在两个神经元处理阶段在做人蜜蜂同时长期录音

该程序的总体目标是利用长期访问行为蜜蜂体内的两个独立神经元加工阶段来研究嗅觉涂层和记忆形成。这是通过首先用绝缘铜微线和定制支架组装低成本多通道电极来实现的。下一步是准备活蜜蜂，方法是去除其头部囊的一部分，将两个用荧光染料处理的电极插入暴露的大脑中。

第三步是从嗅觉通路中的两个独立的神经丸或束中记录，同时用花香和信息素刺激。后来，在解剖大脑后，将不同的荧光示踪剂注射到天线叶中以回填目标神经元。然后将回填轨迹和电极示踪可视化，以产生神经元结构的三维重建。

最终，使用这些技术可以更好地理解不同加工水平（如天线叶和蘑菇体）的两个神经元群之间的气味涂层关系。所以现有方法的这种技术的主要优点是我们的多通道电极非常小，可以组合使用，这意味着我们可以在锚定后在大脑的不同区域同时记录。柔性线材允许对行为良好的动物进行数小时的稳定召回。

这种方法可以帮助回答神经病理学领域的关键问题，例如了解动物如何从其环境中接收、感知并最终计算生命中的 olf 工厂。这种双重记录技术可以深入了解气味编码和一般神经元网络的潜在机制。它也可以应用于无脊椎动物或情感和神经生物学中的其他模式生物。

一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为需要进行大量训练才能仅使用蘑菇体内叶或垂直叶等形态标志来识别蜜蜂神经元。对于此协议，构建一个电极适配器以适合标准电极接口板。首先将三短段绝缘线焊接到 18 针连接器上。

然后剪下一块有机玻璃板，沿着最长的边插入一个浅槽。接下来，将焊接片拧入有机玻璃板中，并将板粘在连接器的顶部。然后使用三根短线将底座连接到接线片。

接下来，将玻璃毛细管放入有机玻璃板的凹槽中。毛细管应能够滑动并通过螺钉固定 使用细针，将玻璃毛细管向外延伸约 5 毫米。毛细管和针将用于支撑和稳定电极微丝。

接下来，定位三根微线。在胶带的帮助下，可以使用 12 伏焊针胶去除玻璃毛细管。金属丝与 LMP 牙科蜡一起不会粘住金属丝的最后三分之一。

现在将此多通道微型线组件连接到电极适配器。将延长的玻璃毛细管与微丝平行放置。用牙蜡沿着重叠的玻璃毛细管和细针固定此附件。

然后修剪电极丝，从细小的针脚处留出 2 到 3 厘米，从电极端伸出 2 到 3 厘米。接下来，将毛细管固定到电极适配器中，并使用螺钉将所有东西稳定到位。在 360 摄氏度。

垂直于接线片焊接电线的末端。然后检查它们的阻抗在 1 kHz 时是否约为 300 千克欧姆，从而检查是否存在足够强的电接触。现在将第二个电极适配器的通道连接到主电极，并将参比电极和肌肉电极焊接到主电极基座上。

最后，将主电极安装到头部载物台的接口板上。获得蜜蜂后，将第二个电极固定在单独的适配器上，将一个电极放在冰上，直到它固定下来。接下来，将蜜蜂固定在标准有机玻璃支架中，露出头部。

将加热的牙蜡涂抹在眼睛底部以及头部和胸部之间的交界处，从而固定头部。继续使用蜡将触角的后眼固定在头囊上。避免在 fagel 上涂蜡，因为它需要指向前方。

Pro Bois 应该没有撞击。检查它是否可以移动。现在，剃掉头部胶囊以提高可访问性。

然后给蜜蜂喂食它将消耗的所有 30% 蔗糖。这确保了良好的准备、活力和组织水分。现在使用微型手术刀，沿眼睛边界垂直切割，并在天线底座上方水平切割。

继续在 O 细胞眼下方切割并去除松散的角质层。咽下腺应该移到一边，气管也应该移到一边。这将清除插入电极的路径。

首先插入参比电极，一根 35 微米的银线。首先，在同侧复眼上做一个小切口。然后将电极塞进去。

接下来，将第二根线插入外侧 O 细胞眼下方的肌肉投射区域。为了稍后观察电极位置，将电极浸入 0.5 摩尔氯化钾和 5%Alexa Hydrocyte 4 88 的溶液中 3 分钟。接下来，使用微型纵器将两个电极定位到大脑中。

通过识别蘑菇体的天线瓣和垂直叶来定位自己。这里，一个电极位于 180 微米深的外侧触叶束中，另一个电极位于内侧触叶束中。插入约 300 微米深。

通过使用两个组件锚定电极来完成电极放置。硅覆盖了大脑上方的整个空间，这也将防止组织干燥。然后继续进行记录，从细胞外记录的信号中提取单位活性。

使用可用的尖峰排序软件。使用差异化的电极通道。在所有三个电极通道上同时应用模板匹配技术，以检测导致单个尖峰事件的不同波形组合。

最后，控制适当的单元分离。对记录的三个分化电极通道的单尖峰事件使用主成分分析。进行记录后，小心地从蜜蜂中取出硅和电极。

接下来，用蜂铃溶液冲洗大脑并去除腺体和气管。然后用微量移液器注入触叶，将 5% 微量红宝石溶于一摩尔乙酸钾中。这将为叶的轨迹提供顺行标签。

从这里开始，在最大的黑暗中执行所有步骤。再次用蜂鸣器冲洗大脑，三次，让染料孵育 30 到 45 分钟。通过在冰箱中冷却蜜蜂来固定蜜蜂。

然后隔离大脑。将大脑固定在 0.1 摩尔 PBS 中的 4% 对位醛中，在 4 摄氏度下过夜，并轻轻搅拌。遵循脱水和清除的标准方案 用微红宝石示踪剂回填天线叶中的投影神经元后，这些神经元的投影视图由沿 Z 轴的正交切片组装而成。

两个电极上的 Alexa Hydrocyte 4 88 染料显示它们插入到被牵引的内侧天线叶和外侧天线叶束中。使用染色靶细胞和电极插入位点的 3D 重建来制作两个天线叶牵引轨迹的示意图，同时从两个天线叶束同时记录，同时用不同的气味浓度刺激蜜蜂来研究时间处理。在后续处理阶段评估活性。

种群向量的天线叶投射神经元和外源性神经元主成分分析表明，投射神经元中的气味延长并且超过了刺激。相比之下，在外源性神经元群中，仅表现出 odor on 和 odor off 类型。因此，在观察活动随时间的变化时，右侧的外源神经元群在投射神经元群开始发展其气味诱导的活动之前略微显示出气味分离活动。

气味刺激用灰色标记。掌握后，构建电极大约需要 30 分钟。如果执行得当，准备蜜蜂并将电极插入目标区域可以在另一个半小时内完成。

在尝试此过程时，重要的是要记住，每一步都需要大量的练习和耐心，直到掌握为止。将电极线飙升到其连接点并从所需的大脑范围进行记录时要特别小心。它需要扎实的蜜蜂大脑解剖学知识 开发后。

这项技术使神经病理学和昆虫嗅觉领域的研究人员能够探索行为蜜蜂中不同神经元通路和大脑中枢活动之间的精确时间关系。观看此视频后，您应该对如何构建和使用多通道微线电极同时记录两个大脑区域和行为良好的蜜蜂有很好的了解。您还应该能够可视化记录电极的确切位置。