单链DNA瓦片自组装形成复杂的二维结构

以下实验的总体目标是利用单链砖（single stranded tiles）构建复杂的DNA纳米结构。该过程通过将精心设计的合成DNA链在特定缓冲溶液中混合，使目标DNA纳米结构在第二步中自组装形成。样品在退火过程中完成结构的自组装。

接下来，通过天然琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像来验证纳米结构的成功形成。结果表明，基于天然琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像，DNA纳米结构实现了自组装。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为此类自组装的样品制备过程看似较为复杂。在开始此操作之前，需从寡核苷酸供应商处获得指定序列的DNA组分链，并将其溶解于无RNA酶的水中，置于Vbo 96孔板中；用移液器从362个孔中各吸取1微升，用于24根螺旋×28圈的结构组装。

将每条链100微摩尔加入一个2毫升的试管中。然后向试管中加入138微升去离子蒸馏水，配制成每条链浓度为200纳摩尔的储备溶液。

向一个0.2毫升的PCR管中加入50微升200阿摩尔的储备溶液、10微升10×退火缓冲液A以及40微升蒸馏去离子水。随后在热循环仪中将样品退火17小时，温度从90摄氏度降至25摄氏度。

制备含 SYBR Safe 预染色的天然 2% 琼脂糖凝胶后，将其置于冰水浴中以 100 伏电压电泳运行两小时。电泳结束后，使用配备适合 SYBR Safe 染料的滤光片的凝胶成像仪进行成像，并用锋利洁净的剃刀切下与 1 千碱基 DNA Ladder 中 1,500 个碱基对条带迁移率相似的优势条带。将目标凝胶片段放入离心柱中，随后用微量离心管压碎器将凝胶压碎成细小碎片，然后在 4 摄氏度下以 438 ×g 离心 3 分钟。

离心后，使用紫外分光光度计在260纳米处测定DNA浓度。此时，用透明胶带剥离附着在样品金属圆盘上的云母片，以获得平坦表面，并将样品圆盘放置于显微镜的成像载物台上。

向新解理的云母表面加入 40 µL 的 1× 膝状缓冲液 A，随后加入 5 µL 纯化的 24 HELOCs 样品（经 28 次矩形脉冲处理）。让混合物静置约两分钟。将原子力显微镜（AFM）氮化硅悬臂芯片安装到悬臂夹持器上，在液体轻敲模式下对样品成像，扫描尺寸为 2 µm，分辨率为 1024 线。

内部标记的扫描速率为0.5至1赫兹，该标记连接至矩形的3'端17个核苷酸片段、8个内部瓦片和6个边界瓦片。将28条带把手的链与24个HELOCs其余组分链在28转矩形中混合，制备用于边界标记的200纳摩尔浓度储备液。将14条带把手的链与24个HELOCs其余组分链在28转矩形中混合，获得用于内部标记的200纳摩尔浓度储备液。

进行边界标记时，向一个PCR试管中加入50 µL的200 nmol/L储备溶液、60 µL的100 µmol/L生物素修饰的反向手柄链、10 µL的10×退火缓冲液A以及34 µL的去离子蒸馏水。

进行内部标记时，向PCR试管中加入50微升200纳摩尔的储备溶液、3微升100微摩尔的内部抗手柄生物素修饰链、10微升10×退火缓冲液A以及37微升去离子蒸馏水。

随后，将0.06克尿囊酸溶于3毫升蒸馏水中。为配制2%的水性尿囊酸染色液，使用连接在注射器上的0.2微米滤器过滤染色液。向1毫升过滤后的染色液中加入5微升5摩尔/升的氢氧化钠溶液。

短暂涡旋振荡溶液后，在20,000 G条件下离心。使用以下设置对碳膜载网进行辉光放电处理，使有碳膜的一侧朝上。处理完成后，用移液器将3.5微升样品滴加到经辉光放电处理的载网上。四分钟后，用一片滤纸从侧面接触载网，吸去样品液体。

立即在载网上加入 3.5 µL 染色液。一分钟后，用滤纸吸去染色液，并将滤纸紧贴载网持续一到两分钟。将载网转移至透射电镜样品台。

使用 A-J-E-O-L GM 1400 在 80 千伏电压下操作，放大倍数范围为 10 K 至 80 K 所获得的图像。确定形状后，选择与分子画布上该形状相对应的链段。将暴露的结构域替换为一段 10 到 11 个核苷酸长度的多聚 T 片段，或添加一段与暴露结构域互补的边缘保护链，并在其末端以一段 10 到 11 个核苷酸长度的多聚 T 片段终止。为防止聚集，为包含束腰结构的 310 像素分子画布构建一个链段文库。

将一组星号、二组星号、三组星号和四组星号设置好，共计得到 1,344 个边缘保护剂。将不同组别的 96 孔板离心后，从核心组中移取 1 微升 206 条链，从一组星号中移取 0 条链，从二组星号中移取 0 条链，从三组星号中移取 0 条链，从四组星号中移取 24 条链，加入至一个 2 毫升离心管中。向该管中加入 20 微升去离子蒸馏水，配制成 400 纳摩尔的 DNA 链储备溶液。

接下来，向一个0.2毫升的PCR管中加入50微升400纳摩尔的母液、10微升10×退火缓冲液B以及40微升去离子蒸馏水，并按照之前所述方法在热循环仪中孵育17小时。样品纯化后，测定DNA浓度，并以与之前相同的方式使用FM对样品成像，最后通过简单改变平行六聚体的数量和螺旋圈数来构建不同尺寸的矩形结构。

单链砖的自组装将形成一个由24个HELOC和28个转角组成的矩形DNA序列，不同单链砖的序列可被修饰和优化，以实现链的分裂及标记，并将矩形转化为管状结构。通过单链砖的可编程自组装，形成了尺寸各异的管状和矩形结构，并利用分子画布构建了二维任意形状。为解决任意形状中暴露结构域的聚集问题，测试了域替换设计和边缘保护设计两种方案。两种设计在凝胶产率和结构完整性方面表现相当，但边缘保护设计更具成本效益，因其所需的辅助物种更少。

观看本视频后，您应能充分理解如何基于单链砖块构建复杂的 DNA 纳米结构。