليكون الأساسي والبوليمر الأولي وورقة PET على مسافة 10 cm تقريبًا أسفل ضوء UV بقدرة 20 watt لمدة 50 seconds.

بعد المعالجة، قم بإزالة فيلم PET ببطء باستخدام الملاقط. يجب أن يلتصق PUA بفيلم PET مع تشكيل صورة عكسية للنمط النانوي للقالب السيليكوني. بعد ذلك، قم بمعالجة أنماط P-U-A-P-E-T النانوية تحت الأشعة فوق البنفسجية UV لمدة 12 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.

لتنظيف القوالب السيليكونية (Silicon Masters)، ضع طبقة أخرى من PET فوق القالب دون إضافة PUA. عرّضه للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 50 ثانية ثم قم بإزالة طبقة PET. بعد ذلك، اشطف القالب السيليكوني بـ 100% ethanol أو xylene وجففه تحت غاز النيتروجين.

في هذا الإجراء، يتم معالجة شرائح زجاجية دائرية بقطر 18 millimeter عن طريق وضعها في غرفة أوزون لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، توضع الشرائح على كتل من PDMS لتثبيتها مؤقتاً لسهولة التعامل معها. ثم، يتم وضع طبقة من مادة أساس الزجاج (glass primer) على سطح الشريحة الزجاجية.

اترك المادة الرابطة (primer) لتجف في الهواء لمدة 30 دقيقة. الآن، ضع الشرائح الزجاجية على قطعة من ورق الطابعة. ضع 10 µL من بوليمر البولي يوريثان الأولي (polyurethane pre polymer) في مركز كل شريحة زجاجية مع التأكد من عدم تكون أي فقاعات.

بعد ذلك، ضع قالب PUA بحيث يكون وجه النمط لأسفل على الشريحة الزجاجية، ثم وزع البوليمر الأولي للـ PU بشكل متجانس عبر سطح الشريحة الزجاجية عن طريق دحرجة أسطوانة مطاطية على طول قالب PUA. ستقوم ورقة الطابعة بامتصاص فائض البوليمر، وبعد ذلك قم بمعالجتها بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية تحت مصباح UV بقدرة 20 watt. لاحقاً، أخرج العينة من مصدر الأشعة فوق البنفسجية وقم بإزالة قالب PUA بعناية من الشريحة الزجاجية المطلية بـ PU، وبذلك تعتبر عملية بلمرة PU قد اكتملت.

عندما ينفصل قالب PUA تماماً عن العينة ويكون لشريحة PU الزجاجية مظهر متقزح، توضع العينات في مجفف للتخزين لمدة تصل إلى شهر. الآن، قم بتثبيت شرائح NFS الغطائية في طبق زراعة أنسجة من البوليسترين مقاس 35 مليمتر، واستخدم الماصة لوضع 20 µL من NOA في قاع الطبق. ضع شريحة NPPU الغطائية برفق فوق NOA واترك الغراء يتوزع ليغطي كامل الجزء السفلي من الشريحة الغطائية، وبعد ذلك يتم تصلب NOA بتعريض الطبق للأشعة فوق البنفسجية UV لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بتعقيم الركائز النانوية (NP SUBSTRATA) عن طريق شطفها مرتين بمقدار 2 mL من محلول الإيثانول المائي بتركيز 70% لمدة خمس دقائق في كل مرة. تخلص من الإيثانول عن طريق الشفط. اترك A NFS لتجف تماماً في الهواء لمدة ساعة تقريباً تحت مصباح التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية (UV) داخل كابينة السلامة البيولوجية.

لتعزيز الالتصاق الخلوي، قم بطلاء A NFS ببروتين الفيبرونيكتين طوال الليل، وذلك أولاً بتخفيف الفيبرونيكتين في di water لتصل التركيز إلى 5 µg/mL. بعد ذلك، انقل 2 mL من محلول الفيبرونيكتين إلى طبق. ثم ضع A NFS في الحاضنة عند 37 °C و5%CO2 طوال الليل.

احصل على الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (NR VMs)، أو الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC CMS)، أو أي خلايا قلبية أخرى محل الاهتمام، ثم قم بطرد عينة الخلايا مركزياً عند 1000 RPM لمدة ثلاث دقائق لترسيب الخلايا. أزل السائل الطافي بعناية عن طريق الشفط مع الحرص على عدم تعكير الراسب. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في وسط الزرع ليصل التركيز إلى 4.6 × 10⁶ خلية لكل milliliter.

انقل 200 µL من معلق الخلايا بعناية باستخدام الماصة إلى A NFS المعقمة، وتأكد من بقاء معلق الخلايا على الغطاء الزجاجي. بعد ذلك، ضع الخلايا في الحاضنة عند 37 °C و5%CO2 لمدة أربع ساعات للسماح للخلايا بالالتصاق بـ A NFS. ثم أضف 2 mL إضافية من وسط الزرع الدافئ إلى الطبق وضع الخلايا في الحاضنة مرة أخرى تحت نفس الظروف.

بعد مرور 24 ساعة، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا بـ 2 mL من DPBS مرتين لإزالة الخلايا الزائدة. بعد ذلك، أضف 2 mL من وسط استزراع دافئ إلى الطبق. ضع الخلايا في حضانة تحت نفس الظروف وتابع استزراعها.

تُستبدل الأوساط الغذائية كل يومين حتى تصل الخلايا إلى حالة الالتحام. يوضح هذا الشكل صور الحقل المضيء التمثيلية لـ NR VMs بعد سبعة أيام من الزراعة و HESC cms. بعد 48 ساعة من الزراعة، تظهر NR VMs و HESC CMS على أسطح NP تباينًا بنيويًا ومحاذاة واضحة، بينما تكون الخلايا العضلية القلبية على أسطح UN موزعة بشكل عشوائي.

يبرز التحليل الكيميائي النسيجي المناعي تأثير التضاريس النانوية على محاذاة الهيكل الخلوي، حيث تصبح الخيوط الدقيقة للأكتين وألفا أكتين الساركوميري في الخلايا المستزرعة على A NFS مصطفة على طول الحواف النانوية، بينما تظل موزعة عشوائياً في الخلايا الموجودة على ركائز غير منقوشة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تعقيم الركائز قبل وضع الخلايا، حيث يمكن أن يشكل التلوث مشكلة كبيرة بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في بيولوجيا القلب والأوعية الدموية لاستكشاف نضج القلب والخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج ركائز زراعة خلايا محاكية حيوياً عبر تقنية الليثوغرافيا بقوة الخاصية الشعرية لتطبيقات هندسة أنسجة القلب.