制造复杂的栽培基质使用机器人微接触印刷（R-μCP）和顺序亲核取代

以下实验的总体目标是使用多个微模式 PEG 刷生成组织培养底物，呈现正交化学，从而实现生物配体的空间精确和位点特异性固定。这是通过在镀金基板上进行机器人微接触印刷来沉积 acan thiol（一种 TRP 引发剂）的沉积阵列来实现的。作为第二步 SI，在微图案衬底上执行 TRP，生成带有末端溴基团的 PEG 刷。

接下来，末端溴基团用一个或两个化学反应基团功能化，以便允许 IM 动员适当制备的生物配体。然后重复整个过程以与第二个化学基团功能化。结果显示两个正交功能化的 PEG 刷的微阵列以 10 微米的精度叠加。

在反应性基团与荧光分子偶联后，使用定制图像分析软件对此进行验证。与手动微接触打印等方法相比，这种技术的主要优点是机器人微接触打印能够以微米级精度叠加多个打印步骤，同时还能实现最大的灵活性和基板设计。这种方法提供的准确性，再加上连续的亲核取代反应，使我们能够生成组织培养底物，这些底物用多种生物配体功能化，然后能够在微米尺度上对硫酸盐进行时间和空间控制。

在 S-I-A-T-R-P 之前，镀金封面幻灯片应由 A-P-D-M-S 印章图案化。这个相对常见的过程在 text protocol 中进行了解释。首先通过释放真空从机器人上取下专利盖玻片。

然后将其转移到 50 ml sch 长的烧瓶中，密封烧瓶，并施加负 30 PSI 真空。接下来，使用注射器将 5.5 毫升 A TRP 反应混合物加入培养瓶中，然后通过注射器将 0.5 毫升 L 抗坏血酸钠加入水中。观察反应颜色从浅绿色变为深棕色。

在惰性气体下反应持续 16 小时。反应完成后，取下盖玻片并用乙醇冲洗，然后用水冲洗，然后再次用乙醇冲洗。然后用氮气轻轻干燥。

嫁接的 P-E-G-M-E-M-A 刷子的微阵列应该是肉眼可见的。使用显微镜详细揭示这些变化，以 Azad 功能化，即 P-E-G-M-E-M-A 链。将样品样盖玻片转移到 20 mL 玻璃反应瓶中，加入 6 mL 含 100 mV 叠氮化钠的 DMF。

在 24 摄氏度下反应 37 小时。第二天，用乙醇冲洗专利盖玻片，并在温和的氮气流下干燥，以平息剩余的溴官能化 P-E-G-M-E-M-A 链。将微量模式盖玻片转移到 20 mL 玻璃反应瓶中，加入 6 mL含有 100 毫摩尔乙醇胺和 300 毫摩尔三乙胺的 DMSO。

第二天在 40 摄氏度下让此反应持续 24 小时。用乙醇冲洗模型盖玻片，并在氮气流下轻轻干燥。下一步是使用第二个 PDMS 印章和后续印章重复机器人微接触打印。

再次使用 SI A TRP 绘制第二个微阵列 PEG 画笔。然后是时候用乙炔功能化第二个微阵列 P-E-G-M-E-A 链 Francois。微图案封面。

加入 6 mL 100 毫摩尔传播胺的 DMF 溶液中，加入 20 mL 玻璃反应瓶中。让反应进行 24 小时。第二天在室温下，用乙醇冲洗专利盖玻片，并在温和的氮气流下干燥。

然后，专利盖玻片即可用于生物素释放。首先将微量专利盖玻片放入 20 mL 玻璃反应瓶中。首先，生物素吃掉乙炔末端链。

向反应瓶中加入 6 毫升硫酸铜和叠氮化物 PEG 四生物素偶联物，然后加入 1.2 毫升 0.15 溶液。将毫摩尔红牛酸在水中初始化反应，用氮气使反应起泡 10 秒。然后用 Paraform 密封小瓶，让反应进行 24 小时。

第二天在室温下，用水冲洗盖玻片，然后将其转移到 12 孔聚苯乙烯培养皿中。然后在室温下用驴血清染色一小时后，在 DPBS 染色中用链球菌 DEIN 5 46 偶联物以每毫升 2 微克的速度对生物素存活组进行染色，两小时后在室温下染色两小时。用温和的植被在 DPBS 中冲洗盖玻片五次。

Tobi ITIN aate azi 终止链。将盖玻片放入六孔聚苯乙烯板的孔中，并应用两毫升含有 20 微摩尔 D-B-C-O-P-G 四种生物素的 DPBS。然后在 24 小时后在室温下将盖玻片孵育 24 小时。

像之前一样冲洗盖玻片 4 并用链霉亲和素 4 88 染色。在 DPBS 中以每毫升 2 μg 的浓度偶联。两个小时后。

再次冲洗盖玻片，然后用显微镜成像。使用这种机器人微接触打印协议。具有末端 alkin 组的 PEG 画笔 ANN UI 的精确图案数组在具有末端 azi 组的较大 PEG 画笔 ANN UI 的单独数组中进行图案化。

使用荧光探针的点击化学和链霉亲和素结合来观察叠氮化物和阿尔金基团的空间分布。两个荧光通道的叠加显示图章如何不重叠。经计算，对准精度低于 10 微米，处于 SCAR 的极限。

用于执行打印的系统。观看此视频后，您应该对如何使用机器人微接触打印来叠加多个钉刷阵列来生成自定义组织培养底物有很好的了解。用正交化学功能化。