在行为蜜蜂中同时进行两个神经处理阶段的长期记录

本实验的总体目标是通过在行为活跃的蜜蜂体内长期接触两个独立的神经处理阶段，研究嗅觉感知与记忆形成。该目标的实现首先需要使用绝缘铜质微丝和定制的电极架组装低成本的多通道电极。下一步是准备一只活体蜜蜂，通过移除其头壳的一部分，将两根经荧光染料处理的电极插入暴露的脑组织中。

第三步是在用花香气味和信息素进行刺激的同时，记录嗅觉通路中两个独立的神经小球或神经束的信号。随后，在解剖大脑后，将另一种荧光示踪剂注入触角叶，以逆向填充目标神经元。然后通过观察逆向填充的神经通路与电极记录轨迹，构建神经元结构的三维重建图像。

最终，利用这些技术可以更深入地理解在不同处理层级（如触角叶和蘑菇体）中，两类神经元群体在气味编码关系方面的相互作用。因此，与现有方法相比，该技术的主要优势在于我们的多通道电极体积非常小，且可组合使用，这意味着在电极固定后，能够同时记录大脑不同区域的活动。柔性导线使得在行为动物中可实现持续数小时的稳定记录。

该方法有助于解答神经病理学领域的关键问题，例如了解动物如何从环境中接收、感知并最终计算生命过程中的气味信息。这种双记录技术可为气味编码及神经元网络的潜在机制提供深入见解。此外，该技术也可应用于无脊椎动物或其他模式生物的感觉与神经生物学研究。

通常，初学者会遇到困难，因为仅依靠蘑菇体的内侧叶或垂直叶等形态学标志来识别蜜蜂神经元需要大量训练。对于本方案，需构建一个电极适配器以适配标准电极接口板。首先，将三段较短的绝缘导线焊接到一个18针连接器上。

然后裁剪一块有机玻璃板，并沿其最长的一侧切出一条浅槽。接着，将焊片拧入有机玻璃板中，并将该板粘接到连接器顶部。随后，使用三根短导线将底座与焊片连接起来。

接下来，将玻璃毛细管放入有机玻璃板的凹槽中。毛细管应可滑动，并通过螺丝固定。使用显微操作针将玻璃毛细管向外延伸约五毫米。该毛细管和针将用于支撑和稳定电极微丝。

接下来，放置三根微丝。借助胶带以获得更好的操作空间，可使用12伏电烙铁针头胶去除玻璃毛细管。将微丝与LMP牙科蜡结合时，不要将微丝的最后三分之一部分粘合。

现在将此多通道微丝电极组件连接到电极适配器上。使伸出的玻璃毛细管与微丝平行。用牙科蜡沿重叠的玻璃毛细管和微细针固定该连接处。

然后修剪电极导线，使微电极针端露出两到三厘米，电极末端也露出两到三厘米。接着，将毛细管固定到电极适配器中，并用螺丝将所有部件固定稳妥。温度为360摄氏度。

将导线的末端垂直焊接到接线端子上。然后通过检测其在1千赫兹下的阻抗是否约为300千欧姆，来检查是否存在足够强的电接触。现在将第二个电极适配器的通道连接到主电极，并将参考电极和肌肉电极焊接到主电极的基座上。

最后，将主电极安装到头端接口板上。在获取蜜蜂后，将其置于冰上冷却直至 immobilized（固定不动），然后将第二根电极固定在单独的适配器上。接着，将蜜蜂固定在标准的聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）固定装置中，并暴露其头部。

将加热的牙科蜡涂抹于复眼基部以及头与胸部的连接处，从而固定头部。继续使用蜡将触角的柄节眼固定在头壳上。避免将蜡涂到鞭状部，该部位需保持向前指向。

Pro Bois 应无阻碍。检查其是否能够活动。现在剃除头囊以改善操作通路。

然后让蜜蜂摄取其能够接受的全部30%蔗糖溶液。这可以确保蜜蜂得到良好准备，具有较高的存活率和组织湿度。现在使用显微手术刀，沿复眼边缘垂直切割，并在触角基部上方进行水平切割。

继续在O细胞眼下方切割，并去除松散的表皮。应将下咽腺和气管移开，以便为插入电极开辟通路。

首先插入参考电极，即一根直径为35微米的银丝。先在同侧复眼处做一个小切口，然后将电极由此切口穿入。

接着，将第二根导线插入外侧O细胞眼下方的肌肉突起区域。为了后续可视化电极位置，将电极浸入含有0.5摩尔氯化钾和5% Alexa Hydrocyte 488的溶液中，持续三分钟。然后，使用显微操作器将两个电极定位至脑部。

通过识别触角叶和蘑菇体的垂直叶来确定方位。此处一个电极位于深度约180微米的外侧触角叶束，另一个电极位于内侧触角叶束，插入深度约为300微米。

通过使用两个组件固定电极位置来完成电极放置。硅胶覆盖大脑上方的整个空间，同时可防止组织干燥。随后进行记录，以从细胞外记录信号中提取单个神经元的活动信号。

使用现有的 spike sorting 软件。利用分化的电极通道。在全部三个电极通道上同时应用模板匹配技术，以检测代表单个峰电位事件的不同波形组合。

最后，通过主成分分析对三个记录到的分化电极通道中的单峰事件进行单位分离的控制。记录完成后，小心地将硅基电极从蜜蜂体内取出。

接着，用蜜蜂林格液冲洗脑组织，并去除腺体和气管。然后使用微量移液器将溶于1摩尔醋酸钾的5%微红染料注入触角叶，这将为触角叶的神经通路提供顺行标记。

此后所有步骤均需在完全黑暗条件下进行。用蜜蜂林格液再次冲洗脑组织，重复三次，并让染料孵育 30 至 45 分钟。通过将蜜蜂置于冰箱中冷却以固定其身体。

然后分离脑组织。将脑组织置于4%多聚甲醛（溶于0.1摩尔PBS中）于4摄氏度下固定过夜，并轻轻振荡。随后按照标准流程进行脱水和透明处理。在使用微红示踪剂逆向标记触角叶中的投射神经元后，通过沿Z轴的正交切片组装得到这些神经元的投射图。

两个电极上的Alexa Hydrocyte 488染料显示其插入位置分别为内侧触角叶束和外侧触角叶束。通过染色标记的目标细胞及电极插入位点的三维重建，绘制出两条触角叶束通路的示意图。在对蜜蜂施加不同浓度气味刺激的同时，同步记录两个触角叶束的电活动，以研究其时间信息处理机制。随后对后续信息处理阶段的神经活动进行了评估。

天线叶投射神经元和外在神经元群体向量的主成分分析表明，投射神经元中的气味响应被延长，并持续超过刺激时间。相比之下，在外在神经元群体中，仅表现出气味开启型和气味关闭型响应。因此，从时间进程上看，右侧外在神经元群体在气味分离活动的出现略早于投射神经元群体开始形成其气味诱导活动。

气味刺激以灰色标记。一旦掌握，制作一个电极大约需要30分钟。如果操作得当，准备蜜蜂并将电极插入目标区域可在另外半小时内完成。

在尝试该操作过程中，重要的是要牢记，每一步都需要大量练习和耐心，直至完全掌握。在将电极导线连接至连接点以及记录目标脑区信号时，需格外小心谨慎。这要求操作者在掌握该技术后，具备扎实的蜜蜂脑解剖学知识。

该技术使神经病理学和昆虫嗅觉领域的研究人员能够探究活体蜜蜂不同神经通路与脑区之间活动的精确时间关系。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建和使用多通道微丝电极，以同时记录活体蜜蜂两个脑区的神经活动，并能够准确可视化记录电极的植入位置。