一种简单有效的方法，通过流式细胞仪检测核转录因子激活人体中性粒细胞
April 9th, 2013
中性粒细胞是白细胞在血液中含量最丰富的。中性粒细胞具有转录调控功能，如生产的炎性细胞因子和抑制细胞凋亡。这些函数可以用这里介绍的方法，它允许核因素，通过流式细胞术检测和定量在孤立的核研究
本实验使用流式细胞术检测和定量中性粒细胞分离和免疫标记细胞核中的核蛋白，以从人外周血中纯化中性粒细胞。用糊精去除红细胞，然后对血浆进行密度梯度离心。然后使用抗受体抗体，通过整合素或 FC 受体刺激纯化的中性粒细胞。
继续分离细胞核并固定样品，用针对感兴趣的 NU 核因子的特异性抗体进行免疫标记。例如，NF kappa B 最终通过流式细胞术分析细胞核，以检测核因子活化的微小变化。获得的结果表明，通过整合素刺激中性粒细胞导致 kappa B 转录因子 N 的核浓度增加导致核因子激活的信号通路通常通过原代细胞中的报告基因测定或电泳迁移率变化测定来研究。
这些方法通常不合适。流式细胞术可快速检测和定量分离细胞核中的细胞核蛋白。从 10 毫升从健康成年志愿者那里新鲜采集的血液开始。
将2 毫升 6% 糊精 T 500 溶液移液到 15 毫升锥形离心管中。然后加入 10 毫升血液，将试管倒置 2 或 3 次，混合，并在新鲜的 15 毫升锥形离心管中静置 45 分钟，让红细胞在重力作用下沉降。放入 5 毫升 FI fial 包装。
收获在沉淀的红细胞上方形成的富含白细胞的血浆。小心地将其分层在 fial 包的顶部形成两个阶段，在 4 摄氏度下以 516 Gs 离心 20 分钟。去除上清液，将试管敲击到架子上，使细胞沉淀破碎。
然后将细胞重悬于 10 毫升冷 PBS 中。将细胞悬液转移至 50 mL 锥形离心管中，并在 4 摄氏度下以 290 Gs 离心 5 分钟。像以前一样打破细胞沉淀，并向碱液红细胞中加入 10 毫升冷低渗溶液。
轻轻旋转试管 1 分钟，混匀。接下来，加入 10 毫升冷高渗溶液混合物并储存在冰上。现在通过离心沉淀中性粒细胞后计数细胞。
我们将 PMN 悬浮在每毫升 10 至 7 个细胞。在冷 PBS 中，将细胞保持在冰上。将 100 μL PMN 悬浮液分装到 1.5 mL einor 管中。
然后以 10 μg/mL 的浓度加入相应的单克隆抗体，并在冰上孵育 15 分钟。要洗涤细胞，请加入 1 毫升冷 PBS 离心机并吸出上清液。然后轻轻打破细胞沉淀并用 PBS 再洗涤两次。
要去除未结合的抗体，将洗涤后的 PMN 重新悬浮在相同初始体积的温 PBS 中，每毫升含有 60 μg go 抗缪斯 IgG，在 37 摄氏度下孵育 1 至 20 分钟，具体取决于感兴趣的核因子。现在加入 1 毫升冷 PBS 离心沉淀细胞后，去除 snat 并立即在干冰乙醇浴中冷冻细胞沉淀。对于每个样品，从干冰套装乙醇浴中取出试管，擦干净并复苏。
将冷冻的 PMN 颗粒悬浮在 100 微升冷低渗溶液中。将所有样品置于冰上以监测样品的细胞核完整性。用 trian blue 对细胞核悬浮液的 Eloqua 进行染色。
如果细胞核悬浮液包含许多完整的细胞或碎片，最好丢弃制剂并从另一个样品开始程序。通过离心沉淀细胞核后，非常小心地去除上清液，然后在 100 微升冷的 4% 多聚醛溶液中固定细胞核，并在冰上孵育细胞核。沉淀细胞核后，小心地在 100 μL 冷渗透缓冲液中取出 snat，并将样品在冰上孵育 10 分钟。
然后通过离心收获透性细胞核。此时，细胞核沉淀不能很好地附着在管的底部。建议再次 centrif future。
如果沉淀松散为了阻断非特异性结合位点，我们将细胞核悬浮在 500 微升冷的 4% 胎牛血清的 PBS 溶液中，并在冰上孵育 20 分钟。通过离心沉淀细胞核，然后重悬细胞核和 100 微升含有 4%FBS 和每毫升 2.5 微克针对目标核因子的单克隆抗体的冷 PBS。将样品在冰上孵育 20 分钟，用 500 微升含 4% FBS 的冷 PBS 洗涤样品两次后，我们将细胞核悬浮在 100 微升含有 4%FBS 和 10 微克毫升相应 FZ 标记的二抗的冷 PBS 中，两次洗涤后在冰上孵育 20 分钟，将细胞核重新悬浮在 400 微升冷的 4% Paraldehyde PBS 溶液中。
在流式细胞仪（如 FACT Scan 或类似设备）中分析免疫标记的细胞核。将采集设置调整为 10 的对数尺度的两个 FSC 到负一个对数尺度的 SSC，196 和采用图中的门核。每个样品采集 10， 000 个细胞核。
然后通过 FL 单通道以 400 的对数刻度设置来分析 fitsy 染色核的荧光。这种 PMN 纯化方法通常提供纯度大于 95% 的未刺激的中性粒细胞，从 PMN 细胞核中以高产量分离，分离到细胞核中，可以很容易地识别为与流式细胞仪中完整 PMN 不同的群体，刺激时带有点图。通过交联 β 1 整合素 NF kappa B 被翻译成细胞核，并且核 NF kappa B 的增加被检测为荧光的增加。
同样，通过交联 β 2 整合素刺激 PMN 也诱导 NF κ B 激活，如荧光增加所示。该方法的灵敏度允许检测核因子水平的微小变化，以下事实证明了这一点：结合细胞外基质蛋白（如纤连蛋白）的 β 1 整合素比 β 2 整合素诱导更强的 NF κ B 激活，后者与其他细胞上的粘附分子结合。这种方法具有极大的灵活性，因为可以使用许多不同的荧光染料，并且因为它允许从不同的细胞类型制备细胞核，因此将这种简单而经济的方法用于涉及各种细胞类型细胞核中蛋白质水平变化的信号转导研究。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究提出了一种使用流式细胞术检测和量化中性粒细胞核蛋白的方法。该方法允许研究人员分析分离核中转录因子（如NF kappa B）的激活。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 流式细胞术
背景
- 中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞类型。
- 它们通过产生促炎细胞因子在免疫反应中发挥关键作用。
- 了解它们的核功能对于洞察免疫调节至关重要。
- 流式细胞术是分析细胞成分的强大工具。
研究目的
- 从人类外周血中纯化中性粒细胞。
- 研究核因子在刺激响应中的激活。
- 提供详细的核蛋白水平定量方法。
使用的方法
- 使用糊精和密度梯度离心从人类血液中分离中性粒细胞。
- 用针对整合素或FC受体的抗受体抗体刺激中性粒细胞。
- 分离和固定核用于特定抗体的免疫标记。
- 通过流式细胞术分析核以检测核因子激活的变化。
主要结果
- 通过整合素刺激中性粒细胞导致NF kappa B的核浓度增加。
- 流式细胞术有效检测核因子激活的微小变化。
- 结果有助于理解中性粒细胞中的信号通路。
- 该方法可应用于研究原代细胞中的各种核因子。
结论
- 该方法提供了一种研究中性粒细胞核因子激活的可靠方法。
- 流式细胞术是分析免疫细胞功能的有价值技术。
- 进一步的研究可以探索额外的信号通路及其影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Detecting nuclear factor activation in primary human neutrophils enables mechanistic de-risking of inflammatory signaling pathways in drug discovery. This flow cytometry-based method provides quantitative, reproducible readouts of transcription factor dynamics, supporting target validation and assay development in immunology-focused programs. By overcoming transfection limitations in short-lived primary cells, it offers a scalable solution for early-stage biomarker alignment and predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NF-κB and Elk-1 activation in primary human neutrophils to clarify proinflammatory signaling mechanisms.
- Operational Value: Provides a transfection-independent method for studying transcriptionally regulated responses in difficult-to-transduce primary immune cells.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking receptor stimulation (e.g., integrins, Fc receptors) to nuclear translocation of key inflammatory mediators.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates isolated, immunolabeled neutrophil nuclei suitable for high-throughput flow cytometric screening of modulators of nuclear factor activation.
- Quantitative Output: Enables detection of small changes in nuclear protein concentration, facilitating dose-response and IC50 determination in compound screening.
- Reproducibility: Standardized neutrophil isolation and nuclear preparation workflows yield consistent fluorescence readouts across replicates and donors.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to studying neutrophil-driven inflammatory pathways in models of infection, autoimmunity, and tissue injury.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism elucidation with preclinical validation by providing a primary human cell-based readout of target engagement.
- Mechanistic De-risking: Reduces reliance on surrogate systems by enabling direct measurement of transcription factor activation in the therapeutically relevant cell type.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in immunology and enabling progression from target engagement assays to functional validation in primary human neutrophils before lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by quantifying nuclear translocation of transcription factors downstream of receptor stimulation (e.g., β1/β2 integrins, Fc receptors).
- Screening: Delivers assay-ready nuclei with quantitative fluorescence outputs suitable for screening compound libraries for modulators of NF-κB or Elk-1 activation.
- Analytics: Provides single-nucleus resolution and fluorescence intensity measurements enabling statistical comparison of stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Uses primary human neutrophils to enhance clinical relevance of mechanistic findings, supporting biomarker alignment in inflammatory disease models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple nuclear factors and fluorophores, allowing reuse across projects targeting different signaling pathways in neutrophils or other primary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing direct, quantitative evidence of nuclear factor activation in primary human immune cells.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable workflow for neutrophil isolation, nuclear preparation, and flow cytometric analysis with minimal specialized equipment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early-stage immunomodulator programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on target pathway modulation in a disease-relevant primary cell system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human blood processing, neutrophil isolation, and flow cytometry compensation and gating.
- Dependent on access to flow cytometers capable of fluorescence detection in the appropriate channels (e.g., FL1 for FITC-labeled antibodies).
- Necessitates standardization of stimulation conditions, antibody titers, and nuclear fixation/permeabilization protocols across users and sites.
- Adaptation to other cell types requires optimization of hypotonic/hypertonic lysis conditions and validation of nuclear integrity.
- Practical limitations include neutrophil donor variability and the short ex vivo lifespan of primary neutrophils, necessitating same-day experimentation.
