使用DNA对细胞进行简单、经济、模块化的图案化

CMOD Pack允许您以非常高的精度对细胞进行图案化，并以2d或3d形式培养它们。这为研究细胞 - 细胞相互作用和引擎新组织的形态发生开辟了机会。这种技术的主要优点是其他实验室很容易采用，不需要洁净室，专用设备或定制合成试剂。

首先使用一次性移液管将一小滴正片光刻胶滴到醛载玻片上。使用旋转编码器以3000 RPM的速度旋转载玻片30秒，然后将其放在100摄氏度的热板上1.5分钟以交叉链接光刻胶。从热板上取出载玻片，在载玻片顶部放置一个具有所需功能的光掩模，用一块玻璃将其称重，然后在不透明的盒子中覆盖整个设置。

用紫外灯将装置暴露两分钟，通过将载玻片浸入显影剂溶液中三到五分钟来显影，然后用水冲洗掉多余的显影剂溶液，在空气或氮气流下干燥。在显微镜下观察这种光，以确认光刻的成功并将其存储在黑暗中。将20微摩尔胺修饰的寡核苷酸溶液液滴到载玻片的每个照片图案区域，并使用移液器尖端将液滴轻轻地扩散到整个区域，注意不要划伤载玻片，在65摄氏度的烤箱中烘烤载玻片直到DNA溶液完全干燥，通过将烘烤的载玻片和15厘米的细胞培养皿置于通风橱顶部进行还原胺化的摇床。

将100毫克硼氢化钠轻轻混合在40毫升PBS中，然后将其添加到盘子中。然后打开摇摇杯15分钟。反应后，用0.1%十二烷基硫酸钠洗涤该载玻片两次以除去未反应的DNA。

然后用水清洗载玻片三次。在氮气或空气流下驱动此幻灯片。最后用丙酮冲洗以除去剩余的光刻胶。

按照手稿文本中所述准备四微摩尔通用锚栓和适配器溶液，并在PBS中制备20微摩尔通用共锚固溶液。通过将细胞沉淀重悬于一毫升冰冷的PBS或血清游离培养基中，并将一至300万个细胞转移到1.5毫升微型离心管离心机中来制备细胞悬浮液。以160倍G离心4分钟。

将获得的细胞沉淀重悬于75微升冰冷PBS或血清游离培养基中，并加入75微升制备的微摩尔通用锚和适配器溶液。充分混合并在冰上孵育五分钟，向管中加入15微升通用共锚固溶液并充分混合，然后将样品在冰上孵育五分钟。要从细胞悬浮液中除去多余的寡核苷酸，将一毫升冰冷的PBS或无血清培养基加入试管中，然后用移液管混合。

通过在4摄氏度下以160倍G离心四分钟来沉淀细胞，然后丢弃上清液。再重复此步骤两次。将细胞重悬于冰COL PBS或血清游离培养基中，以产生每毫升至少2500万个细胞的细胞密集溶液，稍微倾斜图案载玻片，然后将25微升的细胞悬浮液加入到每个流通池的入口处。

从出口中取出PBS和1%BSA溶液，让细胞悬浮液充满PDM流通池。在冰上或室温下孵育30秒，从载玻片的出口吸入五微升的细胞悬浮液，然后将其重新加入入口。每个流通池重复此操作10次。

将PBS或无血清培养基轻轻移入每个流通池的入口处，以洗出多余的细胞并从出口收集细胞悬浮液。重复此操作两到四次，直到载玻片上没有多余的细胞残留。对于3d培养，制备含有2%DNA的水凝胶前体溶液，并将其50微升加入每个流通池的入口处。

从出口吸出多余的液体，将水凝胶溶液驱动到流通池中。将载玻片在37摄氏度下孵育30至45分钟，以使水凝胶凝固并切割细胞与表面之间基于DNA的粘附。将50微升水凝胶前体加入两孔室载玻片或六孔板的孔中。

在每个流通池的两侧移取10微升PBS。使用剃须刀片将其沿着流通池的整个长度分布，或找到点镊子，轻轻抬起流通池的侧面，使PBS冲入水凝胶下方。使用剃须刀刀片，通过反转滑块将流通池移动到滑块的边缘，并将流通池从滑块上推开，使其落在剃须刀刀片的顶部。

使用弯曲的镊子从剃须刀片上取通池。反转流动细胞，使细胞位于底部，并将它们放在水凝胶前体溶液液滴的顶部。孵育至少30分钟，以便含有图案细胞的水凝胶可以与水凝胶衬垫结合，从而完全嵌入图案细胞。

取出流通池并将其完全浸入培养基中。使用弯曲的镊子轻轻推流通池，直到它弹出并漂浮到介质中，然后将其丢弃。DNA的定量斑点粘附在CMO标记的细胞上，其增加。

作为CMO浓度的函数，表示为三个实验的平均值和标准偏差。DNA模式以洋红色显示，粘附的CMO标记细胞在不同浓度的CMO下以青色显示。此处显示了CMO标记的huvecs和LMO标记的huvecs的比较，这些 huvecs 粘附在线性DNA模式上。

单个MDCKs模式VSC MOD包，并转移到孔凝胶中，在培养五天后能够增殖和极化。多层多细胞聚集体是通过交替标记有互补CMO的细胞层而产生的。多个独特的细胞群可以高精度地一起建模，而不会交叉污染。

当尝试这种方案时，在将细胞添加到载玻片时具有致密的细胞悬浮液至关重要，以便最大限度地增加细胞粘附在DNA斑点上的机会。