Name: 复杂的二维形状的从单链DNA的瓷砖自组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习利用单链DNA瓦片自组装技术构建复杂二维纳米结构的方法。本研究通过精确控制DNA链混合与退火条件，结合凝胶电泳和原子力显微镜验证，为DNA纳米技术领域提供了可重复的标准化实验方案。

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本工作由美国海军研究办公室青年研究者计划奖 N000141110914、美国海军研究办公室资助项目 N000141010827、美国国家科学基金会职业奖 CCF1054898、美国国立卫生研究院院长新创新者奖 1DP2OD007292、威斯生物启发工程研究所教师启动基金（授予 P.Y.）以及清华-北大生命科学中心启动基金（授予 B. W.）资助。

1. DNA序列设计
<ol>
	<li>使用 UNIQUIMER 软件27 设计 SST-有限结构，通过指定双螺旋的数量、每个双螺旋的顶部和底部螺旋长度以及交叉模式，构建一个 24H × 28T 的画布。定义这些参数后，程序将以图形方式展示整体结构（链的组成及互补性排列）&#160;。</li>
	<li>生成满足互补性排列及其他附加要求（如有）的指定结构链序列。通过最小化序列对称性28（针对大多数结构）来设计 DNA 序列。
	<ol>
		<li>逐个随机生成核苷酸（A、C、G 和 T）。</li>
		<li>根据碱基配对规则，生成与已生成核苷酸互补的核苷酸：A 与 T 配对，反之亦然；C 与 G 配对，反之亦然。</li>
		<li>避免使用超过八个或九个核苷酸的重复片段。若在设计过程中出现此类重复片段，需突变最近生成的核苷酸，直至满足重复片段限制条件。</li>
		<li>避免使用四个连续的 A、C、G 或 T 碱基。</li>
		<li>在单链连接点处使用预先指定的核苷酸（例如，对于大多数链，分别将第21位和第22位核苷酸设为 T 和 G），以防止连接点周围碱基发生滑动（e.g., 若第21位和第22位核苷酸均为 T，则第21位核苷酸可能与本应由第22位核苷酸结合的核苷酸发生结合）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手动修改 DNA 序列，以实现链霉亲和素标记、将矩形结构转化为管状结构、在不同尺度上形成不同的矩形和管状结构，并防止因 SST 上暴露区域导致的聚集。
	<ol>
		<li>将分子画布边界上的暴露区域替换为多聚 T 序列片段。</li>
		<li>对于链霉亲和素标记，设计手柄片段（附加在组分链上的额外片段，可与互补链如反手柄链结合），使其能够容纳带有 3' 生物素修饰的反手柄链。</li>
		<li>将矩形转化为管状结构时，移除矩形的顶部和底部行，并插入新的一行，其 SST 具有特定互补性，可分别与次顶部行和次底部行上的对应瓦片结合。</li>
		<li>对于不同形状的暴露单链区域，替换为长度为 10–11 个核苷酸的多聚 T 片段，或使用与暴露区域互补并在末端带有长度为 10–11 个核苷酸的多聚 T 片段的边缘保护链进行覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分子画布的制备
<ol>
	<li>从寡核苷酸生产商处获取指定序列的DNA单链，其溶解于无RN酶的水中，置于V型底96孔板中，寡核苷酸合成规模为10 nmol，经标准脱盐处理。将含有DNA单链的96孔板在600 × g条件下离心约10秒。
	<ol>
		<li>从用于24H × 28T矩形的362个孔中，每孔移取1 μl含有DNA链的溶液（图3A) 以每条链100 μM（厂家说明书）加入2 ml离心管中。加入138 μl去离子蒸馏水H2将O加入2 ml离心管中，配制每条链浓度为200 nM的链混合物储备溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入50 μl 200 nM的链混合物储备液、10 μl 10×退火缓冲液A（50 mM Tris，pH 7.9，10 mM EDTA，250 mM MgCl₂）2)，以及 40 μl 去离子蒸馏水 H2O 至一个 0.2 ml 的 PCR 管中。这将制备出 100 μl 分子画布样品，溶于 1X 退火缓冲液 A（5 mM Tris, pH 7.9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl）中2).</li>
	<li>将样品在热循环仪中退火17小时，温度从90 °C降至25 °C。热循环仪程序设置如下：以每分钟降低5 °C的恒定速度从90 °C降温至61 °C；再以每分钟降低20 °C的恒定速度从60 °C降温至25 °C；最后在4 °C孵育，直至可取出样品。</li>
	<li>制备1×2%的天然琼脂糖凝胶。
	<ol>
		<li>称取 2.4 g 琼脂糖放入 600 ml 烧杯中。向烧杯中加入 120 ml 0.5X TBE 缓冲液（44.5 mM Tris-硼酸，pH 8.3，1 mM EDTA）和 30 ml 去离子蒸馏水。</li>
		<li>微波加热3分钟（或煮沸后再加热40至60秒）。通过加入30 ml水补充蒸发损失的水分，以维持凝胶中琼脂糖浓度为2%。</li>
		<li>轻轻摇动容器内的内容物&#160;在冷水浴中放置烧杯1分钟。加入1 ml 1.2 M MgCl₂。2 （配制 10 mM MgCl₂ 溶液）2 凝胶中浓度）并用 6 μl SYBR Safe 染料（1:20,000）对凝胶进行预染。</li>
		<li>将凝胶溶液倒入干燥的凝胶板中，插入一把厚度为1.5 mm的12孔电泳梳。将凝胶板置于水平平台上静置15–30分钟，使其充分凝固。</li>
		<li>加入凝胶电泳缓冲液（44.5 mM Tris-硼酸盐，pH 8.3，1 mM EDTA，10 mM MgCl₂）2) 加入琼脂糖凝胶的加样孔中。取 2–3 μl 的 1 kb DNA Marker 加入琼脂糖凝胶的一个加样孔中。将 4 μl 6× 溴酚蓝染料（0.25% 溴酚蓝，5 mM Tris，1 mM EDTA，10 mM MgCl₂）与样品混合2 并加入20 μl分子画布样品，将混合液加入琼脂糖凝胶的另一个加样孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰水浴中以100 V电压运行2%天然琼脂糖凝胶2小时（溴酚蓝，图中显示为蓝色，迁移速度比组分链快，可作为指示剂，用于判断2小时运行时间是否合适）。</li>
	<li>使用配备适合SYBR Safe染料滤光片的凝胶成像系统对凝胶进行成像（图2B).</li>
	<li>在蓝光透射仪上，使用锋利洁净的剃须刀片切下与1 kb DNA Ladder中1,500碱基对条带迁移率相近的主要条带。将所需凝胶片段放入离心柱中，用微量离心管研杵将凝胶碾碎成细小碎片。在4 °C下以438 × g离心3分钟。</li>
	<li>使用紫外分光光度计在260 nm处测定DNA浓度。
	<ol>
		<li>使用 2 μl 超纯无 DNase/RNase 蒸馏水作为空白样校准仪器。</li>
		<li>使用从离心柱中收集的样品等体积溶液来估算DNA浓度。在260 nm紫外吸收波长下测得的浓度值（“a” = ng/μl）将用于确定原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）成像所需的稀释倍数。</li>
		<li>将测得的浓度从“a”（ng/μl）转换为“b”（nM），计算公式为 b = a × 106 /（330 × 核苷酸数量） 
		注意：一个核苷酸的分子量为330 g/mol。计算出的摩尔浓度值将决定原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）成像时的稀释倍数。以24H × 28T矩形结构为例，纯化后样品的常见浓度约为10 - 60 ng/μl。由于该结构包含14616个核苷酸，其摩尔浓度约为2 - 12 nM。最终浓度取决于离心回收率（约20 - 50%）以及切胶时所取凝胶条带的体积（体积越大，纯化样品越稀释）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 原子力显微镜成像
<ol>
	<li>使用透明胶带剥离附着在样品金属圆盘上的云母，以获得一个平坦的表面，并将样品圆盘放置于成像载物台上。</li>
	<li>在新剥离的云母表面加入 40 μl 的 1× 退火缓冲液 A，随后加入 5 μl（2 - 5 nM）纯化的 24H × 28T 矩形样品。让混合物静置约 2 分钟。</li>
	<li>将原子力显微镜（AFM）氮化硅悬臂芯片安装到悬臂夹持器上。成像时使用 C 型三角形探针（共振频率 f0 = 40 - 75 kHz；弹性常数 k = 0.24 Nm-1）。</li>
	<li>在液体轻敲模式下对样品进行成像。扫描时采用以下参数：扫描尺寸为 2 μm，分辨率为 1024 行，扫描速率为 0.5 - 1 Hz（图 2C）。</li>
	<li>如有必要，可加入 10 μl 或更多的 10 mM NiCl2 溶液，以增强 DNA 与云母之间的结合强度29。</li>
</ol>
4. 链霉亲和素标记的样品制备
<ol>
	<li>手动设计 24H × 28T 矩形结构，使其在特定位置引入&#160;手柄链&#160;，这些手柄链与经生物素修饰的抗手柄链互补，从而可特异性结合链霉亲和素。
	<ol>
		<li>通过在矩形顶部和底部两行的各14个瓦片上连接一段3'端17个核苷酸的片段，对分子画布进行修饰，以标记边界（图3A）。该片段包含两个核苷酸（TT）作为间隔序列，以及一段15个核苷酸的手柄序列（GGAAGGGATGGAGGA）。该序列与3'端带生物素修饰的抗手柄链（TCCTCCATCCCTTCC-生物素）互补。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于内部标记，在矩形的8个内部瓦片和6个边界瓦片上连接3'端17个核苷酸的片段（图4A）。
	<ol>
		<li>将28条带手柄的链（用于边界标记）与24H × 28T矩形的其余组分链（共334条）混合，配制成200 nM的储备溶液。将14条带手柄的链（用于内部标记）与24H × 28T矩形的其余组分链（共348条）混合，获得200 nM的储备溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于边界标记，向一个0.1–0.2 ml的PCR试管中加入50 μl 200 nM的链储备溶液、6 μl 100 μM的生物素修饰抗手柄链、10 μl 10×退火缓冲液A以及34 μl去离子蒸馏水。组分链的终浓度为100 nM，抗手柄生物素修饰链的终浓度为6,000 nM。注意，一个24H × 28T矩形可结合28个抗手柄生物素修饰链分子，因此抗手柄生物素修饰链过量100%以上，以利于结合反应进行。</li>
	<li>对于内部标记，向一个0.1–0.2 ml的PCR试管中加入50 μl 200 nM的链储备溶液、3 μl 100 μM的内部抗手柄生物素修饰链、10 μl 10×退火缓冲液A以及37 μl去离子蒸馏水。组分链的终浓度为100 nM，抗手柄生物素修饰链的终浓度为3,000 nM。注意，一个24H × 28T矩形可结合14个抗手柄生物素修饰链分子，因此抗手柄生物素修饰链过量100%以上，以利于结合反应进行。</li>
	<li>将两个样品在热循环仪中按照2.3步骤所述条件退火17小时。</li>
	<li>按照2.4步骤所述方法制备2%的天然琼脂糖凝胶。</li>
	<li>按照2.5步骤所述方法对两个样品进行纯化。</li>
	<li>按照2.6步骤所述方法测定目标DNA结构的浓度。</li>
</ol>
5. 链霉亲和素标记的原子力显微镜检测
<ol>
	<li>按照步骤3所述，使用原子力显微镜（AFM）对每个样品进行成像（图3B和图4B）。</li>
	<li>完成第一轮成像后，向样品中加入40 μl的1X退火缓冲液A，随后加入1 μl浓度为10 mg/ml的链霉亲和素。混合物静置约2分钟后，重新成像（图3C和图4C）。</li>
</ol>
6. 将矩形转化为管状结构
<ol>
	<li>为了基于矩形设计管状结构，除顶部和底部行外，保留所有组分SST。引入新的一行，其SST通过将各列的上半部分和下半部分半砖依次连接，从而将原始矩形环化为管状构型（图5A）。</li>
	<li>将新行的链（14条链）与24H × 28T矩形的组分链（不包括顶部和底部行，共336条链）混合，得到200 nM的储备溶液。</li>
	<li>按照凝胶纯化步骤2.2 - 2.7进行操作（图5B）。</li>
</ol>
7. 透射电子显微镜成像
<ol>
	<li>称取 0.06 g 甲酸铀酰溶于 3 ml 蒸馏水中，配制 2% 的甲酸铀酰水溶液染色液。使用连接在注射器上的 0.2 µm 滤膜过滤 2% 的甲酸铀酰水溶液染色液。
	<ol>
		<li>向 1 ml 过滤后的染色液中加入 5 µl 5 N NaOH。短暂涡旋混匀后，在 20,000 x g 条件下离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对碳膜载网（碳膜面朝上）进行辉光放电处理，设置参数如下：25 mA，45 s，0.1 mBar，负高压极性。</li>
	<li>使用自闭合镊子从边缘夹取经辉光放电处理的载网。</li>
	<li>将 3.5 µl 样品滴加到载网上，作用 4 min。用滤纸从侧面接触载网，吸除多余样品。</li>
	<li>立即在载网上滴加 3.5 µl 染色液，作用 1 min。</li>
	<li>参照步骤 7.4 吸除染色液，并将滤纸紧贴载网保持 1 - 2 min。</li>
	<li>将载网转移至透射电镜样品 holder 中，使用在 80 kV 下运行的 JEOL JEM-1400 电镜进行成像，放大倍数范围为 10 K 至 80 K（图 5C）。</li>
</ol>
8. 使用分子画布构建任意形状
<ol>
	<li>确定一个形状，并在分子画布上选择与该形状对应的链。例如，对于三角形形状，从362条链中选择206条用于分子画布。</li>
	<li>将暴露的结构域（即沿三角形斜边的部分）替换为一段10–11个核苷酸长度的poly-T片段（图6A中的设计1），或添加一段与暴露结构域互补的边缘保护链，并在其末端接上一段10–11个核苷酸长度的poly-T片段（图6A中的设计2），以防止聚集。 
	注意：仅将对应于三角形像素的单链模板（SST）退火（不使用保护链）会导致聚集，在凝胶电泳中无法形成明显的产物条带。建议对各种形状采用边缘保护链设计，因其资源利用更高效；相比替换设计（图6B）所需的额外14组链，边缘保护设计仅需额外增加四组链（图6C）。</li>
	<li>构建一个包含310像素分子画布的链库，其中包括核心组（362条SST画布链），&#160;第1*组（结合SST上结构域1的边缘保护链）、第2*组（结合SST上结构域2的边缘保护链）、第3*组（结合SST上结构域3的边缘保护链）以及&#160;第4*组（结合SST上结构域4的边缘保护链），共计1344条边缘保护链。</li>
	<li>将不同组别的96孔板离心约10秒。从各孔板中移取所需链，以制备特定形状的储备溶液。
	<ol>
		<li>对于带有边缘保护链的三角形形状，从核心组中移取206条链各1 μl，第1*组、第2*组、第3*组各0条，第4*组中移取24条链，分别加入一个2 ml离心管中。向管中加入20 μl去离子蒸馏水，配制成浓度为400 nM的DNA链储备溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在一个0.2 ml PCR管中加入50 μl 400 nM的DNA链储备溶液、10 μl 10×退火缓冲液B（50 mM Tris, pH 7.9, 1 mM EDTA, 125 mM MgCl2）以及40 μl去离子蒸馏水H2O。最终得到100 μl样品，其中退火缓冲液B为1×（5 mM Tris, pH 7.9, 1 mM EDTA, 12.5 mM MgCl2），每条链的浓度约为200 nM。</li>
	<li>按照步骤2.3所述，在热循环仪中对混合物进行17小时退火。</li>
	<li>按照步骤2.4所述，制备天然2%琼脂糖凝胶。</li>
	<li>按照步骤2.5所述，对样品进行纯化。</li>
	<li>按照步骤2.6所述，测定DNA浓度。</li>
	<li>按照步骤3所述，使用原子力显微镜（AFM）对样品成像（图7C和图7D）。</li>
	<li>使用同一链库，选取并混合不同形状所需的链。分别对不同溶液进行退火，并将不同形状的纯化样品混合，以节省AFM成像时间。</li>
</ol>
9. 可选：形状设计与液体混合的机器人自动化
<ol>
	<li>使用定制的 MATLAB 程序辅助设计复杂形状。</li>
	<li>使用软件以移液序列的形式向机器人液体处理系统发送指令。利用机器人液体处理系统选择并混合构成目标形状的链段。 
	注意：形状设计和链段混合已实现自动化，以减少人为误差并降低构建过程的劳动强度。</li>
</ol>
10. 不同尺度下的矩形与管状结构
<ol>
	<li>通过简单地改变平行螺旋的数量（H）和螺旋圈数（T），构建不同尺寸的矩形（图10）。</li>
	<li>按照第3步操作，构建特定尺寸的矩形。</li>
	<li>按照第6步操作，构建特定尺寸的管状结构。</li>
</ol>

<ol><li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+junctions+and+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid junctions and lattices.</a> J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).</li>
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</ol>

作者声明存在竞争性财务利益。

在结构形成步骤中，保持适当浓度的镁离子至关重要（例如在DNA链混合物中加入适当浓度的镁离子（如15 mM），以促进DNA纳米结构的自组装。同样，在琼脂糖凝胶表征/纯化步骤中，保持适当的镁离子浓度也至关重要。例如在凝胶和电泳缓冲液中加入 10 mM Mg²⁺，以在电泳过程中保持 DNA 纳米结构的稳定性。对于 24H×28T 矩形结构，我们测试了在不同 Mg²⁺ 条件下的退火效果。++ 浓度，并发现该结构通常在 10 - 30 mM Mg 范围内形成++ （以约 20 mM Mg 获得最佳成形产率）++).
与支架化的折纸结构不同，单链砖（SST）结构具有模块化架构。通过选择适当的SST砖子集，可从同一画布设计出不同的形状。此外，SST结构仅由短的合成DNA链组装而成，不涉及折纸方法中所使用的长支架链。因此，SST结构的尺寸不受可用支架长度的限制。然而，尽管DNA折纸方法通常可被优化以产生折叠完全的结构或未折叠的单体，SST方法可能产生部分形成的结构，因而可能需要凝胶纯化以用于后续实...

先前的核酸自组装研究1-25 已成功构建出多种复杂结构，包括DNA2–5,8,10–13,17,23或RNA7,22的周期性3,4,7,22和算法性5二维晶格、带状结构10,12和管状结构4,12,13、三维晶体17、多面体11以及有限的二维形状7,8。其中一种特别有效的方法是支架化DNA折纸术，该方法通过大量短的辅助“订书钉”链将一条长的支架链折叠成复杂的结构9,14–16,18–21,25。
我们最近报道了一种利用单链瓦片（SST）构建具有指定二维形状的离散纳米结构的方法，并展示了复杂程度可与DNA折纸术相媲美的结构26。本文改编自我们先前的工作26，详细描述了将可 individually 地址化的SST组装成具有精确预设尺寸（宽度和长度）及形态的复杂有限二维结构的实验方案。SST方法的一个关键优势在于其模块化特性。结构中的每一个SST组分在组装过程中均作为一个模块化的构建单元，而这些SST的不同子集可生成不同的形状。因此，我们建立了一个通用平台，能够利用短的合成DNA链构建具有预设大小和形状的纳米结构。
SST 包含四个结构域，每个结构域长度为 10 或 11 个核苷酸（图 1A）。SST 通过其平行的螺旋结构相互结合，形成由交叉连接维持的 DNA 晶格。每个交叉点位于第 2 和第 3 结构域之间的磷酸基团处。图中为增强可视性，磷酸基团被人为拉伸显示。这些交叉点之间的间距为两个螺旋圈（21 个碱基）（图 1B）。复合矩形结构以其螺旋数和螺旋圈数表示其尺寸。例如，一个宽六个螺旋、长八个螺旋圈的矩形结构记为 6H × 8T 矩形。通过省略、添加或重新排列 SST，可构建出任意形状和大小的结构（图 1C）。例如，一个矩形设计可卷曲成具有特定长度和半径的管状结构（图 1D）。
或者，可将矩形SST晶格视为由SST像素构成的分子画布，每个像素为3 nm × 7 nm。在本研究中，我们使用的分子画布包含310条全长内部SST、24条构成左右边界的全长SST，以及28条形成上下边界的半长SST。该画布由24条通过交叉连接的双螺旋组成，每条螺旋包含28个螺旋圈（294个碱基），因此被称为24H × 28T矩形画布。该24H × 28T画布的分子量与利用M13噬菌体支架构建的DNA折纸结构相似。

<table><tbody><tr><td>DNA链&amp;nbsp;</td><td>Integrated DNA Technology</td><td></td><td>第3.1节</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>第3.4.2节</td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze DNA凝胶提取离心柱</td><td>BIO-RAD</td><td>731-6166</td><td>第3.6节</td></tr><tr><td>Bruker的Sharp Nitride Lever探针</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>SNL10</td><td>第4.3节</td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0蓝光透射仪</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>第3.6节</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5428 000.414</td><td>第3.6节</td></tr><tr><td>透射电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>Jeol</td><td>Jem 1400</td><td>第7.4节</td></tr><tr><td>Multimode 8原子力显微镜</td><td>Veeco</td><td></td><td>第4节</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9000激光扫描仪</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-08</td><td>第3.5节</td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>第3.7.1节</td></tr><tr><td>云母片</td><td>SPI Supplies</td><td>12001-26-2</td><td>第4.1节</td></tr><tr><td>钢制载物盘</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16218</td><td>第4.1节</td></tr><tr><td>用于透射电镜的碳支持铜网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF400-Cu</td><td>第7.2节</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>第7.31节</td></tr><tr><td>辉光放电系统</td><td>Quorum Technologies</td><td>K100X</td><td>第7.2节</td></tr><tr><td>DNA Engine Tetrad 2 Peltier梯度PCR仪</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC&amp;ndash;0240G</td><td>第3.3节</td></tr><tr><td>Owl Easycast B2微型凝胶电泳系统</td><td>ThermoScientific</td><td>B2</td><td>第3.4.3节</td></tr><tr><td>Seekam LE琼脂糖 500G</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>第3.4.1节</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Plus DNA Marker（预混型，75-20000bp）</td><td>ThermoScientific</td><td>SM1333</td><td>第3.4.4节</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c紫外-可见分光光度计</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td>第3.7节</td></tr><tr><td>0.2 µm滤膜</td><td>Corning Inc.</td><td>431219</td><td>第7.1.2节</td></tr></tbody></table>

单链dna瓦片自组装形成复杂的二维结构

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

当前的DNA纳米结构技术已成功利用自组装原理构建出多种二维和三维结构。本文详细描述了如何通过可寻址的单链DNA瓦片（single-stranded DNA tiles, SST）的自组装来制备复杂二维形状的实验方案，这些瓦片在分子画布上充当分子像素。每种单链瓦片（SST）是一条由42个核苷酸组成的DNA链，包含四个串联的模块化结构域，在自组装过程中分别与四个相邻瓦片结合。分子画布是由SST自组装形成的矩形结构。通过从包含310个像素的分子画布中选择特定的分子像素（SST），并将对应的DNA链进行一锅法退火，即可形成预定的复杂二维形状。由于SST方法具有模块化特性，我们展示了该方法的可扩展性、多功能性和稳健性。与替代方法相比，SST方法通过使用更多样化的信息聚合物和序列，实现了更广泛的设计自由度 从头合成 设计并合成了短DNA链。

SSTs 的自组装 （图1） 将得到一个24H × 28T的矩形，如图所示 图2不同SST的DNA序列可以被修饰/优化以实现链霉亲和素标记 （图3和图4），将矩形转化为管状结构（图5），SST 可编程自组装形成不同尺寸的管状和矩形结构 （图10）以及利用分子画布构建二维任意形状 (图8）。测试了两种设计（结构域替换设计和边缘保护设计），以解决任意形状暴露结构域上的聚集问题。 （图7）两种设计的凝胶产量和结构完整性相当，但边缘保护设计由于需要的辅助物种较少，因而更具成本效益。 (图6）。链的挑选与混合可实现自动化，如图所示 图9 以减少人为误差并节省时间。
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DNA瓦片化是一种构建可编程纳米结构的有效方法。本文描述了通过单链DNA瓦片的自组装来构建复杂二维形状的实验方案。

单链DNA瓦片自组装形成复杂的二维结构

当前的DNA纳米结构技术已利用自组装原理，成功构建出多种二维和三维结构。在本研究中……

以下实验的总体目标是利用单链砖（single stranded tiles）构建复杂的DNA纳米结构。该过程通过将精心设计的合成DNA链在特定缓冲溶液中混合，使目标DNA纳米结构在第二步中自组装形成。样品在退火过程中完成结构的自组装。接下来，通过天然琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像来验证纳米结构的成功形成。结果表明，基于天然琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像，DNA纳米结构实现了自组装。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为此类自组装的样品制备过程看似较为复杂。在开始此操作之前，需从寡核苷酸供应商处获得指定序列的DNA组分链，并将其溶解于无RNA酶的水中，置于Vbo 96孔板中；用移液器从362个孔中各吸取1微升，用于24根螺旋×28圈的结构组装。将每条链100微摩尔加入一个2毫升的试管中。然后向试管中加入138微升去离子蒸馏水，配制成每条链浓度为200纳摩尔的储备溶液。向一个0.2毫升的PCR管中加入50微升200阿摩尔的储备溶液、10微升10×退火缓冲液A以及40微升蒸馏去离子水。随后在热循环仪中将样品退火17小时，温度从90摄氏度降至25摄氏度。制备含 SYBR Safe 预染色的天然 2% 琼脂糖凝胶后，将其置于冰水浴中以 100 伏电压电泳运行两小时。电泳结束后，使用配备适合 SYBR Safe 染料的滤光片的凝胶成像仪进行成像，并用锋利洁净的剃刀切下与 1 千碱基 DNA Ladder 中 1,500 个碱基对条带迁移率相似的优势条带。将目标凝胶片段放入离心柱中，随后用微量离心管压碎器将凝胶压碎成细小碎片，然后在 4 摄氏度下以 438 ×g 离心 3 分钟。离心后，使用紫外分光光度计在260纳米处测定DNA浓度。此时，用透明胶带剥离附着在样品金属圆盘上的云母片，以获得平坦表面，并将样品圆盘放置于显微镜的成像载物台上。向新解理的云母表面加入 40 µL 的 1× 膝状缓冲液 A，随后加入 5 µL 纯化的 24 HELOCs 样品（经 28 次矩形脉冲处理）。让混合物静置约两分钟。将原子力显微镜（AFM）氮化硅悬臂芯片安装到悬臂夹持器上，在液体轻敲模式下对样品成像，扫描尺寸为 2 µm，分辨率为 1024 线。内部标记的扫描速率为0.5至1赫兹，该标记连接至矩形的3'端17个核苷酸片段、8个内部瓦片和6个边界瓦片。将28条带把手的链与24个HELOCs其余组分链在28转矩形中混合，制备用于边界标记的200纳摩尔浓度储备液。将14条带把手的链与24个HELOCs其余组分链在28转矩形中混合，获得用于内部标记的200纳摩尔浓度储备液。进行边界标记时，向一个PCR试管中加入50 µL的200 nmol/L储备溶液、60 µL的100 µmol/L生物素修饰的反向手柄链、10 µL的10×退火缓冲液A以及34 µL的去离子蒸馏水。进行内部标记时，向PCR试管中加入50微升200纳摩尔的储备溶液、3微升100微摩尔的内部抗手柄生物素修饰链、10微升10×退火缓冲液A以及37微升去离子蒸馏水。随后，将0.06克尿囊酸溶于3毫升蒸馏水中。为配制2%的水性尿囊酸染色液，使用连接在注射器上的0.2微米滤器过滤染色液。向1毫升过滤后的染色液中加入5微升5摩尔/升的氢氧化钠溶液。短暂涡旋振荡溶液后，在20,000 G条件下离心。使用以下设置对碳膜载网进行辉光放电处理，使有碳膜的一侧朝上。处理完成后，用移液器将3.5微升样品滴加到经辉光放电处理的载网上。四分钟后，用一片滤纸从侧面接触载网，吸去样品液体。立即在载网上加入 3.5 µL 染色液。一分钟后，用滤纸吸去染色液，并将滤纸紧贴载网持续一到两分钟。将载网转移至透射电镜样品台。使用 A-J-E-O-L GM 1400 在 80 千伏电压下操作，放大倍数范围为 10 K 至 80 K 所获得的图像。确定形状后，选择与分子画布上该形状相对应的链段。将暴露的结构域替换为一段 10 到 11 个核苷酸长度的多聚 T 片段，或添加一段与暴露结构域互补的边缘保护链，并在其末端以一段 10 到 11 个核苷酸长度的多聚 T 片段终止。为防止聚集，为包含束腰结构的 310 像素分子画布构建一个链段文库。将一组星号、二组星号、三组星号和四组星号设置好，共计得到 1,344 个边缘保护剂。将不同组别的 96 孔板离心后，从核心组中移取 1 微升 206 条链，从一组星号中移取 0 条链，从二组星号中移取 0 条链，从三组星号中移取 0 条链，从四组星号中移取 24 条链，加入至一个 2 毫升离心管中。向该管中加入 20 微升去离子蒸馏水，配制成 400 纳摩尔的 DNA 链储备溶液。接下来，向一个0.2毫升的PCR管中加入50微升400纳摩尔的母液、10微升10×退火缓冲液B以及40微升去离子蒸馏水，并按照之前所述方法在热循环仪中孵育17小时。样品纯化后，测定DNA浓度，并以与之前相同的方式使用FM对样品成像，最后通过简单改变平行六聚体的数量和螺旋圈数来构建不同尺寸的矩形结构。单链砖的自组装将形成一个由24个HELOC和28个转角组成的矩形DNA序列，不同单链砖的序列可被修饰和优化，以实现链的分裂及标记，并将矩形转化为管状结构。通过单链砖的可编程自组装，形成了尺寸各异的管状和矩形结构，并利用分子画布构建了二维任意形状。为解决任意形状中暴露结构域的聚集问题，测试了域替换设计和边缘保护设计两种方案。两种设计在凝胶产率和结构完整性方面表现相当，但边缘保护设计更具成本效益，因其所需的辅助物种更少。观看本视频后，您应能充分理解如何基于单链砖块构建复杂的 DNA 纳米结构。

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单链DNA瓦片自组装形成复杂的二维结构

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