一种简单有效的方法，通过流式细胞仪检测核转录因子激活人体中性粒细胞

本实验使用流式细胞术检测和定量中性粒细胞分离和免疫标记细胞核中的核蛋白，以从人外周血中纯化中性粒细胞。用糊精去除红细胞，然后对血浆进行密度梯度离心。然后使用抗受体抗体，通过整合素或 FC 受体刺激纯化的中性粒细胞。

继续分离细胞核并固定样品，用针对感兴趣的 NU 核因子的特异性抗体进行免疫标记。例如，NF kappa B 最终通过流式细胞术分析细胞核，以检测核因子活化的微小变化。获得的结果表明，通过整合素刺激中性粒细胞导致 kappa B 转录因子 N 的核浓度增加导致核因子激活的信号通路通常通过原代细胞中的报告基因测定或电泳迁移率变化测定来研究。

这些方法通常不合适。流式细胞术可快速检测和定量分离细胞核中的细胞核蛋白。从 10 毫升从健康成年志愿者那里新鲜采集的血液开始。

2 毫升 6% 糊精 T 500 溶液移液到 15 毫升锥形离心管中。然后加入 10 毫升血液，将试管倒置 2 或 3 次，混合，并在新鲜的 15 毫升锥形离心管中静置 45 分钟，让红细胞在重力作用下沉降。放入 5 毫升 FI fial 包装。

收获在沉淀的红细胞上方形成的富含白细胞的血浆。小心地将其分层在 fial 包的顶部形成两个阶段，在 4 摄氏度下以 516 Gs 离心 20 分钟。去除上清液，将试管敲击到架子上，使细胞沉淀破碎。

然后将细胞重悬于 10 毫升冷 PBS 中。将细胞悬液转移至 50 mL 锥形离心管中，并在 4 摄氏度下以 290 Gs 离心 5 分钟。像以前一样打破细胞沉淀，并向碱液红细胞中加入 10 毫升冷低渗溶液。

轻轻旋转试管 1 分钟，混匀。接下来，加入 10 毫升冷高渗溶液混合物并储存在冰上。现在通过离心沉淀中性粒细胞后计数细胞。

我们将 PMN 悬浮在每毫升 10 至 7 个细胞。在冷 PBS 中，将细胞保持在冰上。将 100 μL PMN 悬浮液分装到 1.5 mL einor 管中。

然后以 10 μg/mL 的浓度加入相应的单克隆抗体，并在冰上孵育 15 分钟。要洗涤细胞，请加入 1 毫升冷 PBS 离心机并吸出上清液。然后轻轻打破细胞沉淀并用 PBS 再洗涤两次。

要去除未结合的抗体，将洗涤后的 PMN 重新悬浮在相同初始体积的温 PBS 中，每毫升含有 60 μg go 抗缪斯 IgG，在 37 摄氏度下孵育 1 至 20 分钟，具体取决于感兴趣的核因子。现在加入 1 毫升冷 PBS 离心沉淀细胞后，去除 snat 并立即在干冰乙醇浴中冷冻细胞沉淀。对于每个样品，从干冰套装乙醇浴中取出试管，擦干净并复苏。

将冷冻的 PMN 颗粒悬浮在 100 微升冷低渗溶液中。将所有样品置于冰上以监测样品的细胞核完整性。用 trian blue 对细胞核悬浮液的 Eloqua 进行染色。

如果细胞核悬浮液包含许多完整的细胞或碎片，最好丢弃制剂并从另一个样品开始程序。通过离心沉淀细胞核后，非常小心地去除上清液，然后在 100 微升冷的 4% 多聚醛溶液中固定细胞核，并在冰上孵育细胞核。沉淀细胞核后，小心地在 100 μL 冷渗透缓冲液中取出 snat，并将样品在冰上孵育 10 分钟。

然后通过离心收获透性细胞核。此时，细胞核沉淀不能很好地附着在管的底部。建议再次 centrif future。

如果沉淀松散为了阻断非特异性结合位点，我们将细胞核悬浮在 500 微升冷的 4% 胎牛血清的 PBS 溶液中，并在冰上孵育 20 分钟。通过离心沉淀细胞核，然后重悬细胞核和 100 微升含有 4%FBS 和每毫升 2.5 微克针对目标核因子的单克隆抗体的冷 PBS。将样品在冰上孵育 20 分钟，用 500 微升含 4% FBS 的冷 PBS 洗涤样品两次后，我们将细胞核悬浮在 100 微升含有 4%FBS 和 10 微克毫升相应 FZ 标记的二抗的冷 PBS 中，两次洗涤后在冰上孵育 20 分钟，将细胞核重新悬浮在 400 微升冷的 4% Paraldehyde PBS 溶液中。

在流式细胞仪（如 FACT Scan 或类似设备）中分析免疫标记的细胞核。将采集设置调整为 10 的对数尺度的两个 FSC 到负一个对数尺度的 SSC，196 和采用图中的门核。每个样品采集 10， 000 个细胞核。

然后通过 FL 单通道以 400 的对数刻度设置来分析 fitsy 染色核的荧光。这种 PMN 纯化方法通常提供纯度大于 95% 的未刺激的中性粒细胞，从 PMN 细胞核中以高产量分离，分离到细胞核中，可以很容易地识别为与流式细胞仪中完整 PMN 不同的群体，刺激时带有点图。通过交联 β 1 整合素 NF kappa B 被翻译成细胞核，并且核 NF kappa B 的增加被检测为荧光的增加。

同样，通过交联 β 2 整合素刺激 PMN 也诱导 NF κ B 激活，如荧光增加所示。该方法的灵敏度允许检测核因子水平的微小变化，以下事实证明了这一点：结合细胞外基质蛋白（如纤连蛋白）的 β 1 整合素比 β 2 整合素诱导更强的 NF κ B 激活，后者与其他细胞上的粘附分子结合。这种方法具有极大的灵活性，因为可以使用许多不同的荧光染料，并且因为它允许从不同的细胞类型制备细胞核，因此将这种简单而经济的方法用于涉及各种细胞类型细胞核中蛋白质水平变化的信号转导研究。