Name: 碳水化合物和聚酸酐纳米粒子功能化的高通量合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: 学习高通量自动化合成寡糖并将其功能化到聚酸酐纳米粒子表面的方法。该技术利用溶液相合成和碳二亚胺偶联反应，可优化纳米粒子形态和表面糖密度，从而增强对抗原呈递细胞的靶向能力，推动神经科学领域的靶向药物递送系统发展。

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作者感谢美国陆军医学研究与物资司令部（资助号：W81XWH-10-1-0806）和美国国立卫生研究院（资助号：U19 AI091031-01 和资助号：1R01GM090280）提供的经费支持。BN 感谢 Balloun 化学与生物工程讲席教授职位的支持，NLBP 感谢 Wilkinson 跨学科工程讲席教授职位的支持。我们感谢 Julia Vela 在开展纳米颗粒功能化实验过程中提供的协助。

1. 高通量碳水化合物合成
<ol>
 <li>在进行二糖的自动化合成之前，需在实验台上合成适当保护的糖供体（通常为三氯乙酰亚胺酯）和受体（主要为烯基氟代醇）。</li>
 <li>编写用于二糖自动化合成的程序。基本自动化流程的示意图见图2。在程序中需确保，在加入促进剂之前，供体与受体的混合物至少搅拌30分钟。</li>
 <li>将合成用的供体、受体以及三甲基硅基三氟甲磺酸酯溶于二氯甲烷中。甲苯和二氯甲烷是糖苷化反应中最常用的溶剂。</li>
 <li>同时，配制用于脱除临时保护基团的试剂溶液，分别使用80%甲醇和100%甲醇。</li>
 <li>在程序启动前，确保自动化反应腔室内的相对湿度为30%或更低。高湿度对糖苷化反应有害。</li>
 <li>程序启动后，机械臂依次将供体和受体溶液转移至反应小瓶中，随后混合物搅拌30分钟。</li>
 <li>接着，机械臂向混合物中加入0.2至0.3当量的三甲基硅基三氟甲磺酸酯，通常在室温下进行，但也可达到如-20 °C的较低温度。反应混合物继续搅拌30分钟。</li>
 <li>30分钟后，终止反应，并取出少量等分试样以监测反应进程。若反应未完成，可继续反应，并最终调整程序中所需的时间。</li>
 <li>反应完成后，将反应混合物转移至含有C8F17-修饰硅胶的氟固相萃取（FSPE）小柱进行纯化。</li>
 <li>首先用8 mL的80%甲醇-水混合液洗涤小柱，以去除非氟代组分。</li>
 <li>然后用100%甲醇洗涤小柱，以获得目标氟标记产物。如需进一步纯化，可暂停仪器，取出反应产物通过其他方法进行纯化。</li>
 <li>纯化循环结束后，机械臂向反应小瓶中加入甲醇钠。反应搅拌2小时。若反应未完成，可继续延长反应时间，并最终调整程序中设定的反应时间。</li>
 <li>反应完成后，产物通过FSPE纯化，随后溶于无水甲苯，再经蒸发除去残留水分。</li>
 <li>然后重复该循环（从第6步到第13步），直至目标分子达到所需的链长。</li>
 <li>从自动化系统中获得的保护态产物需进一步纯化，并通过核磁共振（NMR）波谱等技术进行充分表征。最终目标分子的完全去保护（去除所有剩余保护基团）通常在自动化平台之外完成，因为该过程通常涉及易爆的氢气和钯催化剂。最终的去保护步骤在实验台上、自动化平台外进行：第一步为氟代标签中双键的臭氧分解，随后将生成的醛氧化为羧酸；产物通过柱层析纯化；最后一步为钯催化氢化去除苄基醚保护基，产物经硅藻土垫过滤以除去钯，得到纯净的最终产物。</li>
</ol>
2. 高通量纳米颗粒表面功能化
<ol>
 <li>高通量聚合物合成与纳米颗粒制备采用Petersen所述的相同方案及机器人系统进行 等19. 用于颗粒制备的共聚物体系基于癸二酸（SA）和1,6-双(para-羧基苯氧基)己烷（CPH），以及1,8-双(para-羧基苯氧基-3,6-二氧杂辛烷（CPTEG）和CPH。图中展示了所用机器人沉积装置的示意图。 图1b.</li>
 <li>纳米颗粒制备完成后，装有纳米颗粒文库试管的 holder 重新安装到线性执行器平台上。</li>
 <li>通过胺-羧酸偶联反应将碳水化合物连接到聚酸酐颗粒表面 20 由两个连续反应组成。</li>
 <li>对于第一次反应，将第一个可编程注射泵中的注射器装入10当量（eq.）（以颗粒表面平均摩尔羧酸浓度为基准）的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10当量的乙二胺水溶液，而第二个可编程注射泵中的注射器则装入12当量的 NN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在水溶液中。</li>
 <li>使用 LabVIEW 程序将试剂悬浮液点样至纳米颗粒文库*。</li>
 <li>接下来，每个样本均进行超声处理（40 Hz，30秒），然后将试管架从机器人平台拆下。</li>
 <li>纳米颗粒悬浮液在持续旋转条件下孵育9 h** 4 °C.</li>
 <li>反应时间结束后，将离心管离心（12000 × g，5分钟），然后放回机器人工作站进行两次洗涤步骤。</li>
 <li>洗涤时，将一个空注射器装入第一台可编程注射泵中，而第二台注射泵中的注射器则装入冷水。用空注射器吸取各管中的上清液，由第二台泵注入冷水。</li>
 <li>按照步骤2.6所述对纳米颗粒悬浮液进行均质化处理。随后将离心管以12000 × g离心5分钟，并按照步骤2.9所述进行第二次洗涤步骤。</li>
 <li>对于第二个反应，采用两个沉积步骤。在第一个沉积步骤中，使用第一个泵加入12当量的EDC，使用第二个泵加入12当量的NHS。</li>
 <li>第二步沉积包括在第一和第二泵中加入10当量的特定单糖（即半乳糖、乳糖或二甘露糖）***，以及在第三泵中加入10当量的羟基乙酸（作为对照****）。</li>
 <li>纳米颗粒悬浮液按步骤2.6所述进行均质化，并在持续旋转条件下孵育9小时 4 °C.</li>
 <li>反应时间结束后，按步骤 2.8、2.9 和 2.10 所述进行洗涤步骤。</li>
 <li>将功能化纳米颗粒文库置于真空干燥箱中干燥至少2小时。</li>
 <li>采用X射线光电子能谱和高通量苯酚-硫酸法分别测定功能化纳米颗粒的表面组成和糖类浓度。利用扫描电子显微镜和动态光散射技术测定颗粒的粒径、粒径分布及表面电荷。</li>
</ol>
注意事项：*每支试管中沉积体积随所含纳米颗粒的质量而变化。 
**第一和第二步反应的反应时间可调整，以调节最终寡糖浓度。 
***每种寡糖根据所需分组分别加入不同的试管中。 
****本研究中用于碳水化合物连接的特定反应以羟基乙酸作为连接子对照，因为去保护的寡糖已共价连接该分子，从而可进一步连接至纳米颗粒表面。
3. 代表性结果
如图2所示的完全保护的双甘露糖苷通过自动化平台合成。该合成化合物使用CDCl3作为溶剂，在VXR 400 MHz波谱仪上通过1H NMR进行表征。核磁共振谱图如图3所示。
利用本文所述的聚酸酐纳米颗粒的高通量制备与功能化方法，已成功实现了二甘露糖、乳糖和半乳糖的偶联10, 11。通过该实验体系，确定了实现理想纳米颗粒功能化及形貌的最优反应条件（即反应温度和时间）。当反应在4 °C而非室温下进行时，扫描电镜（SEM）观察到纳米颗粒聚集现象减少（数据未显示）。表1展示了在4 °C条件下合成的、分别功能化了二甘露糖或乳糖的50:50 CPTEG:CPH纳米颗粒的代表性表征结果。数据表明，由于功能化修饰，纳米颗粒的平均直径略有增加。未功能化的纳米颗粒具有约-20 mV的负ζ电位，而功能化后的颗粒则呈现正ζ电位，表明纳米颗粒表面的功能化成功实现。乳糖和二甘露糖均为中性糖类；然而，用于连接糖类的乙二胺连接臂上残留的游离氨基可能导致了正ζ电位的出现。
反应时间是另一个可能影响纳米颗粒最终形貌及糖基团连接程度的变量。通过调节反应时间，可以控制连接到纳米颗粒表面的最终糖浓度，如图4A所示。正如预期，50:50 CPTEG:CPH 纳米颗粒表面的双甘露糖浓度随着总反应时间的延长而增加，并在18小时后达到最大值。采用总反应时间为24小时的纳米颗粒，评估其靶向小鼠骨髓来源树突状细胞（DCs）上C型凝集素受体（CLRs）的能力。通过流式细胞术检测非功能化、乳糖功能化以及双甘露糖功能化纳米颗粒刺激后，两种CL受体（即CIRE（CD209，DC-SIGN）和甘露糖受体（CD206））的表达情况（图4B）。当细胞受到乳糖和双甘露糖功能化纳米颗粒刺激时，两种受体的表达均更高，表明实现了有效靶向。然而，双甘露糖功能化颗粒显示出更高的受体表达水平，提示该配体对所研究的受体具有更高的特异性。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>纳米颗粒类型</td>
 <td>平均粒径 (nm)</td>
 <td>平均颗粒ζ-电位 (mV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>非功能化</td>
 <td>162 ± 43</td>
 <td>-20 ± 0.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>乳糖</td>
 <td>235 ± 34</td>
 <td>26 ± 2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>二甘露糖</td>
 <td>243 ± 32</td>
 <td>30 ± 4.2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 纳米颗粒表征。对非功能化和功能化的纳米颗粒通过准弹性光散射和zeta电位测量进行表征。粒径数据表示三次独立实验中动态光散射数据的平均值±标准差（SD）。zeta电位数据表示三次独立测量读数的平均值±SD。zeta电位符号的变化表明糖分子已成功偶联至50:50 CPTEG:CPH纳米颗粒表面。
<img alt="纳米颗粒-碳水化合物化学示意图、光谱实验装置、数据分析、受体结合。" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. (A) 多酸酐纳米颗粒碳水化合物功能化的研究策略示意图，以及利用所述高通量方法可设计的功能化纳米颗粒文库示例。(B) 用于颗粒功能化的自动点样装置示意图，该装置包括：(i) 三台NE 1000泵；(ii) 一个由两个执行器（Zaber）集成的机器人平台：一个用于x方向移动，另一个用于y方向移动；(iii) 第二个机器人平台，配有两排相邻的支架（适用于试管和比色皿），包含三个执行器，分别对应三个方向（x、y和z）。泵和共计五个执行器以串联方式连接。执行器和泵均由计算机通过LabVIEW软件控制。本示意图未按比例绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3967/3967fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="自动化合成示意图；碳水化合物组装；1.5个循环；有机化学过程。" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 以甘露糖为例，展示碳水化合物自动迭代合成的图示。
<img alt="核磁共振谱图；化学位移峰；分子结构分析；波谱结果。" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 保护态双甘露糖苷的1H NMR谱。
<img alt="Bar graph showing particle concentration over reaction time; CIRE and CD206 expression analysis." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. （A） 反应时间对纳米颗粒表面糖类浓度的影响。在所示数据中，50:50 CPTEG:CPH 纳米颗粒在不同反应时间下与双甘露糖进行功能化反应，反应在 4 °C两次独立功能化实验的平均值及标准误如图所示。（B）乳糖和二甘露糖功能化的纳米颗粒可有效靶向骨髓来源树突状细胞上的DC-SIGN（CIRE，CD209）和甘露糖受体（CD206），与非功能化颗粒相比，使用功能化的50:50 CPTEG:CPH纳米颗粒刺激后，这两种标志物的表达显著增强。

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</ol>

NLBP 是碳水化合物公司 LuCella Biosciences, Inc. 的联合创始人，并持有该公司股权。

碳水化合物作为靶向剂引导纳米颗粒与免疫细胞相互作用的有效性此前已有报道10, 11。我们实验室先前的研究表明，连接在聚酸酐纳米颗粒上的特定糖分子能够靶向抗原呈递细胞（APCs）上不同的C型凝集素受体（CLRs），从而增强免疫细胞的活化，这可能对后续T细胞的激活具有重要意义10, 11。然而，为了实现最佳靶向效果，需要优化多个参数——例如聚酸酐的化学性质、颗粒尺寸、糖的类型或表面糖密度——因此提高制备方法的通量，以揭示此类多参数系统的复杂性，将具有重要价值。此外，功能化纳米颗粒在其他相关研究领域也具有重要应用价值，包括生物传感、酶固定化以及食源性病原体的检测。
 通过采用所述的高通量碳水化合物合成方法，可缓解碳水化合物分子在可重复合成方面所面临的挑战。对同一种糖进行自动化平行反应，可根据需要生成更大量的产物。糖类及糖缀合物的已知生物学功能正在迅速扩展。然而，要理解碳水化合物在诸多过程（例如信号转导通路或细胞识别过程）中的分子机制21，仍依赖于结构明确、易于获得且成本低廉的寡糖。为实现精确的糖链延伸，需通过保护/脱保护策...

<table><tbody><tr><td>电动 XYZ 位移台：3x T-LSM050A，每轴行程 50 mm</td><td>Zaber Technologies</td><td>T-XYZ-LSM050A-KT04</td><td></td></tr><tr><td>NE-1000 单通道注射泵</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex* Vista* 无边可重复使用玻璃培养管</td><td>Corning</td><td>07-250-125</td><td></td></tr><tr><td>ASW 1000</td><td>Chemspeed Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>776671-35</td><td></td></tr><tr><td>SGE 气密式注射器，鲁尔锁口</td><td>Sigma Aldrich</td><td>509507</td><td></td></tr><tr><td>XL-2000 超声波破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q55</td><td></td></tr><tr><td>微型管旋转混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量合成碳水化合物及聚酸酐纳米颗粒的功能化

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

必须采用材料设计、纳米技术、化学和免疫学等多学科交叉的方法，以合理设计高效的疫苗载体。基于纳米颗粒的平台可延长疫苗抗原的存留时间，从而可能提高疫苗的免疫原性1。已有多种可生物降解的聚合物被研究作为疫苗递送载体1；特别是聚酸酐颗粒，已证明能够实现稳定蛋白抗原的持续释放，并可激活抗原呈递细胞及调节免疫应答2-12。
这些疫苗载体的分子设计需要综合合理选择聚合物特性，并整合适当的靶向剂。靶向配体和功能化颗粒的高通量自动化制备是一种强大的工具，将增强研究多种特性的能力，并推动可重复的疫苗递送装置的设计。
添加能够被免疫细胞上特异性受体识别的靶向配体已被证明可调节并定制免疫应答10,11,13。C型凝集素受体（CLRs）是一类模式识别受体（PRRs），可识别病原体表面存在的碳水化合物。通过CLRs刺激免疫细胞可增强抗原的内化及其后续呈递，从而进一步激活T细胞14,15。因此，碳水化合物分子在免疫应答研究中具有重要作用；然而，这些生物分子的应用常受限于结构明确且高纯度碳水化合物的获取困难。基于迭代液相反应的自动化平台可显著减少构建单元的使用量，相比传统固相方法更快速、可控地合成这些具有合成挑战性的分子16,17。
本文报道了一种用于自动化液相合成寡糖（如基于甘露糖的靶向配体）的方案，并采用含氟固相萃取对中间产物进行纯化。在开发出自动化方法以制备基于碳水化合物的靶向试剂后，我们描述了利用LabVIEW控制的自动化机器人系统将这些试剂连接到聚酸酐纳米颗粒表面的方法，该系统此前已有报道10。研究表明，以碳水化合物对颗粒表面进行功能化修饰可有效靶向C型凝集素受体（CLRs）10,11，而提高制备方法的通量，有助于揭示多参数系统的复杂性，具有重要意义（图1a）。

本文介绍了一种高通量方法，用于合成寡糖并将其连接到聚酸酐纳米颗粒表面，以进一步用于靶向抗原呈递细胞上的特定受体。

需要采用跨学科方法，整合材料设计、纳米技术、化学和免疫学等领域，以合理设计……

在本视频文章中，我们介绍了一种新型的水相合成法，用于自动化液相合成寡糖以及聚酸酐纳米颗粒的功能化。利用这些基于碳水化合物的靶向剂，首先使用自动化系统合成碳水化合物分子，该系统采用液相合成而非固相合成仪。接着，通过弗洛里硅土固相萃取（FSPE）对寡糖中间体进行纯化。所制备的碳水化合物分子通过核磁共振（NMR）进行表征，然后通过碳酰亚胺偶联反应连接到聚酸酐纳米颗粒上。最后，采用X射线光电子能谱和疏水性苯酚-硫酸法对碳水化合物功能化的纳米颗粒进行表征。最终，通过采用此处所述的疏水性分析方法，已获得优化纳米颗粒形貌及颗粒表面碳水化合物密度的反应条件。与现有的固体表面寡糖合成等方法相比，该方法的主要优势在于所用构筑单元的用量显著减少。在该方法中，通常使用两到三个当量，而非十到二十个当量。我们最初是在研究表面效应的有效性时提出该方法的设想，即利用碳水化合物对多羟基纳米颗粒进行功能化，以靶向抗原呈递细胞上的C型凝集素受体。随后，我们希望设计一种高通量系统，以实现对这些新型载体在制备和应用过程中涉及的多个参数进行筛选。该方法的可视化演示至关重要，因为用于寡糖高通量合成及其与聚合物微粒连接的自动化平台尚属新兴研究领域，相关文献记录较少。在进行二酸的自动化合成之前，需在实验台面上制备适当保护的糖供体（通常为三氯乙酰胺衍生物）和主要位于醇类或含氟醇中的受体，并将其溶于氯甲烷中；同时，将三甲基硅基三氟甲磺酸酯溶于氯甲烷，另分别配制80%甲醇和100%甲醇溶液。确保自动化反应舱内环境的相对湿度为30%或更低。高湿度对糖基化反应有害。以下步骤使用自动化平台完成。第一次糖基化反应使用供体和花醇进行。完成后，通过 FSPE 纯化得到的花体标签糖分子。随后用钠、甲醇钠和甲醇去除临时保护基团，再次通过 FSPE 纯化产物。之后，将花体标签糖作为受体，与相同的供体偶联得到二糖，该二糖通过 FSPE 纯化后即可开始后续操作。将试剂（包括供体、受体、促进剂、80%甲醇水溶液、100%甲醇和甲醇钠）放入 robotic 平台，并启动程序。机械臂将从样品瓶中依次吸取供体和受体，并转移至反应瓶中。随后，供体与受体的混合物搅拌 30 分钟。30 分钟后，机械臂将催化量的三甲基硅基、三氟甲磺酸酯转移至混合物中。随后将溶液再搅拌 30 分钟。搅拌完成后，程序暂停。取出10微升等分试样，通过薄层色谱法检测反应是否完成。若反应已完成，则受体分子将不可见；若反应未完成，则薄层色谱上仍可见受体斑点。如果确实如此，则停止程序，将糖基化反应时间重置为约30分钟，并加入过量的促进剂三甲基硅基三氟甲磺酸酯。反应完成后，继续进行下一步操作。反应结束后，机器人将反应混合物转移至含有九氟十七烷基修饰的硅胶的固相萃取（FSPE）柱中进行纯化。接下来，用8 mL 80%甲醇洗涤小柱，随后用8 mL 100%甲醇洗涤。为去除非弗洛里斯组分，收集流出液至小瓶中，以获得所需的弗洛里斯标记产物。如果需要进一步纯化，可暂停机器人操作，并移除相应的反应产物。根据结构的不同，供体可能极不活泼，即使加入足量促进剂，仍可能残留部分氟化受体分子。若出现这种情况，固相萃取（FSPE）的纯化效率将不足，可在机械臂向反应小瓶中加入甲醇钠后，进一步通过硅胶柱色谱法进行额外纯化。随后在机器人平台上搅拌反应两小时；若薄层色谱（TLC）检测显示反应未完成，则将孵育时间延长约一小时。反应完成后，按前述方法通过FSPE对产物进行纯化。随后，将反应产物从机器人系统中取出，在台面上用无水甲苯溶解，然后蒸发以除去残留水分。样品干燥后，将其重新放回机器人系统中，重复包括通过FSPE进行糖基化纯化的相同循环。深度保护临时保护基，随后进行糖基化反应，重复此过程直至目标分子达到所需的链长，然后对自动化合成得到的保护产物进行脱保护，并将小瓶从机器人装置中取出。该方案的最后步骤需使用易爆的氢气，必须在自动化平台之外进行。在台面上，荧光标记中的双键发生裂解，随后将生成的醛基氧化为羧酸。使用二氯甲烷中含30%甲醇的混合溶剂，在台式硅胶柱上对所得产物进行柱层析纯化。最后，通过钯催化氢化反应脱去苯甲醚保护基，将产物通过一个卫星垫以去除钯，从而得到纯净的最终产物。使用核磁共振（NMR）波谱法对产物进行充分表征。高通量聚合物合成与纳米颗粒制备按照 Peterson 等人所述的方案进行。如随附文档中所述，用于颗粒功能化的自动沉积装置包含三台 ne 1000 泵、一个由两个执行器集成的机器人平台（一个用于 X 方向运动，另一个用于 Y 方向运动），以及第二个带有两个相邻支架的机器人平台，该平台包含三个执行器（每个方向各一个）用于控制泵，总共连接了五个执行器。这些执行器和泵通过计算机使用 LabVIEW 软件进行串联操作。用于颗粒制备的共聚物体系基于SEBA酸或SA，以及一种六(对羧基苯氧基)乙烷（CPH）或一种十八(对羧基苯氧基)-3,6-二氧杂环己烷（CP-Teeg）。在完成纳米颗粒制备后，将含有1.7毫升离心管的纳米颗粒文库置于线性驱动器平台上，用于将碳水化合物连接到聚酸酐颗粒表面。该过程采用平均羧酸偶联反应，包含两个连续的反应步骤。在第一步反应中，使用程序控制的注射泵，将注射器中分别含有EDC和乙二胺的水溶液注入，其浓度分别为每毫克纳米颗粒2毫克和每毫克纳米颗粒0.6毫克。用一个可编程的注射泵中的第二个注射器吸取 NHSA 颗粒溶液，浓度为每毫克颗粒 2.5 毫克 NHSA，总量为每纳米粒子样品 12 当量，水溶液。接下来，通过 LabVIEW 程序指示机器人将试剂悬浮液加入纳米粒子文库中。机器人执行器将带动试管架移动至平台上的正确位置，以便分配 EDC 和 NHS 溶液。活化聚酸酐纳米颗粒表面的羧基，并进行平均偶联。接着，将超声探头浸入每个试管中，以40赫兹对每个样品超声处理30秒。在处理下一个样品前，用丙酮清洗探头。所有样品加样完毕后，将试管架从 robotic 平台取下。将纳米颗粒悬浮液在 4 °C 条件下持续旋转孵育 9 小时。可根据需要调整第一和第二步反应的反应时间，以调节最终的糖浓度。反应完成后，在12,000 ×g 条件下离心试管5分钟。在低温环境中，将样品返回至机器人工作站。将试管架重新连接至机械臂，并填充机器人平台上的第二个注射器。使用冷水时，第一个注射器应保持为空。启动机器人后，每个管中的上清液将被吸入空注射器中，同时第二个泵将冷水注入管中。此步骤旨在去除纳米颗粒悬液中任何未反应的试剂。接着，通过超声处理使纳米颗粒悬液均质化，操作方法如前所述。然后在12,000 ×g 条件下离心5分钟。使用机器人装置进行第二次冷水洗涤，将每纳米粒子样品12当量的EDC加入第一泵，每纳米粒子游戏副本12当量的NHS加入第二泵。启动机器人平台，向含有纳米粒子的试管中分配适量试剂。EDC和NHS的存在将促进已连接在纳米粒子表面的乙二胺中的氨基与深保护糖的羧基之间形成酰胺键。沉积完成后，加入10当量的特定糖类。本实验中使用了乳糖，并在两个可用的泵中分别设置羟基乙酸作为对照。根据每根试管所需的特定功能化修饰，将每种糖类分别沉积到相应的试管中，该过程由LabVIEW程序预先设定，用于控制执行本研究所用反应的驱动装置和泵功能。在碳水化合物连接实验中，使用羟基乙酸作为连接子对照，因为深度保护的糖类已共价连接该分子，从而可进一步与纳米颗粒表面结合。纳米颗粒悬浮液通过超声处理均质化，方法同前，然后在4摄氏度下持续旋转孵育9小时。孵育结束后，通过离心洗涤纳米颗粒悬浮液，弃去上清液，随后将沉淀物重悬于冷水中，并进行超声处理。将含有功能化纳米颗粒文库的试管置于真空干燥箱中，干燥至少2小时。采用动态光散射及其他方法对功能化纳米颗粒进行表征，以评估其表面组成、浓度、粒径、粒径分布及表面电荷。此处所示的完全保护的diano侧链是使用自动化平台合成的。合成化合物采用VXR 400兆赫核磁共振波谱仪进行氢核磁共振（1H NMR）表征。以CDCl3为溶剂，通过若干特征峰的存在可确认产物的生成。在质子核磁共振图谱中，化学位移位于1.79至2.21处的四个质子和3.38处的两个质子来自荧光素标记。2.16处的单峰对应于乙酸酯峰，4.94和5.11处的峰为异头质子，用于评估反应时间对纳米颗粒最终形貌及糖基团连接程度的影响。如图所示，随着反应时间的延长，纳米颗粒被逐步功能化，50/50 CPT/CPH纳米颗粒表面的二乙醇胺浓度随反应总时间的增加而升高，并在18小时后达到最大值。使用总反应时间为24小时的功能化纳米颗粒，通过流式细胞术评估其靶向小鼠骨髓来源树突状细胞上C型凝集素受体（CLR）的能力，结果如图所示。在用非功能化以及乳糖和岩藻糖功能化的纳米颗粒刺激后，均观察到DC-SIGN和甘露糖受体（C型凝集素受体）的表达增加，表明实现了有效靶向。然而，Diano 功能化颗粒显示出更高的表达水平，表明该配体对所研究的受体具有特异性。观看本视频后，您应充分了解如何进行寡糖的高通量自动化合成以及聚合纳米颗粒的功能化。利用这些基于碳水化合物的靶向试剂，一旦掌握了供体-受体保护糖的合成以及装置的组装，整个过程可在 24 至 48 小时内完成。当然，所需时间长度取决于文库的大小以及功能化反应的时间。在采用该方法时，需要注意的是，您可以根据纳米颗粒的化学性质优化可生物降解聚羟基颗粒功能化的反应条件。通过遵循此操作流程，可合成多种结构的碳水化合物，以靶向不同的细胞受体，从而调控免疫学效应。

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科研

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生物工程

碳水化合物和聚酸酐纳米粒子功能化的高通量合成

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微波辅助聚乙二醇和树脂上肽的功能化及其在链式聚合和水凝胶形成中的应用

展示了一种高效、三步合成基于RAFT的荧光糖聚合物的方法，包括糖单体的制备、共聚反应和后修饰。该方案可用于制备具有理想结构的基于RAFT的统计型糖聚合物。...

通过RAFT控制聚合简便高效地制备三组分荧光糖聚合物

我们报道了将多种类型的聚合物包覆金属纳米颗粒“聚合”成长链“均聚物”和“共聚物”的实验方案。...

使用聚苯乙烯-嵌段-聚丙烯酸包覆的金属纳米粒子作为单体进行均聚和共聚

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自动化模块化高通量胞外多糖筛选平台结合高灵敏度碳水化合物指纹图谱分析

已详细阐述制备高稳定性木纤维基毛状纳米颗粒和功能化纤维素基生物聚合物的合成方案。...

源自木材纤维的高稳定性功能性毛状纳米颗粒与生物聚合物：迈向可持续纳米技术

我们介绍一种用于细胞和药物递送装置的RGD功能化水凝胶的合成方案。该方法涉及炔基修饰的聚丙烯酸（PAA）与RGD-叠氮衍生物之间通过铜催化炔-叠氮环加成反应（CuAAC）进行反应。水凝胶通过微波辅助缩聚反应形成，并对其理化性质进行研究。...

RGD功能化水凝胶的合成及其在治疗应用中的工具作用

用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

本方案展示了如何使用Auto-CHO软件进行寡糖的分级和可编程一锅法合成。同时描述了RRV测定 实验以及SSEA-4一锅法糖基化的一般操作流程。...

一锅法合成寡糖的层级化与程序化策略

含有氨基的蛋白质和配体可通过氰化试剂1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化的多糖共价连接，形成共价的蛋白质（配体）-多糖偶联物。本文介绍了一种改进的实验方案，可在0...

使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化和偶联可溶性多糖

学习高通量自动化合成寡糖并将其功能化到聚酸酐纳米粒子表面的方法。该技术利用溶液相合成和碳二亚胺偶联反应，可优化纳米粒子形态和表面糖密度，从而增强对抗原呈递细胞的靶向能力，推动神经科学领域的靶向药物递送系统发展。

高通量合成碳水化合物及聚酸酐纳米颗粒的功能化

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