Name: 无线射频识别和动作感应视频高效地自动Unrewarded选择行为的记录由大黄蜂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 了解如何利用无线射频识别和动作感应视频技术自动记录大黄蜂在人造花朵上的选择行为。该方法可生成包含30万次访问记录的大型数据库，帮助研究人员精确研究蜜蜂觅食行为的个体差异起源。

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本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会向 CMSP 提供的资助支持。我们感谢 Koppert Canada 提供的熊蜂蜂群捐赠。本文部分内容（包括部分图表）已发表于 自然科学11，并经施普林格授权在此转载。

渥太华大学动物护理委员会已批准我们的实验方案，该方案明确了与蜜蜂接触人员的安全操作规程。
1. 测试环境准备
<ol>
	<li>准备一个 2 m × 2 m × 2 m 的空置空间（隔离房间或金属网覆盖的飞行笼）。 
	注意：如果选择房间作为测试场所，需确保蜜蜂无法通过窗户、门缝和空气交换管道逃逸。</li>
	<li>添加小的入口点（例如，在飞行笼上设置直径约2 cm的孔洞，供蜜蜂无障碍进出测试区域。设计一种可封闭通道的机制，以便在设备维护和配置期间阻止蜜蜂进入测试区域。 
	注意：我们使用了 Bombus impatiens Cresson 工蚁</li>
	<li>使用连接器将一个或两个蜂群盒连接到测试区域。确保死蜂不会堵塞连接器。 
	注意：此处使用两种连接结构：一种是带有玻璃顶盖的木质“桥”形结构，另一种是金属丝网管。这两种结构易于清洁，并能为蜜蜂提供抓附力。</li>
	<li>在测试区域内放置两个人工花 holder。
	<ol>
		<li>将花架放置在测试区域的中心，或将其固定在墙上。</li>
		<li>使用美纹纸胶带将一个“2k6 head” RFID读取器连接到人工花的圆柱部分顶部（参见 图1 用于定位）。使用一个1.2米高的木制支架来固定人工花。 
		注意：支架顶部应设有可连接人造花的固定装置。参见 图2 示意图</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在测试区域安装高频（至少 200 Hz）荧光灯照明装置，以提供充足的光照。使用高频电子镇流器，确保灯光闪烁频率高于熊蜂的视觉临界融合频率6. 
	注意：此处使用12根日光荧光灯管，为2 x 2 x 2 m的空间提供约1,200 Lux的光照强度。</li>
</ol>
<img alt="RFID读取器漏斗；示意图显示了用于优化信号方向的前视图、顶视图和侧视图。" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. RFID人工花设计。 实验1中使用的带RFID功能的人工花的示意图。RFID读取器位于花中心的开口圆筒顶部。刺激模式与位置：a. 外周-同心型，b. 中心-同心型，c. 外周-辐射型，以及d. 中心-辐射型。该图改编自Orbán et al.11。
<img alt="花朵刺激实验的展示架设置示意图；包含夹子附件细节。" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 刺激展示架。 示意图展示了人工花朵刺激架及其附件夹的设计。附件夹被粘接到人工花朵上，用于将刺激物快速安装和拆卸于刺激架上。该配置用于对运动敏感的视频实验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52033/52033fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
2. 大黄蜂蜂群准备
<ol>
	<li>商业订购的蜂群到达后，将蜂群箱连接到飞行笼。</li>
	<li>提供花粉（由蜜蜂从多种植物采集）和糖水（按体积比1:1混合） 随意摄取 直到测试阶段开始为止。
	<ol>
		<li>将1升水煮沸，加入等体积的糖，混匀以配制糖水溶液。</li>
		<li>从养蜂人或商业熊蜂种群供应商处购买花粉。使用研钵和研杵将花粉研磨，并根据需要加入蜂蜜和水，混合制成湿润的糊状物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验开始后，每天提供 15–40 ml 糖水（用量与蜂群规模成正比），并持续提供花粉 随意摄取根据蜜罐中的储蜜量调整糖水量。 
	注意：保持较低的食物储存水平可促使工蚁离开巢穴去寻找更多食物。</li>
	<li>让蜜蜂进入测试环境 通过 连接器结构，如步骤1.3所述。 
	注意：实验过程中，蜜蜂可在蜂巢与测试环境之间自由移动。</li>
</ol>
3. 射频识别观察前的准备
<ol>
	<li>蜂群到达后立即开始将 RFID 标签粘贴到工蜂的胸部，并在整个实验过程中持续进行，因为会有新的工蜂羽化出现。</li>
	<li>粘贴技术
	<ol>
		<li>在初次标记时，将所有工蜂分别放入独立容器中。将工蜂置于冰箱中冷却约 1 小时（约 7 °C），以减缓其活动能力。 
		注意：在标记前预先冷却工蜂有助于控制具有攻击性的蜂群，从而最大限度地降低被蜇伤的风险。</li>
		<li>使用标记装置和无毒胶水（由标签供应商提供），将 RFID 标签粘贴至工蜂胸部。应在工蜂刚羽化、仍处于白色未成熟阶段（尚不具备飞行能力）时即进行 RFID 标签粘贴。</li>
		<li>在将工蜂放回蜂群前，至少等待 10 分钟，以确保工蜂无法自行移除 RFID 标签。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>淘汰在白色未成熟阶段未被标记的工蜂，或已丢失 RFID 标签的工蜂（可通过胸部残留胶水或裸露斑块识别）。 
	注意：这些蜜蜂可能已有过离开蜂群的外部活动经历。</li>
	<li>RFID 读取器软件
	<ol>
		<li>使用个人计算机（PC）配置 RFID 读取器软件。将操作系统的日期格式更改为 yyyy-mm-dd hh:mm:ss，以确保下载的 RFID 数据正确编码。使用 C++ 编程语言修改 RFID 读取器配套提供的程序，使 RFID 读取器中的数据能够以逗号分隔值（CSV）格式导出。</li>
		<li>通过 RS-232 转 USB 连接线将 RFID 读取器连接至计算机。在读取器达到存储容量（最多 32,000 条记录）之前，定期下载数据。使用 RFID 读取器记录日期、时间以及与每个标签关联的十三位唯一字符串。将下载的 CSV 文件导入关系型数据库管理系统（RDBMS）中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于射频识别读取器的人工花制备
<ol>
	<li>从当地工艺品商店购买蓝色和黄色的烘焙粘土。</li>
	<li>制作一个直径为 1.5 cm 的蓝色圆柱体，并在其侧面切出一个 1.5 cm × 3 cm 的孔。 
	注意：圆柱体侧面的孔用于放置 RFID 读取器。</li>
	<li>制作一个一端直径为 8 cm、另一端直径为 1.5 cm 的蓝色圆锥体。</li>
	<li>将圆柱体与圆锥体合并。</li>
	<li>制作一根长 20 cm、宽 0.5 cm 的黄色粘土条。</li>
	<li>将黄色粘土条裁剪至合适尺寸，并嵌入蓝色圆锥体和圆柱体中。 
	注意：放射状图案需要 5 cm 长的直线，同心圆状图案需要 4–8 cm 长的环形线条。</li>
	<li>在 130 °F 下烘烤粘土，直至完全硬化。</li>
</ol>
5. 运动敏感视频记录观察前的准备
<ol>
	<li>蜂群到达后，立即开始将彩色塑料数字标签粘贴在工蜂的胸部，并在实验过程中持续为新羽化的工蜂粘贴标签。</li>
	<li>初次标记时移除所有工蜂，以确保每个个体均获得编号标签。标记后立即将工蜂放回蜂群。 
	注意：与射频识别标签相比，编号标签更难被工作人员移除。</li>
	<li>当新工蜂羽化时，在其羽化初期立即进行标记。标记频率随蜂群生活周期阶段而变化，但平均约为每2–3天标记7–10只工蜂。未在其羽化初期完成标记的工蜂应予以淘汰，因其可能已不再具备对花朵的陌生性。</li>
	<li>标记数量少于需标记工人的系统 
	注意：如果实验持续数月且涉及多个蜂群，则可能出现可用标签编号不足的情况。共有约7种可区分的标签颜色，每种颜色的标签编号从1到99，最多可同时标记693只工蜂。持续3个月、使用3至4个蜂群的实验，工蜂总数将远超过693只，但不会同时存活。
	<ol>
		<li>确保数字标签系统化放置（例如，标签编号的上端始终与蜜蜂头部对齐），尤其是以下数字：6、9、66、69、99。</li>
		<li>移除死亡的工蜂，并将其标签编号记录为“已释放”。建立并维护一个数据库，记录处于“可用”或“正在使用”状态的标签编号及颜色，以确保同一标签不会同时用于多只蜜蜂。 
		注意：可通过向已有的颜色添加其他颜色来生成额外的标签组合。例如，使用记号笔在蓝色标签上添加一个黄色圆点即可创建新的组合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视频数据处理
	<ol>
		<li>在每个花卉展示区前方、测试环境外部放置两台网络协议（IP）摄像机（图像分辨率至少为100万像素）（参见 图3). 
		<img alt="Growth chamber setup, artificial lighting, plant cultivation, controlled environment, horticultural study." src="/files/ftp_upload/52033/52033fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
		图3. 测试环境。 测试环境的照片，前景为两台前置摄像机，天花板上的摄像机位于灯具之间，房间中央为放置示例刺激物的刺激物支架。 
		注意：在IP摄像机与人造花之间放置玻璃隔板，可确保人造花清晰可见。IP摄像机可置于距离刺激物最远5 m的位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52033/52033fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a></li>
		<li>将标准镜头更换为1.8 mm变焦镜头。这些镜头可对人工花朵实现足够的变焦和聚焦。</li>
		<li>在人造花正上方放置另一台IP摄像机，聚焦于人造花前方1–2米的区域。该摄像机用于记录悬停和触角探测行为。</li>
		<li>将IP摄像机连接到电脑 通过 一个二级网络接口控制器（NIC）和一个以太网集线器。</li>
		<li>将计算机的动态主机配置协议（DHCP）设置为向IP摄像机动态分配IP地址。</li>
		<li>在计算机上配置文件传输协议（FTP）服务器。</li>
		<li>配置一个FTP客户端进程，以自动将视频片段存放到计算机上。</li>
		<li>将IP摄像机设置为每次检测到运动时录制一段10秒的视频片段。 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>视频片段分析
	<ol>
		<li>打开视频片段，使用任意视频播放器逐帧查看内容。</li>
		<li>记录蜜蜂塑料标签编号、记录日期和时间至电子表格或关系型数据库管理系统。在此，将蜜蜂腿部接触人工花定义为一次着陆。 
		注意：舍弃受社会因素影响的选择（例如当另一只蜜蜂停留在刺激物上时的降落行为）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 用于视频观察的人工花制备
<ol>
	<li>使用图形编辑软件设计视觉属性。 
	注意：确保打印出的图案可以被裁剪并折叠成一个圆锥体。通过几何计算生成剪裁形状，以制作出直径为 8 cm 的圆锥体。</li>
	<li>打印、裁剪并将视觉属性折叠成圆锥体。</li>
	<li>将固定夹粘贴到刺激物上（见 图 2）。</li>
</ol>
7. 统计学分析
<ol>
	<li>在两个实验中，为每只蜜蜂计算选择比例（例如，某只蜜蜂在总共 y 次选择中，对一种花选择了 x 次）。</li>
	<li>使用重复的适合度检验7分析这些比例。 
	注意：重复的 G 检验会计算一个异质性值（Gh），用于表示重复组（即 每只蜜蜂）之间的变异程度，以及一个合并值（Gp），用于表示所有选择比例的整体显著性。G 值在显著性检验中与 χ2 值进行比较。</li>
</ol>
8. 刺激呈现序列
<ol>
	<li>将人工花固定在测试区域内的花托上。定期更换所展示刺激物的组合及其位置（例如， 每日）以避免位置效应。</li>
</ol>
9. 研究终止
<ol>
	<li>将菌落置于 -10 °C 超低温冰箱中 3 天，以杀死蜜蜂。</li>
</ol>

<ol><li>Plowright, C. M. S., Evans, S. A., Leung, J. C., Collin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preference+for+symmetry+in+flower-na%C3%AFve+and+not-so-na%C3%AFve+bumblebees%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Motiv%22%5BJournal%5D)">The preference for symmetry in flower-naïve and not-so-naïve bumblebees.</a> Learn. Motiv. 42 (1), 76-83 (2011).</li>
<li>Streit, S., Bock, F., Pirk, C. W. W., Tautz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+life-long+monitoring+of+individual+insect+behaviour+now+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Zool%22%5BJournal%5D)">Automatic life-long monitoring of individual insect behaviour now possible.</a> Zool. 106, 169-171 (2003).</li>
<li>Chittka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+human+are+insects%2C+and+does+it+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Formosan+Entomol%22%5BJournal%5D)">How human are insects, and does it matter.</a> Formosan Entomol. 31, 85-99 (2011).</li>
<li>Lihoreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radar+tracking+and+motion-sensitive+cameras+on+flowers+reveal+the+development+of+pollinator+multi-destination+routes+over+large+spatial+scales%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Radar tracking and motion-sensitive cameras on flowers reveal the development of pollinator multi-destination routes over large spatial scales.</a> PLoS Biol. 10 (9), e1001392(2012).</li>
<li>Brodbeck, D. R., Shettleworth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matching+location+and+color+of+a+compound+stimulus%3A+Comparison+of+a+food-storing+and+a+nonstoring+bird+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Psychol.+Anim.+Behav%22%5BJournal%5D)">Matching location and color of a compound stimulus: Comparison of a food-storing and a nonstoring bird species.</a> J. Exp. Psychol. Anim. Behav. 21 (1), 64-77 (1995).</li>
<li>Srinivasan, M., Lehrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+resolution+of+colour+vision+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Temporal resolution of colour vision in the honeybee.</a> J. Comp. Physiol. A. 157 (5), 579-586 (1985).</li>
<li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Freeman, W. H. , New York, NY. (2011).</li>
<li>Lunau, K., Fieselmann, G., Heuschen, B., van de Loo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+targeting+of+components+of+floral+colour+patterns+in+flower-na%C3%AFve+bumblebees+%28Bombus+terrestris%3B+Apidae%29.+%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Visual targeting of components of floral colour patterns in flower-naïve bumblebees (Bombus terrestris; Apidae). </a> Naturwissenschaften. 93 (7), 325-328 (2006).</li>
<li>Lehrer, M., Horridge, G. A., Zhang, S. W., Gadagkar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+vision+in+bees%3A+Innate+preference+for+flower-like+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Shape vision in bees: Innate preference for flower-like patterns.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 347 (1320), 123-137 (1995).</li>
<li>Thompson, E. L., Plowright, C. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+images+may+or+may+not+represent+flowers%3A+picture-object+correspondence+in+bumblebees+%28Bombus+impatiens%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Cognit%22%5BJournal%5D)">How images may or may not represent flowers: picture-object correspondence in bumblebees (Bombus impatiens).</a> Anim. Cognit. , (2014).</li>
<li>Orbán, L. L., Plowright, C. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+flower-like+and+non-flower-like+visual+properties+on+choice+of+unrewarding+patterns+by+bumblebees%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">The effect of flower-like and non-flower-like visual properties on choice of unrewarding patterns by bumblebees.</a> Naturwissenschaften. 100 (7), 621-631 (2013).</li>
<li>Leonard, A. S., Papaj, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X%E2%80%9D+marks+the+spot%3A+The+possible+benefits+of+nectar+guides+to+bees+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Funct.+Ecol%22%5BJournal%5D)">X” marks the spot: The possible benefits of nectar guides to bees and plants.</a> Funct. Ecol. 25 (6), 1293-1301 (2011).</li>
</ol>

作者无任何竞争性经济利益。

射频识别（RFID）技术能够轻松且高精度地研究数百只个体工蜂，但其记录的行为特征与人工观察或视频记录存在差异。RFID记录的选择行为可被定义为花卉探索行为。与其他研究中使用的选择标准相比，这一定义是一种更为严格的选择偏好判定标准，例如接近8、进入迷宫臂9,10、触角反应8或降落在特定图案上11,12。为了比较不同选择行为定义的有效性，并验证RFID方法在无奖励行为研究中的适用性，实验2中通过视频记录观察了蜜蜂的降落行为。各类选择指标并不等同：RFID通过花卉进入所测定的选择标准表明，图案位置这一视觉特征对蜜蜂选择更为重要；而视频数据则表明，图案类型这一视觉特征对蜜蜂选择更为关键。
研究非习得性选择行为的一个普遍挑战在于，很难吸引未接触过花朵且未经训练的蜜蜂前往不提供花粉或花蜜的人工花朵。事实上，以往许多实验不得不在测试环境中先对蜜蜂进行训练，而所使用的刺激物被认为与测试时的选择行为无关。射频识别（RFID）和运动敏感视频记录技术通过实现全天24小时的连续记录，无需研究人员持续监控，并将样本量从15至20只蜜蜂增加到数百只，从而克服了这一障碍。尽管未经训练的蜜蜂在无奖励条件下的选择行为仍属罕见，但这些新的实验设计参数使得观察此类行为成为可能。
这两种技术带来的其他改进包括消除样本偏差、提高外部效度，以及追踪个体差异。当仅研究一个蜂群中大约十几个蜜蜂时，可能会引入样本偏差。即使在同一蜂群内，不同工蜂之间的行为特征存在显著差异，但如果只观察那些在特定时间恰好“配合”研究人员的个体，则这些差异很可能被忽略。在一个包含300只或更多蜜蜂的蜂群中，仅研究其中的15至20只蜜蜂，仅占蜂群总数的约5%，此时样本偏差可能十分显著。通过标记并观察所有工蜂的行为，可以彻底消除这一问题。同时，也可灵活调整同时呈现的刺激选项数量。由于技术原因，我们在实验中采用了二选一的设计，但单选项或多项选择的设计同样是可行的。
从外部效度来看，传统上在实验室环境中研究蜜蜂具有高度的人工性，这限制了研究结果的可推广性。例如，研究人员必须亲自参与数据采集，蜜蜂需要逐一在测试环境中进行觅食，且测试仅限于较短的时间窗口内进行。本文所描述的新技术通过实现无人监督和无时间限制的观察，消除了这些人为限制。最后，由于能够区分某一选择行为是由单只蜜蜂重复作出，还是由多只蜜蜂分别作出，因此可以记录个体间的行为差异。
运动敏感型高空间分辨率摄像机在刺激设计的灵活性方面优于射频识别（RFID）技术：只要能在至少若干视频帧中捕捉到受试对象的识别信息，视觉刺激的外观几乎可以是任意形状或形式。与处理 RFID 数据相比，视频处理略为耗时，因为识别信息需要研究人员人工读取，这要求对每个视频片段进行手动检查。如果视觉刺激设计能够满足 RFID 读取器的限制条件即， 蜜蜂身上的RFID标签必须接近RFID读取器至少3–4 mm，因此在自动化大规模数据采集方面，RFID技术更具优势。而定性研究可能仍将以视频分析为主。如本实验所示，RFID读取器能够积累大量无需人工编码的数据。由于每种技术各有略微不同的优势，未来它们有望以互补的方式联合使用。
这两种技术的未来可能在于对罕见行为进行精确量化。例如，未来应用的一个明确方向是在温室及其他更接近自然的环境中采用这些技术。自然性与实验控制的结合将有助于回答以往无法解决的科学问题。总体而言，这些技术为以严谨且高效的方式观察行为提供了两种新途径。射频识别（RFID）与运动敏感视频技术不仅对研究传粉者或昆虫的研究人员具有重要意义，而且也可能吸引其他行为科学研究者。

研究大黄蜂和蜜蜂的非习得性选择行为时，一个关键问题是：从未接触过花朵且未经训练的工蜂通常不会主动进入可用于测量其偏好的测试空间。因此，许多研究人员不得不采用一种并不理想的技术：预先训练工蜂在测试空间内从研究者认为与实验刺激不同的、表面上中性的刺激物处取食。然而，最近的实验表明，那些原本被认为中性的刺激（即，不会影响测试阶段后续选择行为的刺激）实际上以意想不到的方式影响了蜜蜂的偏好1。包含射频识别（RFID）2和运动敏感视频记录的自动化系统可能为解决这一问题提供了机会。本研究的目的有两个：（1）主要目的是丰富关于大黄蜂对花卉非习得偏好的文献；（2）次要目的是评估两种由不同自动化记录设备所记录的选择测量系统。
本研究中采用了两种自动化系统3来观察未经学习的选择行为：射频识别（RFID）系统和运动敏感视频记录系统。这两种系统的关键要素在于：选择行为不会受到奖励，且可以操控不同视觉线索的呈现。运动敏感视频（高清，分辨率为1 mp）不仅能够持续观察在飞行室内自由探索的工蜂，而且对于高效记录相对罕见的事件至关重要4。
实验1中的研究问题涉及不同视觉属性在共同呈现时如何相互作用。本研究旨在探讨在图案类型背景下图案位置的相对重要性。采用2 x 2设计，径向（即，日晕）和同心（即，靶心）图案类型被置于人工花的中心或外围位置（参见 图1 （以刺激物示例）。这些特制的人工花刺激物内置有射频识别（RFID）读取器，熊蜂则携带可识别的RFID标签，使我们能够记录每一只进入人工花刺激物的标记工蜂。RFID观测的原理是：读取器装置（内置于人工花中）以无线电频率（本例中为13.56 MHz）发送信号，当被动式标签存在时，信号会被调制。读取器可检测并记录这些信号调制，由于不同标签引起的调制略有差异，因而可实现对每个标签的唯一识别。
实验2的问题有三个方面。第一，通过射频识别（RFID）测量的进入花朵行为与通过视频记录测量的着陆行为，是否可作为等效的选择标准？选择行为在不同阶段被测量（视频记录以着陆为指标，RFID以进入花朵为指标），这可能导致偏好程度的测量结果存在差异。第二，中枢 与 外周定位？目前尚不清楚，若提供两种处于不同位置的辐射模式组合，工作人员是否会倾向于选择中心模式（参见 图4b）。第三，模式位置的相对重要性是什么 与 图案类型？换句话说，大黄蜂会降落在偏好图案类型的图案上，还是偏好位置的图案上？蜜蜂可能更喜欢中心辐射状图案而非外围同心圆图案，但这种偏好可能是由于图案类型本身，或是由于其位于中心的位置所致。在本实验中，两个变量被进行直接对比5 （参见 图4c，d).
在实验2中，我们使用对运动敏感的视频记录装置，对类似花朵的刺激物进行记录。人工花朵被放置在一个飞行笼内，运动敏感的高清摄像机从前侧和上方对准这些花朵。具体而言，两台摄像机被定位，以便分别捕捉测试空间中两个刺激物的正面视角。另外一台摄像机被放置在两个刺激物之间，从上方记录悬停行为，并同时捕捉来自两个人工花朵的行为。通过可读取的数字标签对熊蜂进行个体识别，这些标签可在高清视频片段中辨认。观察的行为包括悬停、触角接触和降落行为。

<table><tbody><tr><td>微型 mic3 标签</td><td>Microsensys</td><td>mic3 TAG 64 bit RO</td><td>用于粘贴到蜜蜂上的 RFID 标签</td></tr><tr><td>RFID 读取器 2k6 头</td><td>Microsensys</td><td>2k6</td><td>安装在人工花朵中的 RFID 读取器</td></tr><tr><td>IP 摄录机</td><td>Vivotek</td><td>IP8161</td><td>运动敏感型视频记录仪</td></tr><tr><td>Opalith Plattchen 编号标签及无毒胶水</td><td>Beeworks.com</td><td>n/a</td><td>用于粘贴到蜜蜂上的编号标签</td></tr><tr><td>用于研究的大黄蜂蜂群</td><td>Koppert 加拿大公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人工花朵</td><td>无</td><td></td><td>由校园生物实验室开发</td></tr><tr><td>人工花朵支架</td><td>无</td><td></td><td>由校园生物实验室开发</td></tr><tr><td>飞行室</td><td>无</td><td></td><td>由校园生物实验室开发</td></tr><tr><td>配备 Windows 系统的笔记本电脑</td><td>通用硬件 / 微软软件</td><td></td><td>用于下载 RFID 数据</td></tr><tr><td>RS 232 转 USB 转换器</td><td>通用</td><td></td><td>用于将 RFID 读取器连接至计算机</td></tr><tr><td>台式计算机</td><td>IBM</td><td></td><td>用于传输视频数据</td></tr><tr><td>第二块网络接口卡（NIC）</td><td>通用</td><td>10/100M NIC PCI</td><td>用于传输视频数据</td></tr><tr><td>网络集线器</td><td>通用</td><td>4端口</td><td>用于传输视频数据</td></tr><tr><td>高精度镊子</td><td>SPI</td><td></td><td>用于将编号标签和 RFID 标签粘贴到蜜蜂上</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>通用</td><td></td><td>用于与水混合制成糖水</td></tr><tr><td>花粉</td><td>任一本地养蜂人</td><td></td><td>喂食大黄蜂</td></tr><tr><td>带推杆的标记笼</td><td>Beeworks.com</td><td></td><td>辅助标记过程</td></tr><tr><td>蜂蜜</td><td>通用</td><td></td><td>用于与水混合制成花粉糊</td></tr><tr><td>烘焙粘土</td><td>Sculpey</td><td></td><td>RFID 刺激物</td></tr><tr><td>粘土塑形工具</td><td>通用</td><td></td><td>RFID 刺激物</td></tr><tr><td>白纸</td><td>通用</td><td></td><td>视频刺激物</td></tr><tr><td>激光打印机</td><td>通用</td><td></td><td>视频刺激物</td></tr><tr><td>木材</td><td>通用</td><td></td><td>视频刺激物——用于制作固定夹</td></tr></tbody></table>

射频识别与运动感应视频高效自动化记录大黄蜂无奖励选择行为

Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

我们提出两种在封闭测试空间内观察大黄蜂选择行为的方法。第一种方法包括集成于人工花中的射频识别（RFID）读取器，这些人工花呈现不同的视觉线索，以及RFID标签（即，粘贴在熊蜂工蜂胸部的被动式应答器）已集成到人工花朵中，这些人工花朵能够呈现多种不同的视觉特征，例如颜色、图案类型和空间频率即，“图案的复杂程度”）以及对称性（本实验未对空间频率和对称性进行操控）。此外，这些视觉显示系统与自动化系统结合后，能够记录 无奖励的 和 未受训的 选择行为。第二种方法是使用运动敏感的高清摄像机记录蜜蜂在人工花朵上的选择行为。每只熊蜂的胸部都粘有数字标签，以便进行个体唯一识别。与RFID技术相比，该方法的优势在于，除了可观察着陆行为外，还能记录悬停和触角接触等其他偏好指标。这两种自动化方法通过支持更大规模的研究并考虑个体差异，提高了实验的控制性和内部效度。同时，由于蜜蜂可以自由进出测试环境，无需依赖现场研究人员的实时监控，外部效度也得到提升。与实时人工观察相比，这些自动化方法更具成本效益，且可能具有更低的误差率。

实验1：射频识别数据
该蜂群中的全部375名工蜂均被标记了RFID标签，其中318只工蜂（占85%）在研究期间曾进入飞行笼。共有197只工蜂（占离开蜂群工蜂的62%）访问了四种人工花朵刺激物中的至少一种。
选择的定义
定义一次选择为工蜂进入人工花朵（见图1）。我们将这种行为标记为“花朵探索”。该选择定义比文献中使用的选择定义更为严格，后者根据研究的不同，可能采用悬停、触角接触或降落的某种组合来判断。花朵探索是一个更严格的选择定义，因为它不仅要求蜜蜂通过悬停、触角接触和降落在刺激物上予以注意，还要求其对花朵进行探索。
数据管理
与其他方法相比，射频识别（RFID）技术能够收集大量数据。本实验共生成了310,221条记录。像MySQL这样的数据库程序对于存储如此庞大的数据量是不可或缺的工具，而用于提取研究问题答案的SQL查询同样至关重要。例如，一个需要明确的问题是如何定义一次“选择”。RFID读取器被设置为每1毫秒记录一次标签的存在，对于那些在人工花内停留数分钟甚至数小时的蜜蜂而言，这可能转化为数千条记录。我们将一次选择定义为持续时间至少为1毫秒的访问，但只有在当前连续记录序列被至少1分钟的间隔中断后，才会计为一次新的访问。
实验概述
对蜜蜂“初次测试阶段”的所有选择进行四次重复的拟合优度检验，以将选择比例与随机概率的理论值进行比较7。蜜蜂的初次测试阶段是指蜜蜂首次参与的测试条件。G检验结果显示，蜜蜂更倾向于中心位置（见表1）以及放射状图案类型。图4b显示，当同心圆图案位于中心、放射状图案位于外围时，图案偏好发生逆转。然而，若位置保持恒定，如图4a和d所示，则蜜蜂对放射状图案表现出偏好。图4表明，每种组合中蜜蜂首次选择各图案的相对比例与所有选择的总体比例相似。
<img alt="行为选择图；柱状图 a-d 显示选择结果；视觉目标；统计分析。" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. RFID 实验结果。 实验 1 中四种不同花朵组合下的选择频率。深棕色柱状图表示蜜蜂在初次接触阶段的所有选择（左侧 y 轴），浅棕色柱状图表示每只工蜂的首次选择（右侧 y 轴）。“所有选择”的模式与“首次选择”相似，但具有更高的统计效力。柱状图表明，图案的位置比图案类型更为重要。即使图案类型为原本较不偏好的同心圆图案，位于中心位置的图案仍更受偏好。星号表示选择比例与随机水平相比具有显著差异。注：* p &lt; .05，** p &lt; .01，*** p &lt; .001。本图改编自 Orbán et al.11。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">条件</td>
			<td colspan="3">合并</td>
			<td colspan="3">异质性</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gp</td>
			<td>df</td>
			<td>p</td>
			<td>Gh</td>
			<td>df</td>
			<td>p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中央-放射状 vs 中央-同心圆状</td>
			<td>3.96</td>
			<td>1</td>
			<td>0.047</td>
			<td>197.55</td>
			<td>41</td>
			<td>0.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>外周-放射状 vs 中央-同心圆状</td>
			<td>33.77</td>
			<td>1</td>
			<td>0.000</td>
			<td>210.81</td>
			<td>42</td>
			<td>0.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中央-放射状 vs 外周-同心圆状</td>
			<td>508.31</td>
			<td>1</td>
			<td>0.000</td>
			<td>345.78</td>
			<td>30</td>
			<td>0.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>外周-放射状 vs 外周-同心圆状</td>
			<td>7.42</td>
			<td>1</td>
			<td>0.000</td>
			<td>84.06</td>
			<td>24</td>
			<td>0.000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 射频识别数据的推断统计学 实验1。本表格经Orbán修改 等 (2013)11. Gp 指组比例与偶然概率之间存在显著偏差，且 Gh 指个体差异的测试即，异质性）。有关统计检验的完整细节，请参阅论文原文。
实验2：视频数据
在三次测试阶段中，共记录了四种条件下总计264次选择。表2展示了每个蚁群贡献的工蚁数量及选择次数。
选择的定义
视频数据可用于记录三种类型的选择行为：盘旋、触角探测和着陆。尽管这三种行为均可被观察到，但由于运动迅速，而分辨率较低或帧率较低的摄像机无法清晰记录，因此难以将盘旋和触角探测行为与具体的标签编号对应起来。必须使用高清摄像机（尽管我们当时未能获得此类设备，但理想情况下应使用高帧率摄像机以尽量减少图像模糊），以确保即使仅在少数几帧画面中出现的标签编号也能被准确识别。该方法还被用于将选择模式与RFID技术进行比较，后者用于检测花朵探索行为。
运动敏感性注意事项
成功开展实验的关键问题之一是运动敏感型摄像机的配置。摄像机的灵敏度过高会导致记录过多不切实际的数据，处理这些数据可能变得非常昂贵。例如，我们最初的摄像机会被建筑物内的常规振动所触发例如， 走廊上经过的人，空调 等等。），导致每记录150–200个视频片段仅获得1–2个有效数据点。另一方面，更为严重的问题是灵敏度过低的设置，可能导致关键数据遗漏。必须以相同方式配置所有摄像机，否则采样误差可能扭曲实验结果。
实验概述
四项重复的拟合优度检验发现，有三组比例显著偏离随机水平，一项总体比例无显著差异（见表3和图5）。(1) 图案类型具有重要影响：对中心-放射状图案的偏好显著高于中心-同心圆状图案（见表3）。(2) 放射状图案的位置影响较小：中心-放射状与外周-放射状组合的呈现与随机水平无显著差异。(3) 中心-放射状与外周-同心圆状组合表现出对中心-放射状图案的强烈偏好；而中心-同心圆状与外周-放射状组合则显著倾向于外周-放射状图案。图案因素优于位置因素。在所有四种组合中，个体差异均无显著性（见表3）。
<img alt="图案选择图；柱状图比较中心与辐射状图案；标注统计显著性。" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 运动敏感视频实验结果。 实验 2 中四种不同花朵组合下的选择频率。结果表明图案类型比图案位置更为重要：即使图案位于外围，辐射状图案仍更受偏好。数值表示对所示图案的选择次数。星号表示选择比例与随机水平相比具有显著差异。注：** p &lt; 0.01，*** p &lt; 0.001。本图改编自 Orbán11。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">条件</td>
			<td>第1次实验</td>
			<td colspan="2">第2次实验</td>
			<td colspan="2">第3次实验</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>群体1</td>
			<td>群体2</td>
			<td>群体3</td>
			<td>群体4</td>
			<td>群体5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>工蜂数量</td>
			<td>45</td>
			<td>7</td>
			<td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>选择次数</td>
			<td>151</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>20</td>
			<td>65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 运动敏感视频数据的描述性统计。 实验2中每个蜂群在人工花朵上记录的选择总次数，以及做出这些选择的工蜂数量。本表格经Orbán et al.11修改。完整细节请参考原文。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">条件</td>
			<td colspan="3">合并</td>
			<td colspan="3">异质性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gp</td>
			<td>df</td>
			<td>p</td>
			<td>Gh</td>
			<td>df</td>
			<td>p</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中央-径向 vs 中央-同心</td>
			<td>17.98</td>
			<td>1</td>
			<td>0.000</td>
			<td>40.72</td>
			<td>29</td>
			<td>0.073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中央-径向 vs 周边-径向</td>
			<td>1.85</td>
			<td>1</td>
			<td>0.173</td>
			<td>53.63</td>
			<td>39</td>
			<td>0.060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>周边-径向 vs 中央-同心</td>
			<td>6.57</td>
			<td>1</td>
			<td>0.010</td>
			<td>26.31</td>
			<td>27</td>
			<td>0.500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中央-径向 vs 周边-同心</td>
			<td>18.18</td>
			<td>1</td>
			<td>0.000</td>
			<td>41.92</td>
			<td>37</td>
			<td>0.256</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 推断统计学 运动敏感视频数据 实验2。本表格经Orbán修改 等11. Gp 指组比例与偶然概率之间存在显著偏差，且 Gh 指个体差异的测试即，异质性）。有关统计检验的完整细节，请参阅论文原文。

本视频介绍了利用射频识别（RFID）和运动敏感视频记录方法来监测大黄蜂选择行为的技术。

我们介绍了两种在封闭测试环境中观察大黄蜂选择行为的方法。第一种方法采用射频识别……

这些实验步骤的总体目标是实现对蜜蜂在人工花朵上选择行为的自动化观察。首先，根据所采用的实验方案，通过使用塑料数字标签或 RFID 标签，将识别标记粘附在蜂群内所有蜜蜂身上。第二步是在测试区域中设置运动敏感型摄像机或 RFID 读取器。接下来，将人工花朵放置在测试区域内。最后一步是让蜜蜂群体进入测试区域。最终，生成一个包含每次访问花朵的时间和位置的大型记录数据库。与手动实时记录观察等其他方法相比，这些技术的主要优势在于，它们使我们能够研究那些从未在花朵上获得过奖励的蜜蜂的行为。蜜蜂发现花朵需要一定时间，有时甚至长达数天。我们的方法能够捕捉到这些极为罕见的事件。我们可以对整个熊蜂群体的活动进行长时间连续且高精度的记录。这有助于我们解答关于个体差异起源的昆虫行为学关键问题。本实验方案的测试环境必须是一个隔离的房间，或一个体积为两立方米的金属网飞行笼，置于飞行笼中。一个约镍币直径或两厘米的小孔，作为蜜蜂的进出通道。蜂群通过一个足够宽的导管与实验空间相连，以允许多只蜜蜂同时通行。筛网管状导管是理想选择，因为它们在实验过程中能为蜜蜂提供良好的附着面。蜜蜂可通过测试区域内的这些通道，在飞行笼和蜂群箱之间自由移动。测试区域内设有两个人工花放置架，为高1.2米的木制支架，可置于空间中央或固定在墙上。支架顶部设有用于固定花朵的装置。在整个实验过程中，定期移动支架的位置，以防止引入位置效应的假象。在射频识别（RFID）实验中，将一个2K六通道装置安装在定制设计的人工花朵上方，用于颜色标记实验。运动敏感型摄像机放置在距离人工花朵两米的位置。实验空间需由荧光灯照明，光照强度至少达到1,200勒克斯，因为蜜蜂能够察觉普通荧光灯的闪烁，因此实验过程中必须使用频率超过200赫兹的专用高频镇流器。工蜂在羽化后、仍处于新生阶段且尚不能飞行时，应将其从茧中取出并分装到单独的容器中，并在7摄氏度的冰箱中冷藏约一小时，以减少标记过程中被蜇伤的风险。随后在工蜂的胸部贴上射频识别（RFID）标签。冷却后，使用无毒胶水为每只工蜂贴上唯一的射频识别标签（RFID）。在将工蜂重新引入蜂群之前，让胶水干燥至少10分钟。所有逃避标记或丢失RFID标签的工蜂均须移除。当实验用人工花结构由机械加工制成后，需在其表面覆上彩色黏土。一个纯蓝色的人工花是添加不同视觉特征的基本模板。其中一种视觉特征是使用黄色黏土制成的细条纹图案。人工花圆柱部分的卡槽可轻松卡在RFID读取器上。花朵刺激装置的设计至关重要：内部空间必须足够大，以确保所有熊蜂都能爬入其中，但又必须足够小，使熊蜂身上的标签能够接近读取器至3到4毫米范围内。此外，人工花的设计必须使其视觉特性在圆柱部分与尾部之间呈现无缝衔接。另一种替代RFID标签的方案是使用带有颜色编号的标签。这些标签同样在工蜂羽化出茧后不久即被贴附于其身上。与RFID标签相比，其中一个优势是蜜蜂更难将其脱落。与RFID标记一样，在标记前需将蜂群中的所有工蜂移除，并在标记前将其召集。实验开始后，当蜜蜂行为被记录时，会有新的工蜂羽化，需要进行标记。通常每两到三天会有七至十名新工作人员出现，以记录带有颜色标记的蜜蜂的数据。运动敏感型摄像机必须从测试环境外部对准每朵花。这些摄像机可以是分辨率至少为一兆像素并具备光线调节功能的网络协议摄像机。将标准镜头更换为1.8毫米的极焦镜头，以实现更好的聚焦效果，并能够放大拍摄花朵。调整另一台相机的焦距，用于捕捉两朵花前方的区域。该相机位于花朵上方约半米处。该方法可捕捉着陆前发生的行为，包括接近时的悬停甚至发声。一个由375只工蜂组成的蜂群被标记了射频识别标签（RFID）。在研究期间，85%的蜜蜂进入了飞行笼，其中62%的蜜蜂还探索了四种花朵刺激物中的一种。这被记为悬停、着陆并探索。该实验产生了约 300,000 次记录事件，全部存储在小鼠行为数据库中。结果显示，小鼠更倾向于径向模式而非同心圆模式。然而，当同心图案位于花朵中心而辐射图案位于外围时，其辐射图案的偏好发生了逆转。在第二项实验中，蜜蜂被标记上彩色编号，并使用动作感应摄像机进行拍摄。该实验结果显示，蜜蜂更倾向于选择中心位置为辐射图案的花朵，而非中心位置为同心图案的花朵。图案在花朵上的位置没有影响。这些方法使我们能够通过实验检验计算建模和人工智能提出的关于小型大脑视觉信息处理特性的理论预测。例如，我们使用无监督神经网络生成对对称性偏好的预测，并利用自动化方法对其进行验证。熊蜂首次离开蜂巢的行为研究一直是一个被忽视的领域，而研究中存在的一些障碍主要源于方法学上的困难。本视频中所描述的技术特别适用于研究熊蜂首次离开蜂巢并寻找食物的行为。目前，心理学家和生物学家正利用射频识别（RFID）标记和运动敏感视频记录技术，来探索一些在过去难以实现的新科学问题。

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