使用DNA进行细胞简单、经济且模块化图案化的技术

CMOD试剂盒可实现对细胞进行高精度图案化，并支持在二维或三维环境中进行培养。这为研究细胞间相互作用以及工程化新组织的形态发生提供了新的机会。该技术的主要优势在于易于被其他实验室采用，无需洁净室、专用设备或定制合成的试剂。

使用一次性移液管，将少量正性光刻胶滴加到醛基化玻片上。利用旋涂仪以3000 RPM的转速旋涂30秒，随后将玻片置于100摄氏度的加热板上加热1.5分钟，以交联光刻胶。从加热板上取下玻片，将带有目标图案的光掩模覆盖在玻片表面，用一块玻璃压住，并将整个装置放入不透光的盒子中。

用紫外灯照射装置两分钟，然后将玻片浸入显影液中显影三到五分钟，接着用清水冲洗掉多余的显影液，在空气或氮气流下吹干。在显微镜下观察该光照区域，以确认光刻是否成功，并将玻片避光保存。在玻片的每个光刻图案区域上滴加20微摩尔的胺基修饰寡核苷酸溶液，使用移液器枪头轻轻将液滴均匀铺展至整个区域，注意避免划伤玻片表面，随后将玻片置于65摄氏度的烘箱中烘烤，直至DNA溶液完全干燥。将烘烤后的玻片与一个15厘米的细胞培养皿一同放置于摇床上，并置于通风橱内进行还原胺化反应。

将100毫克硼氢化钠轻轻混入40毫升磷酸盐缓冲液中，然后加入培养皿。随后开启摇床反应15分钟。反应结束后，用0.1%十二烷基硫酸钠洗涤该载片两次，以去除未反应的DNA。

然后用清水冲洗载玻片三次。将载玻片置于氮气或空气流下吹干。最后用丙酮冲洗以去除残留的光刻胶。

按照文稿中的描述配制4微摩尔的通用锚定子和接头溶液，并在PBS中配制20微摩尔的通用共锚定子溶液。通过将细胞沉淀重悬于1毫升冰浴PBS或无血清培养基中制备细胞悬液，并将1至3百万个细胞转移至1.5毫升微量离心管中。以160 × g离心4分钟。

将获得的细胞沉淀重悬于75微升预冷的PBS或无血清培养基中，加入75微升已配制好的微摩尔通用锚定子与接头溶液。充分混匀后，冰上孵育5分钟。向管中加入15微升通用共锚定溶液，充分混匀，随后将样品继续在冰上孵育5分钟。为去除细胞悬液中多余的寡核苷酸，向管中加入1毫升预冷的PBS或无血清培养基，并用移液器混匀。

在4°C条件下，以160 × g离心4分钟使细胞沉淀，弃去上清液。重复此步骤两次。用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）或无血清培养基重悬细胞，制备成浓度至少为2500万细胞/毫升的细胞浓溶液，将微流控芯片略微倾斜，然后向每个流动池的进样口加入25 µL该细胞悬液。

移除出口处的 PBS 和 1% BSA 溶液，使细胞悬液充满 PDMs 流通池。在冰上或室温下孵育 30 秒，从载片出口吸取 5 µL 细胞悬液，并将其重新加入入口。每个流通池重复此操作 10 次。

轻轻将 PBS 或无血清培养基用移液器加入每个流动池的入口，以洗去多余的细胞，并从出口收集细胞悬液。重复此步骤两到四次，直至载玻片上无多余细胞残留。对于三维培养，配制含有 2% DNA 的水凝胶前体溶液，并向每个流动池的入口加入 50 微升该溶液。

从出口处吸去多余的液体，使水凝胶溶液进入流动池。将载玻片在37摄氏度下孵育30至45分钟，以使水凝胶固化，并裂解细胞与表面之间的基于DNA的黏附。向双孔腔载玻片或六孔板的一个孔中加入50 µL水凝胶前体。

用移液器将10微升PBS分别加入每个流动池的两侧。使用刀片或尖头镊子将PBS沿流动池全长均匀分布，并轻轻抬起流动池的两侧，使PBS迅速流至水凝胶下方。将载玻片翻转，用刀片将流动池移至载玻片边缘，轻推流动池使其脱离载玻片并落在刀片上。

使用弯头镊子从剃须刀片上取下流动池。将流动池倒置，使细胞位于底部，并将其放置在水凝胶前体溶液液滴的上方。孵育至少30分钟，使含有图案化细胞的水凝胶与底层水凝胶结合，从而实现图案化细胞的完全包埋。

取出流动池并将其完全浸入培养基中。使用弯头镊子轻轻推动流动池，直至其脱落并漂浮于培养基中，随后弃去。对DNA斑点与CMO标记细胞的黏附情况进行定量分析，其黏附量增加。

作为CMO浓度函数的结果以三次实验的平均值和标准差表示。DNA模式以品红色显示，附着的CMO标记细胞在不同CMO浓度下以青色显示。此处展示了CMO标记的huvecs与LMO标记的huvecs在附着于线性DNA图案时的比较。

单个MDCK细胞可形成VSC MOD包，并转移至maitre凝胶中，在培养五天后能够增殖并极化。通过交替排列用互补CMO标记的细胞层，可构建多层多细胞聚集体。多种不同的细胞群体可被高精度地共同图案化，且无交叉污染。

在进行该实验方案时，将细胞加入载玻片时必须保持细胞悬液浓度较高，以最大限度增加细胞粘附到DNA点样的机会。