Name: Biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子多式联运分子成像应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学习生物功能化普鲁士蓝纳米粒子的合成方法，用于多式联运分子成像应用。该方法结合钆或锰离子增强磁共振成像信号，并通过荧光标记实现靶向细胞可视化，为生物医学研究提供高灵敏度成像工具。

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本工作由谢赫·扎耶德儿科手术创新研究所（RAC 奖项编号 #30000174 和 30001489）资助。

1. PB NPs、GdPB 和 MnPB 的合成
通过以下详细步骤，采用一锅法合成纳米颗粒（PB NPs、GdPB 或 MnPB）：
<ol>
	<li>配制溶液 A：将 5 ml 的 5 mM 亚铁氰化钾(II) 溶于去离子水（DI 水）中。根据所合成的纳米颗粒类型（PB NPs、GdPB 或 MnPB），按以下方法配制溶液 B：
	<ol>
		<li>对于 PB NPs：配制 10 ml 含 2.5 mM 三氯化铁的 DI 水溶液。</li>
		<li>对于 GdPB NPs：配制 10 ml 含 2.5 mM 硝酸钆(III) 和 2.5 mM 三氯化铁的 DI 水溶液。</li>
		<li>对于 MnPB NPs：配制 10 ml 含 2.5 mM 氯化锰(II) 和 2.5 mM 三氯化铁的 DI 水溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将溶液 B 加入圆底烧瓶中，在室温（RT）下以 1,000 rpm 搅拌烧瓶内容物。使用蠕动泵以约 10 ml/hr 的流速，将溶液 A 逐滴加入含有溶液 B 的圆底烧瓶中。</li>
	<li>溶液 A 加入溶液 B 完成后，继续在室温下以 1,000 rpm 搅拌 30 分钟。停止搅拌并收集混合物。</li>
	<li>将混合物分装至微量离心管中，以洗涤去除未反应的组分。向每份分装物中加入 5 M NaCl（每毫升反应混合物加 0.2 ml NaCl），以辅助离心收集颗粒。</li>
	<li>将每份纳米颗粒样品在 20,000 × g 条件下离心至少 10 分钟。离心后，小心移除上清液。</li>
	<li>通过微探头超声处理，将每份纳米颗粒沉淀重悬于 1 ml DI 水中（超声脉冲开/关 = 1/1 秒，振幅 = 50%，持续时间 = 5 秒，超声仪功率 = 125 W），以打散沉淀。</li>
	<li>重复步骤 1.4–1.6 至少 3 次，以确保纳米颗粒中无初始反应物及副产物残留。最后一次离心后，将颗粒重悬于 1 ml DI 水中。</li>
</ol>
2. PB纳米颗粒、GdPB和MnPB的生物功能化
纳米颗粒的生物功能化包括用亲和素包被纳米颗粒“核心”，并添加生物素化的配体，具体步骤如下：
<ol>
	<li>用荧光亲和素包被纳米颗粒 
	通过静电自组装方法实现纳米颗粒的荧光亲和素包被，其中带正电荷的亲和素（pI ~10.5）包被于带负电荷的纳米颗粒上，具体步骤如下18：
	<ol>
		<li>将PB NPs、GdPB或MnPB分散于1 ml去离子水中，制成分散液。将Alexa Fluor 488标记的亲和素（A488；用去离子水重悬）通过0.2 µm尼龙微量离心过滤器，在14,000 × g条件下离心10分钟。每毫克纳米颗粒加入不超过0.2 mg的亲和素。将每次过滤后的A488等分试样分别加入PB NPs、GdPB或MnPB的等分试样中。</li>
		<li>在4 °C条件下，轻轻振荡或旋转孵育2–4小时，使纳米颗粒与A488充分接触。使用铝箔包裹样品，避免光照。 
		注意：此步骤可获得A488包被的PB NPs（PB-A488）、GdPB（GdPB-A488）和MnPB（MnPB-A488）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物素化抗体的连接 
	利用亲和素-生物素相互作用，将生物素化靶向抗体连接至亲和素包被的纳米颗粒，具体步骤如下：
	<ol>
		<li>将亲和素包被的纳米颗粒（PB-A488、GdPB-A488和MnPB-A488）分散于1 ml去离子水中，制成分散液。将生物素化抗体（按生产商提供形式）通过0.2 µm尼龙微量离心过滤器，在14,000 × g条件下离心10分钟。 
		注意：本研究中使用的生物素化抗体包括抗神经胶质抗原2抗体（ANG2），用于靶向中枢神经系统细胞和组织中高表达的NG2；以及抗人嗜酸性粒细胞趋化因子3抗体（Eot3），用于靶向嗜酸性粒细胞或嗜酸性细胞系中高表达的受体。</li>
		<li>将每次过滤后的生物素化抗体等分试样分别加入亲和素包被的纳米颗粒等分试样中。每毫克亲和素包被的纳米颗粒加入不超过0.05 mg的生物素化抗体。在4 °C条件下，轻轻振荡或旋转孵育2–4小时，使亲和素包被的纳米颗粒与生物素化抗体（ANG2或Eot3）充分结合。使用铝箔包裹样品，避免光照。 
		注意：此步骤可获得抗体包被的纳米颗粒（e.g. GdPB-A488-Eot3和MnPB-A488-ANG2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 纳米颗粒的粒径、Zeta 电位及时间稳定性
采用以下所述的动态光散射（DLS）方法测定纳米颗粒的粒径分布、电荷和稳定性：
<ol>
	<li>纳米颗粒的粒径测定 
	采用动态光散射法测定纳米颗粒的粒径，步骤如下：
	<ol>
		<li>在一次性塑料比色皿中，将 10 µl 纳米颗粒样品（1 mg/ml）加入 990 µl 去离子水中。 
		注意：此为获得良好 DLS 信号的代表性用量。</li>
		<li>盖紧比色皿并涡旋振荡以充分混匀。将比色皿放入用于粒径分析的系统中，测量纳米颗粒的粒径。检测角度设置为 173° 进行粒径分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米颗粒的Zeta电位测定 
	采用相位分析光散射法测定纳米颗粒的Zeta电位，步骤如下：
	<ol>
		<li>在一次性塑料毛细管池中，将 100 µl 纳米颗粒样品（1 mg/ml）加入 900 µl 去离子水中。此用量适用于获得良好的Zeta电位测量结果。</li>
		<li>将毛细管池放入Zeta电位分析系统中，使用默认参数在 25 °C 下测定纳米颗粒的Zeta电位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米颗粒的时间稳定性测定 
	采用动态光散射法测定纳米颗粒的时间稳定性，步骤如下：
	<ol>
		<li>通过测量纳米颗粒在去离子水以及杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中的粒径变化来评估其稳定性，方法见第 3.1 节。</li>
		<li>在 5 天内，每天分别在去离子水和 DMEM 中重复进行一次粒径测量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 纳米颗粒的细胞毒性
采用XTT细胞增殖实验测定纳米颗粒的细胞毒性，步骤如下：
<ol>
	<li>在96孔板中，每种研究的细胞类型（Neuro2a、BSG D10、EoL-1 和 OE21）每孔接种 10,000–15,000 个细胞。确保接种细胞的总体积不超过 0.2 ml/孔。将接种后的细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
	<li>纳米颗粒与细胞的接触：
	<ol>
		<li>用不同浓度的纳米颗粒（0.01–0.5 mg/ml）孵育细胞。参见表1，该表示例说明了在每孔移除50 µl培养基后，加入细胞中的纳米颗粒体积（50 µl）及其对应量。
		<ol>
			<li>为排除纳米颗粒在检测中可能产生的干扰性吸光度，设置不含细胞的空白对照，其中加入与作用于细胞相同当量的适当浓度纳米颗粒（0–0.5 mg/ml）至培养基中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞与纳米颗粒在 37 °C、5% CO2 条件下共同孵育过夜。吸去各孔中的培养基，并用染色缓冲液（含5%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS））清洗。每孔加入100 µl不含酚红的培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育16–18小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据试剂盒说明书，将XTT试剂与XTT激活剂混合，配制XTT细胞增殖检测试剂工作液。吸去各孔中的培养基，每孔加入100 µl RPMI培养基（不含酚红的RPMI + 10% FBS + 1×青霉素-链霉素）或适用于所研究细胞类型的适当培养基。每孔加入50 µl XTT工作液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育2–2.5小时。</li>
	<li>在490 nm波长下测定吸光度，以630 nm为参考波长校正指纹或污迹的影响。计算每孔的校正吸光度值（A490–A630），并对重复孔的读数取平均值。</li>
	<li>从每孔读数中减去空白对照的吸光度值，以获得最终的校正吸光度。通过将最终校正吸光度值相对于未处理组（未加纳米颗粒的细胞）进行归一化，计算各样品的存活率百分比。以纳米颗粒浓度为自变量，绘制存活率百分比曲线。</li>
</ol>
5. PB NPs、GdPB 和 MnPB 的 MRI 驰豫率
通过制备含有纳米颗粒的96孔板作为MRI“模体”，使用T1加权和T2加权序列测量MRI弛豫率，具体方法如下所述：
<ol>
	<li>模型制备
	<ol>
		<li>准备一个 96 孔板，每孔含有 100 µl 纳米颗粒（PB NPs、GdPB 或 MnPB），浓度适当。从每种纳米颗粒的初始浓度为 0.4 mM 开始，使用去离子水（DI 水）进行 2 倍系列稀释，直至浓度达到 2.4 × 10-5 M（共需 14 次稀释，占用 15 个孔）。</li>
		<li>向每孔中加入 100 µl 熔融的 1% 琼脂糖水溶液，并充分混匀。将凝胶置于 4 °C 下静置 12 小时，使其完全凝固。 
		注意：此步骤可获得在固化琼脂糖中含系列稀释纳米颗粒的模型。</li>
		<li>将模型置于水平放置的 3 T 临床磁体中，并在其上方覆盖一块固体 2% 琼脂块（体积 150 cm3）。将模型和琼脂块固定于 8 通道 HD 脑线圈的中心位置。在 96 孔板中段高度处，采用 0.5 mm 厚的冠状切片测量弛豫时间11。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T1 加权与 T2 加权成像序列 
	在临床磁体中采集成像序列时，使用以下代表性参数： 
	注意：这些参数针对本研究所用纳米颗粒进行了优化：
	<ol>
		<li>采用以下液体衰减反转恢复（FLAIR）序列采集 T1 加权（T1W）磁共振图像：回波链（ET）= 8，重复时间（TR）= 2,300 毫秒，回波时间（TE）= 24.4 毫秒，矩阵尺寸 = 512 × 224，视野（FOV）= 16 × 16 cm2。</li>
		<li>采用以下快速弛豫快速自旋回波（FRFSE）序列采集 T2 加权（T2W）磁共振图像：ET = 21；TR = 3,500 毫秒；TE = 104 毫秒；矩阵尺寸 = 512 × 224；FOV = 16 × 16 cm2。</li>
		<li>在 127 MHz（3 T）下，以以下反转时间采集 T1W 和 T2W 磁共振图像：50、177、432、942、1,961 和 4,000 毫秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量 MRI 弛豫率
	<ol>
		<li>使用第 5.2 节所述序列采集 T1W 和 T2W 图像后，使用 ImageJ 测量每个孔的信号强度，将每个孔定义为感兴趣区域（ROI），方法为：在主工具栏中选择椭圆裁剪按钮划定 ROI，然后选择 Analyze &gt; Measure。 
		注意：弹出窗口应在标有“Mean”的列下显示每个 ROI 的平均信号强度。</li>
		<li>对每个 ROI，将测得的信号强度对其对应的反转时间作图。如有必要，对在图谱起始部分（较低反转时间）出现初始“气泡”或离群值的数据点进行反转校正。 
		注意：这些读数出现在低反转时间，因为 MRI 测量的是图像的幅值或绝对值，而非其实际（负）值，因此需要进行校正19。</li>
		<li>根据第 5.2 节所述，对每个 ROI 的信号强度（SI）与反转时间（TI）关系图进行指数拟合。以 TI 为横轴，SI 为纵轴；ɑ 和 Δ 为回归确定的常数，T1 或 T2 为待求解变量： 
		<img alt="瞬态吸收光谱研究中信号强度 SI(t) 的指数衰减公式" fo:content-width="1.75in" src="/files/ftp_upload/52621/52621eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1"> 
		其中 t = T1, T2。</li>
		<li>利用上述方程求解 T1 或 T2，并将计算值的倒数（1/T1 和 1/T2）对各 ROI 中使用的纳米颗粒浓度作图。</li>
		<li>计算所得线性图的斜率，该斜率即为弛豫率 r1 和 r2。 
		注意：本方案的下一部分将描述纳米颗粒在靶向细胞中用于荧光标记及产生 MRI 对比度的应用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 利用纳米颗粒对靶细胞进行荧光标记——共聚焦显微镜观察
注意：纳米颗粒（PB NPs、GdPB 和 MnPB）可用于荧光标记靶向细胞群体（通过共聚焦显微镜监测），步骤如下：
<ol>
	<li>荧光纳米颗粒的合成
	<ol>
		<li>按照第1和第2节中详述的步骤，合成GdPB-A488、GdPB-A488-Eot3、MnPB-A488、MnPB-A488-ANG2，用于对特定细胞群体进行荧光标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光标记靶向细胞的制备
	<ol>
		<li>将1.5号微盖玻片浸入0.002%聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶液中90分钟以进行包被。取出盖玻片，室温干燥24小时。</li>
		<li>接种细胞（例如 EoL-1、BSG D10、SUDIPG1）接种于置于6孔板中的包被盖玻片上，于37°C、5% CO₂培养箱中孵育 37 °C 和5% CO2 至少孵育16小时。用1× PBS溶液洗涤细胞，并可选在中性缓冲液中用10%甲醛固定15分钟。随后用染色剂对细胞进行染色 5 µM PBS 中的红色-橙色细胞渗透性染料 37 °C 孵育30分钟。随后，用PBS冲洗细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>&gt;靶向细胞的荧光标记
	<ol>
		<li>加入1%牛血清白蛋白（BSA；溶于去离子水中）以减少细胞上的非特异性结合，并孵育于 37 °C 1小时。</li>
		<li>在含1% BSA的条件下，将细胞与纳米颗粒共同孵育1小时。EoL-1细胞：加入0.2 mg/ml GdPB-A488或GdPB-A488-Eot3进行孵育；BSG D10和SUDIPG1细胞：加入0.2 mg/ml MnPB-A488或MnPB-A488-ANG2进行孵育。用PBS洗涤细胞3次，以去除未结合的纳米颗粒。</li>
		<li>将载有细胞和纳米颗粒的盖玻片小心翻转并置于显微镜载玻片上，确保无气泡残留。用透明指甲油仔细封固盖玻片与载玻片之间的边缘。使用共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 使用纳米颗粒对靶细胞进行荧光标记——流式细胞术
纳米颗粒（PB NPs、GdPB 和 MnPB）可用于对目标细胞群体进行荧光标记（通过流式细胞术监测），步骤如下：
<ol>
	<li>用 PBS 制备目标细胞的悬液。对于纯培养研究，悬液包含单一细胞类型（例如 BSG D10）；将 BSG D10 细胞的细胞沉淀重悬于 PBS 中，浓度为 100,000 个细胞/ml（总体积 10 ml）。对于混合培养研究，悬液包含至少两种细胞类型（例如 EoL-1 和 OE21）；与 BSG D10 类似，分别将 EoL-1 和 OE21 的细胞沉淀重悬于 PBS 中，浓度均为 100,000 个细胞/ml（总体积 10 ml）。
	<ol>
		<li>制备不同比例的 EoL-1:OE21 混合液：1:0（2 ml EoL-1）、3:1（1.5 ml EoL-1，0.5 ml OE21）、1:1（EoL-1 和 OE21 各 1 ml）、1:3（0.5 ml EoL-1，1.5 ml OE21）、0:1（2 ml OE21）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 2 ml 5% BSA 封闭目标细胞（纯悬液和混合悬液），以最大限度减少非特异性结合。</li>
	<li>向细胞中加入 1 ml（1 mg/ml）纳米颗粒，孵育 1 小时。对于 BSG D10 细胞，使用 MnPB-A488、MnPB-A488-AbC（对照抗体）或 MnPB-A488-ANG2）进行孵育。对于 EoL-1 和 OE21 的混合细胞，则使用固定量的 GdPB-A488-Eot3 进行孵育。</li>
	<li>通过在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟，至少洗涤 3 次，以去除未结合的纳米颗粒。将细胞重悬于 1 ml PBS 中，并用 PBS 配制的 10% 甲醛固定。在冰上用 PBS 配制的 10 µg/ml 7-Aminoactinomycin D 染色 30 分钟。用 PBS 洗涤后，使用流式细胞仪分析每个样本中 10,000 个门控细胞。</li>
</ol>
8. 利用纳米颗粒在靶向细胞上产生磁共振成像对比度
纳米颗粒（PB NPs、GdPB 和 MnPB）可用于在靶向细胞群体中产生磁共振成像对比度（在 T1 加权和 T2 加权序列中均可）如下：
<ol>
	<li>模型制备
	<ol>
		<li>培养细胞（例如 BSG D10) 在 T75 培养瓶中培养至约 80% 汇合度。使用适当的生长培养基和培养条件。对于 BSG D10，使用 DMEM + 10% FBS + 1× 青霉素-链霉素 在 37 °C 和5% CO2.</li>
		<li>用 5 ml PBS 洗去细胞中的培养基，随后用 5 ml 含 1% BSA 的 PBS 封闭细胞 1 小时，以最大限度减少非特异性结合。向细胞中加入 5 ml（0.5 mg/ml）纳米颗粒。对于 BSG D10，将细胞分别与 MnPB-A488、MnPB-A488-AbC（对照抗体）和 MnPB-A488-ANG2 共同孵育 1 小时。</li>
		<li>用 5 ml PBS 洗涤细胞 3 次，以去除未结合的纳米颗粒。加入 2 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，37°C 孵育 5 分钟，消化细胞 37 °C 和5% CO2 将其从培养瓶中分离，用于模体制备。加入8 ml DMEM以终止细胞的胰蛋白酶消化。</li>
		<li>以1,000 × g离心5 min收集细胞，吸除上清液。用1 ml PBS重悬细胞，加入1 ml含10%甲醛的PBS固定细胞。加入 100 µl 将每个样本分别加入96孔板的独立孔中。</li>
		<li>添加 100 µl 将1%熔化的琼脂糖溶液（溶于去离子水）加入每个孔中，用移液器反复吹打混匀。让凝胶在室温下静置凝固 4 °C 12 小时。 
		注意：这将得到一个含有附着纳米颗粒的细胞的固化琼脂糖模拟物。</li>
		<li>将模体置于水平放置的3 T临床磁体中，紧邻一块2%琼脂固体（150 cm3）。将模体和琼脂块固定于8通道高清脑线圈的中心位置，在96孔板中段高度处，采用0.5 mm厚的冠状切片测量弛豫时间11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T1- 和 T2-加权序列 
	使用以下参数在临床 MRI 磁共振设备上采集序列：
	<ol>
		<li>使用以下自旋回波序列获取T1加权磁共振图像：回波链（ET）= 1，重复时间（TR）= 650毫秒，回波时间（TE）= 11毫秒，矩阵大小 = 320 × 256，视野（FOV）= 10 × 10厘米2.</li>
		<li>使用以下FRFSE序列获取T2W MR图像：ET = 28；TR = 3,000 msec；TE = 101 msec；矩阵大小 = 384 x 288；FOV = 10 x 10 cm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集后处理
	<ol>
		<li>为便于阅读，使用 ImageJ 将原始灰度图像转换为彩色标度图像：选择 图像 &gt; 类型 &gt; 8 位，将图像转换为灰度。</li>
		<li>扣除琼脂糖溶液的信号贡献后，计算每个样品的归一化强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了基于生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒的一类新型多模态分子成像探针的合成方法。由于荧光成像和分子磁共振成像（MRI）具有互补特性，因此将这两种分子成像模式整合到了纳米颗粒中。这些生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒具有核-壳结构。其合成的关键步骤包括：1）一锅法合成，获得由普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）、含钆普鲁士蓝纳米颗粒（GdPB）或含锰普鲁士蓝纳米颗粒（MnPB）组成的核；2）通过静电自组装方式，利用荧光标记的亲和素对纳米颗粒进行生物功能化修饰；3）利用稳定的亲和素-生物素相互作用，将生物素化配体（抗体）连接到纳米颗粒上。荧光标记的亲和素和生物素化配体共同构成了纳米颗粒的生物功能化外壳。
单锅法合成可制备兼具T1和T2磁共振成像（MRI）对比剂功能的普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）、GdPB或MnPB。通过调整单锅法合成中顺磁性离子盐（硝酸钆(III)和氯化锰(II)）的用量（增加或减少），可改变纳米颗粒核心中负载的顺磁性离子（钆或锰）的含量，从而导致MRI信号强度相应增强或减弱。然而，对合成方案的这些修改可能导致纳米颗粒不稳定或发生聚集...

分子成像是指在细胞、亚细胞和分子水平上对生物过程进行无创且靶向的可视化1。分子成像能够在实时评估样本内源性通路和机制的同时，使其保持在原有的微环境中。通常，分子成像涉及施用一种外源性成像剂，该成像剂以小分子、大分子或纳米颗粒的形式存在，用于可视化、靶向和追踪所研究的相关生理过程2。在分子成像中已探索的多种成像模式包括磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、超声、光声成像、拉曼光谱、生物发光、荧光以及活体显微成像3。多模态成像是指将两种或多种成像模式相结合，通过组合提升对各种生物过程和事件的可视化与表征能力4。多模态成像充分利用了各成像技术的优势，同时弥补了单一技术的局限性3。
本文介绍了生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）的合成方案——这是一类新型的多模态分子成像探针。PB NPs可用于荧光成像和分子磁共振成像（MRI）。普鲁士蓝是一种颜料，由交替排列的二价铁（Fe(II)）和三价铁（Fe(III)）原子构成，形成面心立方网络结构（图1）。PB晶格由线性氰基配体组成，通过FeII-CN-FeIII连接方式形成，并在其三维网络中嵌入阳离子以平衡电荷5。利用PB晶格可嵌入阳离子的特性，可将钆离子和锰离子分别负载到PB NPs中，用于增强MRI对比度。
采用纳米颗粒设计作为磁共振成像（MRI）对比剂的原理在于，这种设计相较于目前的MRI对比剂具有显著优势。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的绝大多数MRI对比剂均为顺磁性的钆螯合物，通过自旋-晶格弛豫机制产生正性对比效应6,7,8。与单个钆螯合物自身产生的信号强度较低相比，将多个钆离子整合到普鲁士蓝（PB）纳米颗粒的晶格结构中可显著增强信号强度（正性对比）3,9。此外，PB晶格中多个钆离子的存在提高了纳米颗粒整体的自旋密度和顺磁性强度，从而扰动其周围局部磁场，通过自旋-自旋弛豫机制产生负性对比效应。因此，含钆纳米颗粒可同时作为T1（正性）和T2（负性）对比剂发挥作用10,11。
在肾功能受损的部分患者中，使用基于钆的对比剂与肾源性系统性纤维化的发展相关8,12, 13。这一观察结果促使研究人员探索将其他顺磁性离子作为磁共振成像（MRI）对比剂的替代选择。因此，普鲁士蓝（PB）纳米颗粒的多功能设计被改进，以将锰离子整合到PB晶格中。与钆螯合物类似，锰螯合物也具有顺磁性，通常用于在MRI中产生正性信号强度7,14。与含钆的PB纳米颗粒一样，含锰的PB纳米颗粒也可作为T1 （正性）和T2 （负性）对比剂发挥作用。
为了整合荧光成像功能，纳米颗粒的“核心”被包覆上一层由荧光标记的糖蛋白亲和素组成的“生物功能化”外壳（图1）。亲和素不仅能够实现荧光成像，还可作为生物素化配体的结合平台，用于靶向特定细胞和组织。亲和素与生物素之间的相互作用是目前已知最强的非共价键之一，具有极高的结合亲和力15。将生物素化配体连接到包被亲和素的普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）上，可赋予这些纳米颗粒分子靶向能力。
采用普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）进行荧光成像和磁共振成像的动机在于这两种成像方式具有互补的特性。荧光成像是最广泛使用的光学分子成像技术之一，能够在高灵敏度下同时可视化多个目标1,16,17。荧光成像是一种安全、无创的成像方式，但其穿透深度和空间分辨率较低1,3,16。相比之下，磁共振成像（MRI）能够在无需电离辐射的情况下，非侵入性地获得高时间分辨率和高空间分辨率的图像1,3,16。然而，MRI 的灵敏度较低。因此，基于两者在穿透深度、灵敏度和空间分辨率方面的互补特性，选择荧光成像与 MRI 作为分子成像技术。
本文介绍了普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）、含钆普鲁士蓝纳米颗粒（GdPB）和含锰普鲁士蓝纳米颗粒（MnPB）的合成及其生物功能化的实验方案。10,11. 以下方法被描述：1）测量纳米颗粒的尺寸、电荷及时间稳定性，2）评估纳米颗粒的细胞毒性，3）测量磁共振成像弛豫率，以及4）利用纳米颗粒对靶向细胞群体进行荧光和分子磁共振成像 体外这些结果表明，纳米颗粒作为多模态分子成像探针具有潜在应用价值 体内.

<table><tbody><tr><td>六氰合铁(II)酸钾三水合物（K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;&amp;middot;3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>氯化锰(II)四水合物（MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钆(III)六水合物（Gd(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211591</td><td></td></tr><tr><td>氯化铁(III)六水合物（FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NG2蛋白多糖生物素偶联抗体（Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody）</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗人嗜酸性粒细胞趋化因子-3抗体（Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3）</td><td>Peprotech</td><td>500-P156GBT</td><td></td></tr><tr><td>Neuro-2a细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>BSG D10细胞系</td><td>实验室库存</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>OE21细胞系</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96062201</td><td></td></tr><tr><td>SUDIPG1神经球</td><td>实验室库存</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Eol-1细胞系</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94042252</td><td></td></tr><tr><td>聚(L-赖氨酸)氢溴酸盐（Poly(L-lysine) hydrobromide）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1399</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（Formaldehyde）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（Bovine serum albumin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>氨基放线菌素D（Aminoactinomycin D）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100（Triton X-100）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 钙黄绿素红-橙 AM（CellTrace Calcein Red-Orange, AM）</td><td>Life Technologies</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>亲和素-Alexa Fluor 488（Avidin-Alexa Fluor 488）</td><td>Life Technologies</td><td>A21370</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Instech</td><td>P270</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>QSonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>加热板/磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>超洁净铝箔</td><td>VWR</td><td>89107-732</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml 锥形微量离心管</td><td>VWR</td><td>87003-295</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>试管架</td><td>VWR</td><td>82024-342</td><td></td></tr><tr><td>一次性塑料比色皿</td><td>VWR</td><td>7000-590 (/586)</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer毛细管样品池</td><td>VWR</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>离心过滤器，0.2微米离心柱</td><td>VWR</td><td>82031-356</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>VWR</td><td>29442-056</td><td></td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶EDTA溶液（1x）</td><td>JR Scientific</td><td>82702</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级PBS（1x）</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>XTT细胞增殖检测试剂盒</td><td>Trevigen</td><td>4891-025-K</td><td></td></tr><tr><td>T75培养瓶</td><td>89092-700</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）</td><td>Biowhitaker</td><td>12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10437-010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（1x）</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV1200共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>带腔室载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>正方形显微盖玻片，1.5号</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>显微载玻片</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>RPMI培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 T临床MRI磁体</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml圆底烧瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于多模态分子成像应用的生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

多模态分子成像技术利用多种互补的成像方法，可在细胞、亚细胞及分子水平上对生物过程进行可视化观察。这些成像探针有助于在活体（in vivo）条件下实时评估生物通路与机制，从而提升诊断与治疗效果。本文介绍了生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）的合成方案——这是一类新型探针，适用于多模态分子成像应用。该纳米颗粒整合了荧光成像与磁共振成像（MRI）两种成像模式，二者具有互补特性。PB NPs采用核壳结构设计，其中钆和锰离子嵌入普鲁士蓝晶格的间隙位置，可在T1和T2加权序列中均产生MRI对比效应。通过静电自组装方式，将荧光标记的亲和素包覆于PB NPs表面，实现荧光成像功能。随后，利用生物素化配体对亲和素包被的纳米颗粒进行修饰，赋予其分子靶向能力。实验检测了纳米颗粒的稳定性、毒性及其MRI弛豫率。最后，通过体外（in vitro）荧光成像与分子MRI实验，验证了这些生物功能化PB NPs的多模态分子成像能力。

采用一锅合成法，可稳定地合成单分散的普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs，平均直径为 78.8 nm，多分散系数（PDI）= 0.230；由动态光散射仪测定）、GdPB（平均直径为 164.2 nm，PDI = 0.102）或 MnPB（平均直径为 122.4 nm，PDI = 0.124）（图 2A）。所合成纳米颗粒的实测 zeta 电位均低于 -30 mV（图 2B），表明颗粒因表面电荷而具有中等稳定性。这些纳米颗粒在 5 天内表现出良好的时间稳定性，其粒径（流体动力学直径）保持一致（图 2C）。
当与细胞共孵育时，纳米颗粒（PB NPs、GdPB 和 MnPB）在低于一定阈值浓度时对细胞表现出可忽略的细胞毒性（图3）。PB NPs 对 Neuro2a 细胞的细胞毒性研究表明，在与 Neuro2a 细胞共孵育且浓度低于 0.67 × 10-6 mg/细胞时，其细胞毒性可忽略不计（图3A）。通过将...

本方案描述了生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒的合成及其作为多模态分子成像探针的应用。该纳米颗粒具有核-壳结构，其中位于纳米颗粒核心内的钆或锰离子可产生磁共振成像（MRI）对比效应。生物功能化外壳则包含用于荧光成像的荧光团以及用于分子靶向的靶向配体。

多模态分子成像技术能够利用多种成像手段，在细胞、亚细胞和分子水平上对生物过程进行可视化观察。

本实验的总体目标是合成可用于多模态分子成像剂的生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒。首先合成含有钆或锰离子的普鲁士蓝纳米颗粒，以增强磁共振成像（MRI）信号；第二步是在纳米颗粒表面连接荧光素标记的链霉亲和素（fluorescent avadon），从而赋予其荧光成像能力。接下来，将包被阿瓦单抗的纳米颗粒与所需的细胞靶向生物素化抗体进行生物功能化修饰。最后一步是对生物功能化修饰后的纳米颗粒进行质量控制检测，通过测定其粒径、泽塔电位及时间稳定性来评估性能。最终，这些生物功能化修饰的纳米颗粒可用于多模态分子成像应用，结合荧光成像与磁共振成像（MRI），在混合细胞群体中可视化特定的靶向细胞亚群。目前商业化的成像试剂通常为单一模式，仅能提供解剖学水平的分辨率。普鲁士蓝纳米颗粒结合了两种互补的成像模式——磁共振成像（MRI）和荧光成像，可实现分子水平和亚细胞水平的成像。多模态纳米颗粒的应用不仅涵盖癌症和炎症性疾病的诊断，还包括对其治疗反应的监测。这是因为经过生物功能化的纳米颗粒能够靶向并结合体内特定区域的一群细胞。尽管该方法可为癌症和炎症性疾病的诊断及治疗反应提供重要信息，但它也可应用于其他病理状况，从而受益于分子成像的高灵敏度和特异性。通过荧光和磁共振成像（MRI），我们首次提出制备此类纳米颗粒的构想，源于我们发现普鲁士蓝——一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准可用于人体口服的试剂——可通过单组分合成方案稳定合成，并能利用标准的生物偶联技术实现高效生物功能化。首先，将五毫升去离子水中配制五百万摩尔浓度的六氰合铁酸钾（II）溶液，制备溶液A。接下来，配制溶液B，其中包含2.5毫摩尔的三氯化铁和2.5毫摩尔的二氯化锰，溶于10毫升去离子水中，用于合成锰普鲁士蓝纳米颗粒。其他纳米颗粒的合成方法可参见文本方案。将溶液B转移至圆底烧瓶中，并在室温下以1000转/分钟的速度搅拌溶液。使用蠕动泵将溶液A以每小时10毫升的速率逐滴加入容器中。加完溶液A后，将混合物在1000转/分钟下继续搅拌30分钟。然后将1毫升该混合物分装至微量离心管中，每管加入0.2毫升5毫摩尔氯化钠溶液。将离心管在20,000 × g条件下离心至少10分钟，然后小心移除上清液，保留纳米颗粒沉淀。接着，向每份沉淀中加入1毫升去离子水。使用微量吸头通过超声处理使纳米颗粒在溶液中均匀悬浮。最终离心后，至少再洗涤纳米颗粒三次，以去除悬浮液中初始反应的组分；按照文本方案所述，用荧光标记的寡核苷酸（den）包被纳米颗粒后，将纳米颗粒重新悬浮于1毫升去离子水中；取出生物素化抗体储备液。此处使用抗神经胶质抗原2（anti-neuron glial antigen two）和抗人嗜酸性粒细胞趋化因子3（anti-human eotaxin three）。将生物素化抗体转移至0.2微米尼龙微量离心滤膜管中，然后以14,000 × g离心10分钟。接下来，每毫克包被腺病毒的纳米颗粒加入不超过 0.05 毫克的抗体，并用铝箔包裹试管以避光。在 4 摄氏度下轻轻振荡孵育 2 至 4 小时。抗体结合完成后，取 10 微升浓度为 1 毫克/毫升的纳米颗粒样品，加入 990 微升去离子水中，盖紧一次性塑料比色皿的盖子，涡旋混匀。然后使用测量角度为173度的动态光散射系统测定纳米颗粒的平均粒径。首先，在磷酸盐缓冲液（PBS）中制备10毫升细胞悬液，细胞浓度约为每毫升10万个细胞；对于混合培养的试管，应按照文本方案中所述制备含有不同比例各细胞系的样品。向每支试管中加入2毫升5% BSA，以封闭细胞并尽量减少非特异性结合。然后向每支试管中加入1毫升浓度为1毫克/毫升的生物功能化纳米颗粒，并将混合物孵育1小时。接下来，将离心管在1000 × g条件下离心5分钟，去除未结合的纳米颗粒，并用1毫升PBS重悬沉淀。此步骤至少重复两次。使用PBS中的10%甲醛固定细胞，然后加入PBS中含10微克/毫升的七氨基放线菌素D（7-amino actinomycin D）对细胞进行染色，将离心管置于冰上孵育30分钟，随后用PBS洗涤细胞。接下来，将样品加入流式细胞仪，分析每个样品中10,000个门控细胞。文中实验方案描述了使用激光共聚焦显微镜成像结合荧光纳米颗粒的细胞的类似步骤。首先，在T75培养瓶中培养细胞至约80%融合度，然后用5 mL PBS洗涤细胞以去除培养基。加入5毫升含1% BSA的PBS，封闭细胞1小时。然后向培养瓶中加入5毫升浓度为0.5毫克/毫升的抗体包被纳米颗粒，孵育细胞1小时，使纳米颗粒与细胞结合。接着用5毫升PBS洗涤细胞3次，以去除未结合的纳米颗粒。然后加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，将细胞置于孵育环境中 5 分钟，以使细胞从培养瓶上脱落。加入 8 毫升 DMEM 以终止胰蛋白酶的消化作用，随后将细胞悬液转移至离心管中。以 1000 ×g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。接下来，吸除上清液，并将细胞重悬于 1 毫升 PBS 中。加入 1 毫升含 10% 甲醛的 PBS 以固定细胞，然后将每份样品各 100 微升转移至 96 孔平底板中的不同孔内。向每孔加入 100 微升熔化的 1% 琼脂糖水溶液，并用移液器吹打混匀。将凝胶在 4 摄氏度下静置 12 小时，使其完全固化，形成模体。凝胶固化后，将模体与一块尺寸为 150 厘米的立方体、含 2% 琼脂的固体块并排放置，置于水平方向的 3 T 临床磁体中。随后，将模体和琼脂块固定于八通道 HD 脑线圈中心位置，用于测量弛豫时间。采用冠状面切片，厚度为 0.5 毫米，切片位置位于 96 孔板的中部高度。使用动态光散射实验测定所生成纳米颗粒的流体动力学直径。稳定性研究验证了纳米颗粒在以水为基质及以细胞培养基为基质的实验中均具有长期稳定性。激光共聚焦显微镜显示，负载针对嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（EOT）的抗体的荧光纳米颗粒特异性结合于嗜酸性粒细胞（EOL）1细胞表面。当使用针对NG2的抗体时，它们特异性结合于BSG神经球的表面。通过流式细胞术检测，这些生物功能化的纳米颗粒能够成功地对目标细胞群体进行荧光标记。此外，即使在靶细胞与对照细胞比例较低的情况下，这些纳米颗粒仍能够靶向混合物中的特定细胞亚群。最后，经生物功能化的纳米颗粒增强了靶向细胞的磁共振成像（MRI）对比度，即用装载了造影剂的纳米颗粒处理的细胞。与经对照颗粒处理的细胞相比，两种抗体在T1加权序列中显示出高信号强度。相比之下，A NNG两种纳米颗粒在T₂加权序列中表现出比对照颗粒更低的信号强度。一旦掌握。如果操作得当，生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒的合成可在两天内完成。与本实验方法类似，可通过使用不同的生物聚合物和靶向配体对纳米颗粒进行生物功能化，以研究新的疾病和新的病理状态。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成普鲁士蓝纳米颗粒，并将其用于荧光和成像应用，以标记细胞群体。请务必严格遵守在临床磁共振成像（MRI）磁体中开展研究的安全指南和标准操作规程。

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生物工程

Biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子多式联运分子成像应用

用于评估纳米颗粒在细胞内生物分布的生物成像方法，适用于纳米制剂化合物的治疗和诊断监测。通过组织学共定位分析，本文所述方法具有高灵敏度和特异性。这些方法为从啮齿类动物到人类的应用提供了转化路径。...

用于诊断与治疗监测的纳米材料注册生物成像

植物病毒纳米颗粒（VNPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文介绍了植物VNPs的增殖、纯化、表征及生物偶联的操作步骤。最后，我们展示了利用小鼠异种移植模型和荧光成像技术，将VNPs应用于肿瘤靶向与成像的研究。...

病毒纳米颗粒用于 在体 肿瘤成像

本文介绍一种合成具有强磁矩和强近红外（NIR）吸收能力的磁等离子体纳米颗粒的实验方案。该方案还包括通过抗体的Fc片段将抗体偶联到纳米颗粒上，适用于需要分子特异性靶向的各种生物医学应用。...

免疫靶向磁-等离子体纳米簇的合成

本方案描述了联合近红外荧光（NIRF）成像与微型计算机断层扫描（microCT）技术用于可视化脑血栓栓塞的应用。该技术可实现对血栓负荷及其演变过程的定量分析。NIRF成像技术可用于观察离体脑组织中荧光标记的血栓，而microCT技术则利用金纳米颗粒在活体动物体内实现血栓的可视化。...

结合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞

在此，我们介绍一种获取 68镓掺杂的氧化铁纳米颗粒 通过 快速微波驱动合成。该方法可制备 PET/(T1)MRI 纳米颗粒，标记效率高于 90%，放射化学纯度达 99%，合成时间仅需 20...

68Ga 掺杂铁氧化物纳米颗粒的合成用于双模正电子发射断层扫描/(T1)磁共振成像

在本研究中，我们提供了一种利用抗体对磁性纳米材料进行生物功能化的方案，以实现对特定细胞的靶向。作为示例，我们使用铁纳米线来靶向癌细胞。...

磁性纳米材料的生物功能化

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。...

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

本方案详细描述了使用近红外二区光学成像设备对小鼠进行实时近红外二区荧光成像的操作过程。...

一种用于血管与肿瘤成像的高亮度近红外二区荧光探针

本文介绍了一种用于合成持久发光纳米材料（PLNPs）的方案，并展示了其在可重写显示和艺术加工中的潜在应用，这些应用利用了在紫外光（365...

用于可重写显示与照明应用的持久发光纳米颗粒的合成

血脑屏障是胶质母细胞瘤治疗药物递送的重大障碍，而该疾病目前尚无治愈手段。本文报道了一种体内成像引导的氧化铁治疗性纳米平台，该平台凭借其尺寸可绕过这一生理屏障，并在肿瘤部位富集。...

纳米颗粒递送寡核苷酸载荷在多形性胶质母细胞瘤动物模型中的应用

本文介绍了一种量子点纳米微球（QDNB）的制备方法，以及利用基于QDNB的侧向层析免疫检测试纸条检测疾病生物标志物的方案。检测结果可在15分钟内通过紫外光照射进行定性判读，或使用荧光试纸条读数仪进行定量测定。...

基于量子点纳米珠的荧光侧向流免疫分析法

学习生物功能化普鲁士蓝纳米粒子的合成方法，用于多式联运分子成像应用。该方法结合钆或锰离子增强磁共振成像信号，并通过荧光标记实现靶向细胞可视化，为生物医学研究提供高灵敏度成像工具。

用于多模态分子成像应用的生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒

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