Name: 制造复杂的栽培基质使用机器人微接触印刷（R-μCP）和顺序亲核取代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习使用机器人微接触印刷和顺序亲核取代技术制造复杂组织培养基质。该方法通过正交化学实现生物配体的空间精确定位固定，叠加精度达10微米，为组织工程和生物材料研究提供高效可重复的自动化解决方案。

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本工作的资助由威斯康星发现研究所和威斯康星校友研究基金会提供给 GTK、TK 和 JDM。

1. 制备弹性印章
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>为制备PDMS印章的硅模板，使用计算机辅助设计软件设计光掩模的特征图案。
	<ol>
		<li>将第一种图案设计为20 × 20的环形阵列，内径（ID）为300 μm，外径（OD）为600 μm，中心间距为1,200 μm。</li>
		<li>将第二种图案设计为20 × 20的环形阵列，内径（ID）为600 μm，外径（OD）为900 μm，中心间距为1,200 μm。</li>
		<li>此外，在每个阵列设计的四个角落处以45°角放置1 × 1 mm2的方形参考标记，其与角落图案的中心间距为1,200 μm。</li>
		<li>采用标准光刻技术（详见文献15或与微流控代工厂合作）制备用于本实验的硅模板，其长宽比为1:1，对应特征深度为300 μm。 
		注意：特征深度低于100 μm可能导致印章在接触基底表面之前发生异常形变。 
		注意：本方案从已获得带有上述光刻胶图案的硅模板开始，此类模板的制备需要专用设备和洁净室环境。建议咨询加工服务商或核心设施以制备这些图案化模板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在密闭环境中过夜（O/N）孵育（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）三氯硅烷蒸气，对硅模板进行硅烷化处理。 
	注意：硅烷蒸气具有高毒性，仅可在通风橱中操作。</li>
	<li>将PDMS预聚物与PDMS固化剂按10:1的比例混合后浇注于硅烷化处理后的硅模板上，置于培养皿中于60 °C下过夜（O/N）固化，从而获得硅模板的反向复制品。</li>
	<li>将PDMS印章从硅模板上剥离，并使用胶水将其键合至丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）背板或其他刚性材料上。 
	注意：所选材料无需透明或具备生物相容性，但必须提供平坦表面以适配机器人工具，并且刚性需高于PDMS。</li>
</ol>
2. 准备盖玻片
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将显微镜盖玻片（24 mm × 50 mm，#1）依次用甲苯、甲醇冲洗，并在丙酮中超声处理1分钟，然后用乙醇冲洗，并在温和的氮气流下干燥。 
	注意：甲苯和丙酮仅可在化学通风橱中操作。</li>
	<li>使用聚焦电子束蒸发仪，在盖玻片上先镀约3.5 nm的钛（Ti），再镀18.0 nm的金（Au）。 
	注意：该方法适用于多种金镀层基底，包括硅和聚苯乙烯。虽然可在现场制备，但金镀层基底也可通过商业供应商获得。 
	注意：钛层厚度应至少为3 nm，而基底上的金层厚度应至少为5 nm，根据最终基底的理想光学特性，厚度可高达1 mm16,17。基底在制备过程中无需光学透明；但透明性有助于对制备的基底进行显微分析。</li>
	<li>使用前，立即用乙醇冲洗金镀层盖玻片，并在温和的氮气流下干燥。</li>
</ol>
3. 外环的R-μCP
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>使用选择性顺应关节型机械臂（SCARA）系统进行R-μCP之前，需利用系统的软件校准机器人工具执行器及配套的双摄像头系统。 
	注意：这些装置如图1所示。</li>
</ol>
<img alt="机器人液体处理系统、实验装置、用于实验室自动化研究的精确移液。" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. R-μCP 系统与机械臂工具装置。（A）R-μCP 系统的整体视图，包含所有工具与夹具：（a）真空卡盘，（b）试剂浴槽，（c）向下朝向的相机，（d）印章嵌套夹具，（e）机器人工具。（B）机械臂工具装置，显示：（f）金刚石尖端刻蚀工具，以及（g）气动吸持工具夹持着（h）ABS背衬的PDMS印章。
<ol start="2" style="margin-left: 40px;">
	<li>将带有直径600 μm内径和900 μm外径凸起环的PDMS印章手动倒置放置于印章嵌套夹具中。将一块新近清洗干净的镀金盖玻片手动放置在真空卡盘上（如图1A所示），并通过连接的实验室真空系统将其固定。</li>
	<li>使用机器人控制系统，将向下朝向的摄像头对准镀金盖玻片的中心点（如图2A所示）。 
	注意：该点最初可通过目视确定，无需极高精度，因为PDMS印章远大于镀金盖玻片。</li>
	<li>指示机械臂使用安装在机械臂上的金刚石刻蚀工具，在以镀金盖玻片中心为中心、尺寸为3.8 mm × 3.8 mm的正方形四个顶点处刻出四个参考“X”标记（如图2B所示；自动过程）。 
	注意：这可确保所有四个参考标记均位于向下朝向摄像头的一个视野范围内。</li>
	<li>使用机器人的气动吸盘工具，从印章嵌套夹具上方1 mm处拾取并夹持PDMS印章（如图2C所示）。（自动过程）</li>
	<li>使用如图2D和E所示的向上朝向摄像头及LED照明环，对印章上的方形参考标记进行成像，并通过摄像头软件连续识别10次，以确定印章相对于机器人工具轴中心的平均X、Y位置及角度偏移。（自动过程）</li>
	<li>如图2A所示，使用向下朝向的摄像头对盖玻片上刻蚀的参考标记进行可视化检测，并连续识别10次，以确定盖玻片相对于机器人工具轴中心的平均X、Y中心位置及角度偏移。（自动过程） 
	注意：机器人系统的软件将执行内部计算，以便在后续R-μCP步骤中精确对齐印章与盖玻片的X、Y中心位置及角度偏移。</li>
	<li>3.8) 将印章浸入烷硫醇ATRP引发剂溶液（ω-巯基十一烷基溴异丁酸酯，2 mM乙醇溶液）中（如图2F所示）。（自动过程）</li>
	<li>将印章从烷硫醇溶液中取出，并置于压力为0.48 bar（5 psi）的氮气流下，以蒸发乙醇（如图2G所示）。1分钟后，将氮气流压力提高至1.03 bar（15 psi），以确保均匀干燥。（自动过程） 
	注意：干燥不完全将导致图案保真度完全或部分丧失。</li>
	<li>干燥后，将印章移至镀金玻片的计算中心位置上方，并以100 μm为步长逐步下降，同时监测Z轴电机受力情况（如图2H所示）。 
	注意：该受力以Z轴电机所承受的扭矩形式传递，并在机器人引导软件中显示。（自动过程）</li>
	<li>当达到预设压力79.2 kPa时，停止下降印章，并保持与镀金盖玻片接触15秒。（自动过程） 
	注意：此处的压力值针对当前印章设计及特征高度进行了优化。若更改印章设计（特别是高深宽比印章），需通过试错法相应调整这些参数。</li>
	<li>缓慢将印章从镀金盖玻片上移开，并将其放回印章嵌套夹具中。（自动过程）</li>
</ol>
4. 在微图案盖玻片上进行 PEGMEMA 的 SI-ATRP
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>释放固定微图案盖玻片的真空压力，并将其转移至一个50 ml的施伦克烧瓶中。使用真空泵密封并抽真空除气。</li>
	<li>向施伦克烧瓶中加入5.5 ml ATRP反应混合物，其中包含大分子单体PEGMEMA（208.75 mmol）、水（34.4 ml）、甲醇（43.8 ml）、溴化铜(II)（1 mmol）和2’,2-联吡啶（3 mmol）。</li>
	<li>加入0.5 ml水溶液中的L-抗坏血酸钠（454.3 mM）以启动反应，在惰性气体氛围下室温反应16小时。 
	注意：加入L-抗坏血酸钠后，反应液颜色将由浅绿色变为深棕色，如图3A-B所示。 
	注意：反应时间可超过16小时，但聚乙二醇刷的长度不会显著增加。</li>
</ol>
<img alt="化学反应装置、减压过滤装置；颜色变化、微阵列结果可见。" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. SI-ATRP 的引发。（A）反应的引发过程，以及（B）加入L-抗坏血酸钠后发生的颜色变化。（C）SI-ATRP 操作后微图案化盖玻片表面的显微镜图像。比例尺：1 mm。
<ol start="4" style="margin-left: 40px;">
	<li>从Schenk烧瓶中取出微图案化盖玻片，依次用乙醇、水和乙醇冲洗，并在温和的氮气流下吹干。 
	注意：经过SI-ATRP处理后，表面修饰应肉眼可见，并可在显微镜下成像和分析，如图3C所示。 
	注意：这是测试实验精度的最简单方法，因为它无需对基底进行免疫染色。</li>
</ol>
5. 微图案化 PEGMEMA 链的叠氮功能化
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将带有微图案的盖玻片放入一个 20 ml 的玻璃反应瓶中。</li>
	<li>向反应瓶中加入 6 ml 含有 100 mM 叠氮化钠的 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）。在 37 °C 下反应 24 小时。 
	注意：仅可在化学通风橱中操作 DMF。称量叠氮化钠时应格外小心。</li>
	<li>反应完成后，从反应瓶中取出带有微图案的盖玻片，依次用乙醇和水冲洗，并在氮气流下吹干。</li>
</ol>
6. 溴功能化 PEGMEMA 链的钝化
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将微图案化盖玻片放入 20 ml 玻璃反应瓶中。</li>
	<li>向反应瓶中加入 6 ml 含 100 mM 乙醇胺和 300 mM 三乙胺的二甲基亚砜（DMSO）。在 40 °C 条件下反应 24 小时。 
	注意：DMSO、乙醇胺和三乙胺仅可在化学通风橱中操作。</li>
	<li>反应完成后，从反应瓶中取出微图案化盖玻片，依次用乙醇和水冲洗，并在氮气流下吹干。</li>
</ol>
7. 内纤维环的R-μCP及PEGMEMA的SI-ATRP
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>按照第3.2节及第3.6–3.12节中所述方法执行R-μCP操作步骤，使用具有300 μm内径（ID）和600 μm外径（OD）凸起环形结构的PDMS印章，使具有较小特征的环形结构位于先前微图案化的环形结构内部。 
	注意：该印章的压力阈值为132.0 kPa。如前所述，这些压力参数是针对本实验所用印章特征进行优化设置的。</li>
	<li>按照第4.1–4.4节中所述方法执行SI-ATRP操作步骤。</li>
</ol>
8. 微图案化 PEGMEMA 链的乙炔功能化
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将微图案化盖玻片放入一个 20 ml 玻璃反应瓶中。</li>
	<li>向反应瓶中加入 6 ml 含有 100 mM 丙炔胺的 DMSO。在室温下维持反应 24 小时。 
	注意：DMSO 和丙炔胺仅可在化学通风橱中操作。</li>
	<li>反应完成后，从反应瓶中取出微图案化盖玻片，依次用乙醇和水冲洗，并在氮气流下吹干。</li>
</ol>
9. 铜催化炔基末端 PEGMEMA 链的“点击”生物素标记
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将微图案化盖玻片放入一个 20 ml 的玻璃反应瓶中。</li>
	<li>向反应瓶中加入 6 ml 硫酸铜（15 mM）/三（[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺）（TBTA，30 mM）（水/DMF 1:1 v/v）溶液，其中含有 562 μM 叠氮-PEG4-生物素偶联物。再向混合液中加入 1.2 ml L-抗坏血酸（0.15 mM）水溶液以启动反应。</li>
	<li>向反应液中通入氮气 10 秒，用 Parafilm 封口，于室温下反应 24 小时。</li>
	<li>反应完成后，从反应瓶中取出微图案化盖玻片，用水冲洗后放入 12 孔聚苯乙烯板中。</li>
</ol>
10. 生物素标记的乙炔基团的免疫荧光检测
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将微图案盖玻片在 DPBS（含 3% 驴血清）中于室温下封闭 1 小时。随后在 DPBS（含 3% 驴血清的 PBS）中加入链霉亲和素-546 偶联物（2 μg/ml），对生物素标记的乙炔基团染色，室温孵育 2 小时。</li>
	<li>用 DPBS 轻柔振荡清洗微图案盖玻片，每次 10 分钟，共清洗 5 次。 
	注意：图 4B 展示了完成此步骤后玻片的图像。</li>
</ol>
11. 叠氮末端 PEGMEMA 链的无铜“点击”生物素标记
注意：如有需要，可执行此底物修饰步骤 原位 在细胞培养过程中。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>在DBPS清洗后，将微图案化盖玻片保留在12孔聚苯乙烯培养板中。</li>
	<li>加入2 ml含有20 μM DBCO-PEG4-Biotin的DBPS（或细胞培养基），在室温下（或在37 °C培养箱中）反应24小时。</li>
	<li>反应完成后，用DPBS清洗微图案化盖玻片5次（或直接更换培养基）。</li>
</ol>
12. 生物素标记叠氮基团的免疫荧光检测
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>使用链霉亲和素-488偶联物（2 μg/ml）在2 ml DPBS（含3%驴血清）中室温孵育2小时，对生物素化的叠氮基团进行染色。</li>
	<li>用DPBS轻轻振荡洗涤微图案化盖玻片，每次10分钟，共洗涤5次。</li>
	<li>使用共聚焦荧光显微镜对微图案化盖玻片进行成像。图4A-C展示了完成此步骤后盖玻片的图像。 
	注意：当将基底用于组织培养实验时，请跳过本方案的第10和第12部分。在达到所需的修饰程度后，用100%乙醇冲洗盖玻片两面，并用氮气流吹干以进行灭菌。将盖玻片转移至无菌生物安全柜中，用PBS冲洗五次，然后进行细胞接种和培养。</li>
</ol>

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<li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

理想的组织工程支架应具有仿生特性，从而重现天然组织中关键生物活性配体的空间分布。此外，它们还应具备动态特性，能够随时间调节配体的呈现及其空间分布模式，以引导组织形态发生并实现细胞命运的区域性特异性诱导。制造此类支架需要在基底上以复杂且高度有序的方式固定多种生化信号分子。尽管模拟细胞微环境中所有内源性因子 体外 是不合理的，本文所述的R-μCP系统可实现多种正交生物活性化学区域的固定，并能对空间取向进行微米级控制。
当考虑到固定化配体结合的聚乙二醇（PEG）刷阵列能够引发生物特异性相互作用，而未结合的PEG刷则仍能抵抗蛋白质吸附，从而可用于调控细胞黏附与迁移时，这些基底的应用价值进一步提升。尽管被动的细胞外基质（ECM）蛋白或聚合物-PEG偶联物的微图案吸附是一种控制细胞黏附和迁移的较简单方法，但该技术仅能提供短暂的调控，因为吸附过程本身是可逆的11。此外，分子以不可预测的方向和随机的浓度吸附到表面，从而限制了生物特异性相互作用的保真度与可控性。再者，通常用于构建抗污区域的化合物（如牛血清白蛋白或Pluronic F127）不具备特定的反应位点...

PEG接枝表面能够在保持其固有抗污性能的同时共价结合生化配体，因此是构建培养基底上定制微环境的理想选择1,2,3配体偶联的PEG刷介导的生物特异性相互作用，可实现对复杂环境中生化信号效应的还原性分析 体内 个体细胞表型受组织微环境的影响。此外，可利用生物正交“点击”化学反应实现配体的定向固定，使其呈现天然构象4-6因此，PEG刷状聚合物的微尺度空间图案化是一种多功能工具，可用于设计定制的 体外 微环境用于研究由固定化生化信号诱导的细胞信号传导6,7.
一种生成生化信号空间图案的常用方法是微接触印刷（μCP）法，即在镀金基底上印制聚乙二醇（PEG）修饰的烷基硫醇图案。随后，由PEG化烷基硫醇构成的微图案化自组装单分子层（SAMs）可限制生化分子的物理吸附。 例如， 蛋白质仅结合至基底的非图案化区域8,9然而，通过该技术制备的自组装单分子膜（SAMs）在长期细胞培养条件下易发生氧化。因此，常通过表面引发的原子转移自由基聚合（SI-ATRP）方法，在微接触印刷（μCP）制备的烷基硫醇SAMs表面进一步接枝聚乙二醇（PEG）聚合物刷，以提高该区域的抗污稳定性。10具体而言，在镀金表面通过微接触印刷（μCP）技术印制烷基硫醇聚合引发剂ω-巯基十一烷基溴代异丁酸酯，随后进行聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯（PEGMEMA）单体的表面引发原子转移自由基聚合（SI-ATRP），可制备出具有微米级图案、长期稳定且抗污的聚乙二醇（PEG）刷状表面。此外，这些表面还可进一步修饰，以呈现多种不同的化学官能团。11.
利用这一特性，Sha 等开发了一种方法，用于构建具有多组分 PEGMEMA 刷状结构并呈现正交“点击”化学特性的培养基底。该方法通过一系列微接触印刷/表面引发原子转移自由基聚合（μCP/SI-ATRP）步骤，并交替进行叠氮化钠、乙醇胺和丙炔胺的亲核取代反应，从而制备出具有微米级图案化、可固定多种配体的培养基底。6尽管将此类化学方法与手动微接触印刷技术（μCP）结合以构建新型培养基质具有巨大潜力，但其应用受限于在单一基质上进行多步μCP操作时的对准精度与准确性。要可重复地制造复杂的 体外 利用这些多功能技术研究生态位。
为解决这一局限性，已开发出多种自动和半自动的微接触印刷（μCP）系统。Chakra et. al. 开发了一种μCP系统，该系统将定制印章置于导轨上，并通过计算机控制的气动执行器使其与镀金载玻片实现共形接触。然而，该方法需要精确制备定制印章设计，且仅报告了10 μm的精度，未提供进行多次μCP步骤时所达到的准确度数据12。最近，一种采用集成运动学耦合系统的方法在使用单一图案时实现了低于1 μm的精度，但由于模具之间印章特征缺乏精确控制，无法准确对齐多个图案13。此外，前述两种方法均要求在图案化步骤之间保持基底固定，从而显著限制了可使用的表面修饰化学方法的多样性。本文中，我们描述了一种自动化的旋转式μCP（R-μCP）系统，该系统能够在多次μCP步骤中实现准确且精确的对准，同时在印章设计与制备方面提供最大程度的灵活性。此外，图案化基底可在每次印刷之间反复从系统中取出，从而允许使用多种基底修饰化学方法，包括连续亲核取代反应。我们及其他研究者此前已将利用此类化学方法构建的基底用于细胞培养6,147。因此，我们将R-μCP与连续亲核取代反应相结合，开发出一种可扩展制造具有复杂且微图案化生化信号的培养基底的方法。

<table><tbody><tr><td>SCARA&amp;nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>如有需要，可选用精度更高的高端型号。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>注意：仅可在化学通风橱中操作。在硅片硅烷化过程中，必须确保所有硅烷完全蒸发后，人员方可进入通风橱。</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>使用前需通过真空处理彻底脱气。其他类似试剂盒（如 Kit 182）亦可接受。</td></tr><tr><td>24 mm × 50 mm #1 盖玻片</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>48393106</td><td>可根据需求从多家供应商处购买不同尺寸的产品。</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark 电子束蒸发仪</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>需接受专门培训方可操作。</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&amp;omega;-巯基十一烷基溴代异丁酸酯</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C。其他ATRP引发剂亦可使用，因该R-&amp;mu;CP平台适用于所有微图案化方法。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml 施兰克管瓶（Schlenk Tube Flask）</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>需配备带隔膜的橡胶塞。</td></tr><tr><td>聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>运输时含有MEHQ和BHT自由基抑制剂。</td></tr><tr><td>甲醇（ACS认证级）</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>A412-4</td><td>注意：仅可在化学通风橱中操作。</td></tr><tr><td>溴化铜(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>注意：应佩戴外科口罩以减少暴露。</td></tr><tr><td>2,2'-联吡啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>注意：应佩戴外科口罩以减少暴露。</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 硼硅酸盐玻璃闪烁瓶</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>注意：应佩戴外科口罩以减少暴露。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>注意：仅可在化学通风橱中操作。</td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>注意：仅可在化学通风橱中操作。</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>注意：仅可在化学通风橱中操作。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>注意：仅可在化学通风橱中操作。</td></tr><tr><td>丙炔胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>注意：仅可在化学通风橱中操作。</td></tr><tr><td>200 证明醇</td><td>威斯康星大学物资分发服务中心（University of Wisconsin Material Distribution Services）</td><td>2292</td><td>注意：仅可在化学通风橱中操作。</td></tr><tr><td>叠氮-PEG3-生物素</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>溶于DMF</td></tr><tr><td>硫酸铜(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>注意：应佩戴外科口罩以减少暴露。</td></tr><tr><td>三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>英潍捷基（Invitrogen）</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>被驴血清污染的物品被视为生物危害材料，应按规定妥善处置。其他多种化合物（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; BSA）也可用于此目的。</td></tr><tr><td>12孔聚苯乙烯板</td><td>赛默飞世尔科技 - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>可从多家供应商处购买不同尺寸的培养板。</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-生物素</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>溶于DMF</td></tr><tr><td>链霉亲和素-Alexa Fluor 488 标记物</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>溶于PBS</td></tr><tr><td>链霉亲和素-Alexa Fluor 546 标记物</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>溶于PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R 共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>倒置荧光显微镜足以用于成像功能化微图案基底。</td></tr></tbody></table>

利用机器人微接触印刷（r-µcp）与连续亲核取代反应制备复杂细胞培养基底

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

在组织工程中，理想情况是在微米尺度上对培养过程中的组织形态和细胞命运实现空间控制。通过使用接枝了聚乙二醇（PEG）刷的培养基底，可实现这一目标，即构建出微尺度下抗污染、抗细胞黏附的区域，以及细胞能够与共价固定的配体发生特异性生物相互作用的区域。为了利用此类基底构建复杂的组织，有必要依次图案化多种功能化的 PEG 刷，使其具备不同的生物活性，并在微米尺度上按特定方向排列，以模拟 体内 微环境。微接触印刷（μCP）是一种用于构建接枝PEG刷图案的多功能技术，但手动μCP无法实现微米级精度操作。因此，我们将先进机器人技术与软光刻技术及新兴表面化学反应相结合，开发出一种机器人辅助微接触印刷（R-μCP）方法，用于制备具有复杂、微米级且高度有序PEG刷图案的培养基底，其中PEG刷呈现正交“点击”化学功能。本文详细描述了此类基底制备的工作流程。

手动对齐的应用 μCP 已有研究证实，利用正交“点击”化学功能化的聚乙二醇接枝刷阵列来构建培养基底的技术6然而，这种方法对图案取向的控制能力有限，且常常导致功能化区域的重叠。在此，提出一种新型的R-μCP 系统被用于克服这一限制，其能够精确地构建一系列PEG刷状环阵列 300 μm 身份与 600 μm OD 呈现末端炔基团，位于另一组 PEG 刷状环阵列中 600 μm 身份与 900 μm 展示末端叠氮基团的OD14. 在炔烃修饰的PEG刷与叠氮-PEG反应后3-生物素及含叠氮基团的PEG刷与DBCO-PEG的反应4-生物素作为底物，使用荧光探针对样本进行免疫染色，并通过共聚焦显微镜成像（图 4）. 使用定制的 MATLAB 程序分析这些图像，计算得出两个 PEG 刷状阵列以亚微米级精度对齐10 μm 准确性， 即， X ~ 6.4 μm, Y ~ 1.7 μm，且 θ ~ 0.02°，这已达到我们SCARA型号制造商声明的极限即, ~10 μ...

利用生物配体的微米级图案功能化的细胞培养基底在组织工程领域具有广泛的应用价值。本文展示了多种具有微米图案的聚乙二醇刷状结构组织培养基底的多功能且自动化制备方法，这些聚乙二醇刷具有正交化学特性，可实现生物配体的空间精确定位和位点特异性固定。

利用机器人微接触印刷（R-µCP）与连续亲核取代反应制备复杂细胞培养基底

在组织工程中，理想情况是在微米尺度上对培养过程中组织的形态和细胞命运实现空间控制。培养基质……

以下实验的总体目标是制备具有多种微图案 PEG 刷的组织培养基底，这些 PEG 刷呈现正交化学特性，从而实现生物配体在空间上精确定位和位点特异性的固定化。该目标通过机器人微接触印刷技术在金包被的基底上沉积含有硫醇的 A TRP 引发剂阵列来实现。第二步是在微图案基底上进行 SI A TRP 反应，生成带有末端溴基团的 PEG 刷。接下来，将末端溴原子修饰为一个或两个化学反应基团，以实现对适当制备的生物配体进行光引发固定。随后，重复整个过程以修饰第二种化学基团。结果表明，两种正交功能化的聚乙二醇（PEG）刷状结构微阵列可实现10微米精度的叠加。通过将反应基团与荧光分子偶联后，使用定制的图像分析软件进行验证。与手动微接触印刷等方法相比，该技术的主要优势在于，机器人微接触印刷能够以微米级精度叠加多个印刷步骤，同时实现最大程度的灵活性和基底设计自由度。该方法所提供的精确性，结合顺序进行的亲核取代反应，使我们能够制备出经多种生物配体功能化的组织培养基底，从而在微米尺度上实现对硫酸化过程的时间和空间控制。在进行S-I-A-T-R-P之前，应使用A-P-D-M-S印章对镀金盖玻片进行图案化处理。这一相对常见的操作步骤在文本方案中有详细说明。首先通过释放真空，将载片从机器人装置上取下。然后将其转移至一个50毫升的sch长度烧瓶中，密封烧瓶，并施加-30 PSI的负压。接着用注射器向烧瓶中加入5.5毫升A TRP反应混合物，再通过注射器加入0.5毫升溶于水的L-抗坏血酸钠。观察反应液颜色由浅绿色变为深棕色。在惰性气体氛围下继续反应16小时。反应完成后，取下盖玻片，依次用乙醇、水和乙醇冲洗，然后用氮气轻轻吹干。接枝的P-E-G-M-E-M-A刷状微阵列应能用肉眼观察到。使用显微镜详细观察以叠氮基团功能化的P-E-G-M-E-M-A链。将带有图案的盖玻片转移至20毫升玻璃反应小瓶中，并加入6毫升含有100毫摩尔叠氮化钠的DMF溶液。在37摄氏度下反应24小时。第二天，用乙醇冲洗洁净盖玻片，并在温和的氮气流下干燥，以稳定剩余的溴功能化P-E-G-M-E-M-A链。将微图案盖玻片转移至一个20毫升的玻璃反应小瓶中，加入6毫升含有100毫摩尔乙醇胺和300毫摩尔三乙胺的DMSO溶液。第二天在 40 摄氏度下让该反应继续进行 24 小时。用乙醇冲洗图案盖玻片，并在氮气流下轻轻吹干。下一步是使用第二个 PDMS 印模重复机器人微接触印刷，并进行后续的印迹操作。再次使用SI A TRP绘制第二个微阵列PEG刷。接下来，弗朗索瓦，需要对第二个微阵列P-E-G-M-E-A链进行炔基功能化。微图案覆盖。将六毫升 100 毫摩尔的丙烯胺 DMF 溶液加入 20 毫升玻璃反应小瓶中。让反应在室温下进行 24 小时。次日，在室温下用乙醇冲洗载玻片，然后在温和的氮气流下干燥。随后，专利盖玻片即可进行生物素偶联。首先将微型专利盖玻片放入一个20毫升的玻璃反应瓶中。第一步，使生物素与末端带有炔基的链发生反应。向反应小瓶中加入六毫升硫酸铜与叠氮 PEG4 生物素缀合物，随后加入1.2毫升0.15毫摩尔的水合核黄素以启动反应，用氮气鼓泡10秒，然后用封口膜密封小瓶，反应持续24小时。第二天室温下，用水冲洗盖玻片，并将其转移至12孔聚苯乙烯培养板中。随后在室温下，用含驴血清的DPBS孵育一小时，一小时后，在DPBS中加入终浓度为每毫升2微克的链霉亲和素-DEIN 546偶联物，对生物素标记的靶点进行染色，室温避光孵育两小时，两小时后用DPBS轻轻振荡冲洗盖玻片五次。用 Tobi ITIN 终止链反应。将盖玻片放入六孔聚苯乙烯板的一个孔中，并加入含有 20 微摩尔 D-B-C-O-P-G 四生物素的两毫升 DPBS。然后在室温下孵育盖玻片 24 小时，24 小时后。将盖玻片如前所述冲洗四次，并用链霉亲和素 488 偶联物在 DPBS 中以每毫升 2 微克的浓度进行染色。两小时后。再次冲洗盖玻片，然后使用显微镜对其进行成像。采用此机器人微接触印刷方案，在具有末端叠氮基团的较大PEG刷状阵列内，成功图案化出具有末端炔基的精确排列的PEG刷状阵列。通过点击化学反应和荧光探针的链霉亲和素结合，观察叠氮基团和炔基团的空间分布。两个荧光通道的叠加图像显示，印章图案未发生重叠。对准精度被计算为低于10微米，达到SCAR的极限。用于执行打印的系统。观看本视频后，您应能充分理解如何利用机器人微接触打印技术叠加多个点刷阵列，以制备定制的组织培养基底，并通过正交化学方法进行功能化。

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制造复杂的栽培基质使用机器人微接触印刷（R-μCP）和顺序亲核取代

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