Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

O objetivo geral deste procedimento é rastrear o transporte axonal retrógrado do fator neurotrófico derivado do cérebro ou BDNF por imagens ao vivo. Isso é feito primeiro montando câmaras microfluídicas em lamínulas revestidas de polilisina. Na segunda etapa, os neurônios do hipocampo E 18 dissociados de ratos são dissecados e plaqueados no compartimento do corpo celular da câmara microfluídica.

Em seguida, os neurônios são cultivados para permitir a extensão dos axônios através dos micro sulcos para o compartimento axonal da câmara. Na etapa final, o ponto quântico marcado como BDNF é adicionado ao compartimento do axônio. Em última análise, a microscopia de fluorescência pode ser usada para avaliar o movimento do BDNF dentro dos axônios do neurônio do hipocampo.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a marcação B-D-F-E-G-I-P ou BDFM cherry, é que a marcação do BDF com ponto quântico permite a imagem de luz de um único dímero BDF dentro dos axônios, demonstrando que o procedimento será, deve ser. Desenhe um ponto de postagem dos meus três esquerdos, comece lavando à mão as câmaras microfluídicas em 1% aox, seguido por três enxágues de 30 minutos em água mili Q. Em seguida, depois de lavar as câmaras à mão em etanol a 70%, coloque-as para secar em um parapeito em uma capela de fluxo laminar, esterilize ambos os lados das câmaras sob luz ultravioleta por 20 minutos e, em seguida, armazene as câmaras irradiadas em um prato estéril de 15 centímetros selado com parapeito em temperatura ambiente.

Em seguida, mergulhe 24 por 40 milímetros. A tampa de vidro número um desliza em ácido clorídrico a 10% durante a noite em um rotador, seguida por três lavagens de 30 minutos com água após a última lavagem. Esterilize cada lamínula com um mergulho em 100% de etanol, seguido de queima em um bico de bunsen e armazene-os secos em uma placa de Petri estéril em temperatura ambiente.

Para revestir as lamínulas, coloque-as em uma placa de cultura de 15 centímetros e, em seguida, coloque 0,7 mililitros de 0,01% de lisina L poli. Após uma incubação de uma hora na capa de cultura de tecidos, enxágue as lamínulas três vezes novamente com água estéril e, em seguida, seque-as com vácuo e coloque-as em uma placa de cultura de seis centímetros. Em seguida, coloque uma das câmaras esterilizadas com o lado da micro ranhura voltado para baixo em uma lamínula revestida de poli L lisina.

Tomando cuidado para não tocar nas micro ranhuras e use uma ponta de micropipeta para pressionar suavemente a câmara e selar firmemente a câmara microfluídica montada. Agora coloque dois ratos E 17 a E 18 Hippo Campi em um tubo cônico de 15 mililitros contendo dois mililitros de tampão de dissecção e enxágue os tecidos três vezes com cinco mililitros de tampão de dissecção de cada vez. Em seguida, remova o máximo possível da lavagem e adicione 900 microlitros de tampão de dissecção fresco para digerir o tecido.

Em seguida, adicione 100 microlitros de 2,5% de tripsina aos tecidos e coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius. Após 10 minutos de digestão, adicione 100 microlitros de DNA e use uma pipeta de vidro PE polido a fogo para tritar suavemente os tecidos para cima e para baixo cinco a 10 vezes imediatamente após a mistura. Tempere a tentina com dois mililitros de meio de plaqueamento e deixe os detritos assentarem no fundo do tubo por cinco minutos na capa de cultura de tecidos.

Em seguida, transfira cuidadosamente dois mililitros de sobrenadante para um tubo cônico estéril limpo de 15 mililitros e gire as células resus. Suspenda o pellet em 50 microlitros de meio de revestimento e, após a contagem, carregue 15 a 20 microlitros da suspensão celular em um compartimento da câmara microfluídica. Incube a câmara por 10 minutos para permitir que as células se prendam à lamínula e, em seguida, adicione mais mídia de revestimento para preencher os dois compartimentos da câmara.

Após um dia de incubação, substitua o meio de plaqueamento por meio de manutenção no corpo celular e nos compartimentos do axônio. No terceiro dia, os axônios dos neurônios do hipocampo começam a cruzar os microsulcos que atingem o compartimento do axônio entre os dias cinco e sete. Durante esse período, substitua metade do meio de cultura por um novo meio de manutenção a cada 24 a 48 horas antes da imagem ao vivo do transporte axonal BDNF marcado com quantum.

Enxágue bem ambos os compartimentos da câmara microfluídica com meio neurobasal livre de soro livre de BDNF a cada 30 minutos por duas horas durante a depleção de BDNF, incube dímero de BDNF mono biotinilado de 50 nano molares com quantum de 50 nano molares. Faça 6 5 5 conjugados de strippin em meio neurobasal no gelo por 60 minutos. Em seguida, substitua o meio no compartimento do axônio por 300 microlitros de BDNF marcado com ponto quântico por quatro horas a 37 graus Celsius para minimizar a difusão do BDNF marcado com ponto quântico no compartimento do corpo celular.

É muito importante manter sempre um nível de meio mais alto no compartimento do corpo celular do que no compartimento do axônio no final do microscópio de incubação, aquecimento e invertido, equipado com uma objetiva de óleo de 100 x e uma câmara ambiental a uma temperatura constante de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono enquanto o equipamento está aquecendo. Lave o ponto quântico não ligado rotulado BDNF da câmara microfluídica e, em seguida, use um conjunto de cubos de excitação e emissão Texas red para visualizar o sinal do ponto quântico 6 5 5. Por fim, use uma câmera CCD para capturar imagens de lapso de tempo nos axônios médios na velocidade de um quadro por segundo por um total de dois minutos.

Use micro sulcos sem axônios que não tenham QD como controle de infiltração e analise o transporte de BDNF usando o software de análise de imagem apropriado em imagens de lapso de tempo de transporte de sinal BDNF rotulado com ponto quântico sinais de ponto quântico são observados na maioria dos micro sulcos com axônios, enquanto nenhum sinal quântico é visto nos micro sulcos sem axônios indicando pouca ou nenhuma difusão do sinal de ponto quântico do compartimento do axônio para o compartimento do corpo celular aqui. Um segmento de 80 micrômetros de comprimento de um axônio do neurônio do hipocampo foi registrado fluorescentemente por 100 segundos. Um total de seis.

Os sinais quânticos de BDNF foram claramente observados durante a imagem, com três observados movendo-se unidirecionalmente em direção ao corpo celular. Observou-se que um sinal se moveu suavemente para o corpo celular cruzando todo o campo em aproximadamente 70 segundos. Outro foi observado se movendo em uma direção retrógrada nos primeiros 20 segundos, mudou para o movimento antrógrado por 10 a 20 segundos e depois mudou de direção novamente em direção ao corpo celular nos últimos 20 segundos.

O terceiro evento também foi observado para se mover em uma direção retrógrada, mas depois para pausar por aproximadamente 20 segundos durante o meio do movimento. Neste primeiro gráfico de carrilhão representativo do transporte BDNF rotulado de ponto quântico, o ponto quântico rotulado BDNF moveu-se rápida e suavemente em direção ao corpo celular cruzando o campo de 80 micrômetros em aproximadamente 60 segundos. Com pausas muito breves neste segundo cronógrafo, o BDNF quântico viajou aproximadamente 50 micrômetros em 120 segundos em uma direção retrógrada com pelo menos três segmentos de pausas mais longas.

Finalmente, os gráficos de dispersão medem a velocidade de movimento, a velocidade média e o tempo de pausa de cada ponto quântico rotulado BDNF. As velocidades de movimento do ponto quântico rotulado BDNF foram relativamente rápidas, variando de 0,47 a 1,97 micrômetros por segundo, com uma média de 1,06 mais ou menos 0,05 micrômetros por segundo. Por causa da pausa do BDNF durante o transporte, a velocidade média foi muito menor do que a velocidade de movimento com uma média de 0,48 mais ou menos 0,03 micrômetros por segundo com uma duração média de pausas de 15,88 mais ou menos 1,30 segundos após o desenvolvimento.

Essa técnica permite que pesquisadores no campo da neurociência explorem o tráfego de neurotrofina e receptores em neurônios saudáveis e doentes.