Biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子多式联运分子成像应用
April 28th, 2015
该协议描述了生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒的合成及其作为多模式分子成像剂的用途。纳米颗粒具有核壳设计，其中纳米颗粒核内的钆或锰离子产生 MRI 对比度。生物功能外壳包含用于荧光成像的荧光团和用于分子靶向的靶向配体。
该程序的总体目标是合成生物功能化的普鲁士蓝纳米颗粒，用于多模态分子成像剂。这是通过首先合成含有钆或锰离子的普鲁士蓝纳米颗粒来实现的，这些纳米颗粒可增强 MRI 信号。第二步是将荧光 avadon 附着在纳米颗粒的表面，从而赋予荧光成像能力。
接下来，使用所需的细胞靶向生物素化抗体对 Avadon 包被的纳米颗粒进行生物功能化。最后一步是通过测量生物功能化纳米颗粒的大小、zeta 电位和时间稳定性来对生物功能化纳米颗粒进行质量控制检查。最终，生物功能化纳米颗粒用于多模式分子成像应用，以使用荧光成像和 MRI 可视化混合物中特定的目标细胞群。
目前的市售显像剂通常是单模式的，并且仅在解剖水平上提供分辨率。普鲁士蓝纳米颗粒结合了 MRI 和荧光两种互补成像模式，并允许分子成像和亚细胞水平。除了监测其治疗反应外，多模态纳米颗粒的应用还扩展到癌症和炎症性疾病的诊断。
这是因为生物功能化的纳米颗粒可以靶向并结合到身体指定区域内的细胞群中。虽然这种方法可以提供对癌症和炎症性疾病诊断和对治疗反应的见解，但它也可以应用于其他病理状况，这些病理状况将受益于分子成像的敏感性和特异性。使用荧光和 MRI，当我们确定普鲁士蓝和 FDA 批准的人类口服试剂可以使用单组分合成方案稳定合成并使用标准生物偶联物技术稳健地生物功能化时，我们首先想到了生产这些纳米颗粒的想法。
首先，在 5 毫升去离子水中制备 500 万摩尔的六撒冷钾铁酸盐溶液 2 以制备含有 2.5 毫摩尔三氯化铁和 2.5 毫摩尔锰的下一个修复溶液 B。在 10 毫升去离子水中加入两种氯化物，用于合成锰普鲁士蓝纳米颗粒。可以按照文本方案中的指示合成其他纳米颗粒，将溶液 B 转移到圆底烧瓶中，并在室温下以 1000 RPM 搅拌溶液。
使用蠕动泵以每小时 10 毫升的速度将溶液 A 滴入容器中。溶液 A 添加完成后，以 1000 RPM 的速度搅拌混合物 30 分钟。然后将 1 毫升等分试样的混合物转移到微量离心管中，并向每个管中加入 0.2 毫升 5 毫氯化钠。
将试管以 20， 000 倍 G 离心至少 10 分钟，然后小心去除螺旋体，留下纳米颗粒沉淀。接下来，向每个颗粒中加入 1 毫升去离子水。使用微型尖端通过超声处理将纳米颗粒均匀地悬浮在溶液中。
将纳米颗粒再洗涤至少三次，以在最后一次旋转后从悬浮液中去除初始反应的组分，按照文本方案中的说明在纳米颗粒上涂覆荧光碱后，将纳米颗粒重新悬浮在一毫升去离子水中，从冰箱中取出生物素化抗体原液。这里。使用抗神经元神经胶质抗原 2 和抗人嗜酸性粒细胞趋化因子 3。将生物素化抗体转移至 0.2 微量尼龙微量离心过滤器中，然后以 14， 000 倍 G 离心管 10 分钟。
接下来，每毫克 Aden 包被的纳米颗粒添加小于或等于 0.05 毫克的抗体，并用铝箔覆盖试管以保护它们避光。将试管在 4 摄氏度下轻轻摇动孵育 2 到 4 小时。附着抗体后，将 10 微升每毫升 1 毫克纳米颗粒样品加入 990 微升去离子水中，放入一次性塑料瓶盖中，然后 V 混合。
然后，使用测量角度为 173 度的动态光散射系统确定纳米颗粒的平均尺寸。首先在 PBS 中制备 10 毫升细胞悬液，浓度约为每毫升 100， 000 个细胞，用于混合培养管，含有每种细胞系的不同比例，应按照文本方案中的说明以 2 毫升 5%BS，A 向每个试管中制备，以封闭细胞并尽量减少非特异性结合。然后加入每毫升 1 毫克的 1 毫升，向每个试管中对纳米颗粒进行生物功能化，并将混合物孵育 1 小时。
接下来，通过以 1000 倍 G 旋转试管 5 分钟来冲洗细胞中未结合的纳米颗粒，并在 1 毫升 PBS 中重新弯曲沉淀。至少再重复此过程两次。使用 10% 甲醛的 PBS 溶液固定细胞，然后加入 10 微克/毫升、7 氨基肌动蛋白和霉菌素 D 的 PBS 溶液对细胞进行染色，将试管在冰上孵育 30 分钟，然后用 PBS 冲洗细胞。
接下来，将样品加载到流式细胞仪中，并分析每个样品中的 10， 000 个门控细胞。文本协议中描述了使用激光共聚焦显微镜对细胞结合的成像细胞的类似程序。首先，将细胞佩戴在 T 75 培养瓶中至约 80% 汇合，然后用 5 毫升 PBS 冲洗细胞中的培养基。
在 PBS 中加入 5 毫升 1% BSA，封闭细胞 1 小时。然后向培养瓶中加入 5 毫升每毫升 0.5 毫克抗体包被的纳米颗粒，并将细胞孵育 1 小时，让纳米颗粒结合。接下来，用 5 毫升 PBS 冲洗细胞 3 次，以去除未结合的纳米颗粒。
然后加入 2 mL 0.25% tripsin EDTA 溶液，孵育细胞 5 分钟，将细胞从培养瓶中分离出来。加入 8 毫升 DMEM 以淬灭试用素，然后将细胞悬液转移到离心管中。以 1000 倍 G 离心 5 分钟以沉淀细胞。
接下来，吸出螺旋体并将细胞重悬于 1 毫升 PBS 中。在 PBS 中加入 1 毫升 10% 甲醛以固定细胞，然后将每个样品的 100 微升转移到 96 孔平底板的单独孔中。向每个孔中加入 100 微升熔融的 1%aros 去离子水溶液，并通过上下移液混合。
让凝胶在 4 摄氏度下凝固 12 小时，以产生模型。凝胶凝固后，将模型放在水平的 3 T 临床磁铁中，旁边是 150 厘米的 2% 琼脂固体立方体块。然后将模型和琼脂块固定在八通道 HD 脑线圈的中心内以测量弛豫时间，使用 0.5 毫米厚的冠状切片在 96 孔板的中高处拍摄动态光散射测定用于确定生成的纳米颗粒的流体动力学直径稳定性研究验证了纳米颗粒的长期稳定性用于水基和基于细胞培养基的实验。
激光共聚焦显微镜显示荧光纳米颗粒加载了专门针对 EOL one 细胞表面发现的 EOT 3 抗体。当使用 NG 2 抗体时，它们会特异性结合到 BSG 神经球的表面。生物功能化的纳米颗粒能够成功地荧光标记通过流式细胞术测量的靶细胞群。
此外，即使在低靶细胞下，纳米颗粒也能够靶向混合物中的特定细胞亚群以控制细胞比率。最后，生物功能化纳米颗粒增加了目标细胞的 MRI 对比度，这些细胞用负载 nng 的纳米颗粒处理。与对照颗粒处理的细胞相比，两种抗体在 T 1 加权序列中显示高信号。
相比之下，与对照颗粒相比，A NNG 两个纳米颗粒在 T 两个加权序列中赋予了低强度。一旦掌握。生物功能化 presion blue 纳米粒子的合成如果执行得当，可以在两天内完成。
与此过程类似，纳米颗粒可以用不同的生物聚合物和靶向配体进行生物功能化，以研究新的疾病和新的病症。观看此视频后，您应该对如何合成普鲁士蓝纳米颗粒进行荧光和成像应用以标记细胞群有很好的了解。不要忘记严格遵循安全指南和标准作程序，以便在临床 MRI 磁体中进行研究。
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概览
本协议概述了用于多模态分子成像的生物功能化普鲁士蓝纳米粒子的合成。这些纳米粒子通过钆或锰离子增强MRI对比度，并配备荧光团用于荧光成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米粒子合成
- 分子成像
- 生物医学应用
背景
- 普鲁士蓝纳米粒子作为成像剂。
- 钆和锰离子改善MRI信号。
- 荧光标记实现靶向成像。
- 生物功能化提高了细胞靶向的特异性。
研究目的
- 合成用于成像的生物功能化纳米粒子。
- 改善MRI和荧光成像能力。
- 在复杂混合物中可视化特定细胞群体。
使用的方法
- 合成含有钆或锰的普鲁士蓝纳米粒子。
- 将荧光avadon附着到纳米粒子上。
- 用生物素化抗体进行生物功能化以实现靶向。
- 通过尺寸、zeta电位和稳定性测量进行质量控制。
主要结果
- 成功合成了生物功能化纳米粒子。
- 观察到钆/锰增强的MRI对比度。
- 确认了荧光成像能力。
- 质量控制指标满足了稳定性和尺寸要求。
结论
- 生物功能化的普鲁士蓝纳米粒子是有效的成像剂。
- 多模态成像允许更好地可视化目标细胞。
- 在生物医学研究和诊断中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) enable multimodal molecular imaging by integrating MRI and fluorescence modalities, supporting high-resolution visualization of targeted cell populations. This dual-mode capability enhances predictive confidence in early discovery and translational research by providing complementary biological and anatomical information. The approach addresses the need for sensitive, specific, and multiplexed imaging agents in preclinical and disease-relevant model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports interrogation of molecular pathways and cell populations using targeted imaging agents.
- Enables functional validation of cell-surface markers through ligand-directed nanoparticle binding.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming target engagement in complex mixtures.
- Improves predictive confidence for advancing imaging biomarkers in discovery pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, biofunctionalized nanoparticles for quantitative imaging assays.
- Enables reproducible assessment of nanoparticle-cell interactions via flow cytometry and confocal microscopy.
- Supports standardization of imaging readouts for downstream screening workflows.
- Provides scalable platforms for multiplexed evaluation of targeting ligands.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Enables continuity from in vitro validation to in vivo imaging studies.
- Supports risk-adjusted advancement of imaging agents for disease monitoring and response assessment.
- Facilitates mechanistic insight into nanoparticle biodistribution and target specificity.
Pipeline & Workflow Integration
Biofunctionalized PB NPs fit within the continuum from early discovery through preclinical imaging, bridging target validation and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via targeted molecular imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers multiplexed readouts (MRI relaxivity, fluorescence intensity) for comparative analysis of targeting efficiency.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by validating imaging agents in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse targeting ligands and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in imaging agent development.
- Operational Value: Standardizes nanoparticle synthesis, functionalization, and quality control for reproducibility.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for imaging agent advancement and portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of imaging modalities and disease indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, biofunctionalization, and imaging assay development.
- Needs access to MRI, fluorescence imaging, and analytical instrumentation for quality control.
- Demands cross-team standardization of nanoparticle characterization and imaging protocols.
- Adaptable to various targeting ligands and cell models with protocol optimization.
- Stability and toxicity assessments are essential for translational progression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:25
Synthesis of Manganese Prussian Blue (MnPB) Nanoparticles
4:09
Biofunctionalization and Characterization of MnPB Nanoparticles
5:29
Fluorescent Labeling of Cells with Nanoparticles
6:59
Generating MRI Contrast on Cells with Nanoparticles
9:01
Results: Imaging of Cells Labeled with Prussian Blue Nanoparticles
10:34
Conclusion
