碳水化合物和聚酸酐纳米粒子功能化的高通量合成

在本视频文章中，我们描述了一种用于低聚糖自动溶液相合成和 poly anhy 纳米颗粒功能化的新型 hydro put 方案。使用这些基于碳水化合物的靶向剂，使用利用液相合成而不是固相合成器的自动化系统合成第一个碳水化合物分子。接下来，通过花店、固相萃取或 FSPE 纯化低聚糖中间体。

产生的碳水化合物分子通过 NMR 表征，然后它们通过 carbo IDE 共轭连接到聚酸酐纳米颗粒上。最后，通过 X 射线光电子能谱和 hydro putt 苯基硫酸测定对碳水化合物功能化的纳米颗粒进行表征。最终，利用此处描述的 hydro put 方法，获得了优化颗粒表面纳米颗粒形态和碳水化合物密度的反应条件。

与现有的方法（如固体面寡糖合成）相比，这种方法的主要优点是，在这种方法中，我们使用的构建单元的数量要少得多。在这种方法中，我们通常使用 2 到 3 个当量，而不是 10 到 20 个当量。当我们展示表面效应、聚氢纳米颗粒的功能化、使用碳水化合物靶向抗凹痕细胞上的 ceep 受体的功效时，我们首先想到了这种方法。然后，我们想设计一个高通量系统，使我们能够筛选这些新型载体的制造和应用所涉及的多个参数。

该方法的可视化演示至关重要，因为在二元酸的自动合成之前，开发用于高通量合成低聚糖及其与聚合物颗粒结合的自动化平台是一个新的研究领域，没有大量可用的文档。适当保护的糖供体，通常是三氯乙酰胺主要在爱尔康中接受，氟醇在工作台上合成并在氯甲烷中制备，还制备三甲基仓、三氟甲烷磺酸盐在氯甲烷、80%甲醇和 100% 甲醇中。确保自动化室中房间内的相对湿度为 30% 或更低。

高湿度对糖基化反应有害。以下步骤是使用自动化平台完成的。第一次糖基化是用供体和花店酒精进行的。

完成后，所得的花店标签糖分子被 FSPE 纯化。然后用钠、一氧化二甲烷和甲醇去除临时保护基团，再次用 FSPE 纯化产物。之后，将花店标签糖用作受体并与同一供体偶联以获得二糖，二糖通过 FSPE 纯化以开始使用。

将试剂（包括供体受体启动子、80% 甲醇水、100% 甲醇、甲醇钠）放入机器人平台中，然后启动程序。机械臂将从样品瓶中取出供体，然后从样品瓶中取出受体，并将它们转移到反应样品瓶中。然后将供体和受体的混合物搅拌 30 分钟。

30 分钟后。机械臂将催化三甲基筒仓、三氟、甲烷磺酸盐转移到混合物中。然后将溶液再搅拌 30 分钟搅拌完成后，程序暂停。

取出 10 μL 的等分试样，通过薄层色谱检查反应是否完成。如果反应完成，则不会看到受体分子。如果反应不完整，TLC 上的受体仍然可见。

如果是这种情况，请停止程序，将糖基化的时间重置为 30 分钟左右，并添加过量的启动子三甲基硅仓、三氟、甲烷磺酸盐。反应完成后，继续下一步。反应完成后，机器人将反应混合物转移到含有 C 9 F 17 改性硅胶的 FSPE 小柱中进行纯化。

接下来，用 8 毫升 80% 甲醇洗涤小柱，然后用 8 毫升 100% 甲醇洗涤小柱。为了消除非花型组分，将流出液收集在小瓶中，以获得所需的花店标记产品。如果需要额外纯化，请暂停机器人并去除适当的反应产物。

根据结构的不同，供体可能极不反应，即使添加足够的启动子，也会留下一些花店受体分子。如果是这种情况，FSPE 将不够高效地进行纯化，并且在纯化后可以通过硅胶柱色谱进行额外纯化，机械臂将甲基氧化钠分配到反应瓶中。然后将反应在机器人平台中搅拌两个小时，如果 TLC 确定未完成，则将孵育时间延长约一个小时。

反应完成后，产物像以前一样用 FSPE 纯化。接下来，从机器人中取出反应产物，并在工作台上溶解在无水甲苯中，然后蒸发以去除残留的水。样品干燥后，将其放回机器人中，执行相同的循环，包括通过 FSPE 进行糖基化纯化。

重复临时保护基团的深度保护，然后进行糖基化，直到获得目标分子所需的链长，以去除从自动化中获得的受保护产品，从机器人中取出小瓶。该程序的最后步骤使用爆炸性氢气，并且必须在自动化平台之外进行。在台式 oz 上，花店标签中的双键发生裂解，随后产生的醛氧化成羧酸。

在工作台上使用 30% 甲醇与二氯甲烷的混合物，通过硅胶柱色谱纯化所得产物。最后，为了通过钯催化加氢来保护苯并醚基团，将产物通过卫星垫以去除钯，得到纯的最终产品。使用核磁共振或 NMR 波谱对产品进行全面表征。

高抛通聚合物合成和纳米颗粒制造按照 Peterson 等人描述的方案进行。如随附文件所述，用于粒子功能化的自动沉积装置由三个 ne 1000 泵组成，一个由两个致动器集成的机器人载物台，一个用于沿 X 方向移动，另一个用于沿 Y 方向移动，第二个机器人载物台带有两个相邻的机架，由三个致动器组成， 每个方向一个泵和总共五个执行器连接。串联执行器和泵由使用实验室视图软件的计算机作。

用于颗粒制造的共聚物系统基于 SEBA 酸或 SA 和一六双、对位羧基、氧基氢烷或 CPH 和一个八双对位羧基苯氧基三六二氧烷或 CP Teeg。在纳米颗粒制造放置之后，将包含 1.7 毫升离心管的机架与纳米颗粒库连接到线性致动器阶段，用于将碳水化合物附着到聚 anhy 颗粒的表面，并且对第一个反应进行由两个连续反应组成的平均羧酸偶联反应。在可编程注射泵中注入 EDC 和乙二胺的水溶液，浓度分别为每毫克纳米颗粒 2 毫克和每毫克纳米颗粒 0.6 毫克。

可编程注射泵中填充第二个注射器，每毫克 NHSA 颗粒 2.5 毫克，每个纳米颗粒样品共 12 当量，一种水溶液。接下来，使用实验室视图程序，指示机器人将试剂悬浮液存入纳米颗粒库中。然后，机器人执行器将试管架移动到平台中的正确位置，以分配溶液、EDC 和 NHS。

激活聚酸酐纳米颗粒表面的羧酸基团，并允许平均偶联。接下来，将超声处理探针浸入每根试管中，并在 40 赫兹下对每个样品进行超声处理 30 秒。在移至下一个样品之前，请用丙酮清洁探头。

一旦所有样品都填满，试管架就会从机器人平台上拆下。将纳米颗粒悬浮液在 4 摄氏度下持续旋转孵育 9 小时。可以更改第一次和第二次反应的反应时间以调整最终糖浓度。

反应完成后，将试管以 12， 000 倍 G 离心 5 分钟。在寒冷的环境中，返回机器人站。将试管架重新安装到机械臂上，并在机器人平台中填充第二个注射器。

使用冷水时，第一个注射器应保持为空。启动机器人。将每根试管中的上清液抽入空注射器中，第二个泵将冷水倒入试管中。

执行此步骤是为了从纳米颗粒悬浮液中去除任何未反应的试剂。接下来，如前所述，通过超声处理使纳米颗粒悬浮液均质化。然后以 12， 000 倍 G 离心试管 5 分钟。

使用机器人设备进行第二次洗涤，进行第二次反应，将每个 EDC 纳米颗粒样品 12 当量装入第一个泵中，将每个 NHS 纳米颗粒样品 12 当量装入第二个泵中。启动机器人平台，将足够体积的样品分配到含有纳米颗粒的试管中。EDC 和 NHS 的存在将允许在已经附着在纳米颗粒表面的乙烯二酯的胺基与深层保护糖的羧酸基之间形成酰胺键。

沉积完成后，加载 10 当量的特定糖类。在这种情况下，使用了乳糖，并在两个可用的泵中使用了乙醇酸控制。根据在每个试管中实现的所需功能化，将每种糖沉积到试管中，这之前在实验室视图程序中编程，用于作所采用的特定反应的致动器和泵功能在这项研究中，为了碳水化合物的附着，乙醇酸被用作接头控制，因为深度保护的糖已经具有该分子共价连接， 这允许进一步附着到纳米颗粒表面。

像以前一样，通过超声处理对纳米颗粒悬浮液进行匀浆，然后在 4 摄氏度下以恒定旋转孵育 9 小时。孵育后，通过离心去除上清液洗涤纳米颗粒悬浮液，然后 Resus 将颗粒悬浮在冷水中并声波放置试管，这些试管现在包含功能化的纳米颗粒库在真空室中干燥至少两个小时。功能化纳米颗粒通过动态光散射和其他方法来评估表面成分、浓度、粒径、尺寸分布和表面电荷。

此处显示的完全受保护的 diano 侧是使用自动化平台合成的。在 VXR 400 兆赫兹波谱仪中通过质子 NMR 对合成的化合物进行表征。使用 CDC 13 作为溶剂，可以从一些特征峰的存在来确认产物的形成。

在质子 NMR 图中，从 1.79 到 2.21 的四个质子和 3.38 的两个质子来自 florist 标签。2.16 处的单线态峰对应于 4.94 处的乙酸盐峰，5.11 处是异头质子，用于评估反应时间对纳米颗粒最终形态和所达到的糖附着程度的影响。如图所示，纳米颗粒随着反应时间的增加而功能化，50 50 CPT CPH 纳米颗粒表面的二元糖浓度随着反应总时间的增加而增加，并在 18 小时后达到最大值。

然后使用总反应时间为 24 小时的功能化纳米颗粒来评估它们使用流式细胞术在小鼠骨髓衍生的树突状细胞上靶向 CLR 的能力，如图所示。用非功能化以及乳糖和 dano 功能化纳米颗粒刺激后，观察到 DC 符号和 mano 受体对 C 型凝集素受体的表达增加。这表明定位有效。

然而，Diano 功能化颗粒显示出更高水平的表达，表明该配体对所研究的受体具有特异性。观看本视频后，您应该对如何进行低聚糖的高通量自动化合成以及多纳米颗粒的功能化有很好的了解。使用这些碳水化合物碱作为靶向剂，一旦掌握了供体受体保护糖的合成，以及装置的组装可以在 24 到 48 小时内完成。

当然，时间长度取决于库的大小以及功能化时间。在采用这种方法时，重要的是要记住，您可以根据纳米颗粒的化学性质来优化可生物降解的聚乙烯水凝胶颗粒的功能化反应条件。通过遵循此程序，可以合成碳水化合物的各种结构，以靶向不同的细胞受体以影响免疫结果。