Name: 由微型条纹分析技术在微流控设备混合不均匀 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解微型条纹技术如何用于微流控设备中的混合不均匀性测量。该方法通过Hoffman调制对比显微镜构建系统，实现浓度梯度的非侵入式成像与定量分析。

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本工作获得中国台湾科技部资助，项目编号为 101-2221-E-002-064-MY3。

1. 微流控装置的制备
<ol>
	<li>使用图形布局软件（例如 AutoCAD）绘制 T 型微通道的轮廓。T 型微通道的两条进样通道宽度为 90 µm，长度为 2,500 µm，汇流通道宽度为 180 µm，长度为 3,000 µm。将每条通道的末端连接至一个直径为 1,100 µm 的独立圆形区域。</li>
	<li>分别标记曝光区域为“clear”（透光区）和遮蔽区域为“dark”（遮光区）。对于负性光刻胶（例如 SU-8），T 型微通道的形状应为“clear”，周围区域为“dark”。</li>
	<li>使用波长为 442 nm、最小特征尺寸为 2 μm 的激光图形发生器，将 T 型微通道的图案转移至镀铬玻璃掩模上。</li>
	<li>利用该掩模、基底（例如 单面抛光硅片）和永久性环氧光刻胶（例如 SU-8），通过标准光刻工艺制作模具。光刻胶层厚度为 55.2 μm。通常情况下，光刻胶厚度应小于物镜的焦深17-19。</li>
	<li>使用该模具和聚二甲基硅氧烷（PDMS）等透明材料制备 T 型微通道20。</li>
	<li>为实现流体连接，使用外径为 2 mm 的不锈钢管在 PDMS 上打孔，使孔与 PDMS 上的圆形图案对齐。</li>
	<li>将 PDMS 表面和载玻片表面在 60 W 条件下进行 30 秒的氧气等离子体处理。将 PDMS 贴合至载玻片上，两种材料的氧化表面可形成牢固键合。将键合后的 PDMS 结构置于 120 °C 的加热板上加热 5 分钟。</li>
	<li>将聚四氟乙烯（Teflon）管插入打好的孔中以实现流体连接。</li>
</ol>
2. 实验设置
<ol>
	<li>通过移除聚光镜前焦平面上的狭缝板，并将5倍物镜后焦平面上的调制器替换为刀口边缘，由霍夫曼调制对比显微镜构建微尺度纹影系统3。相关深度取决于物镜的数值孔径17-19，应足以覆盖整个微流控装置的深度。刀口边缘表面通过阳极氧化铝处理使其变黑，以降低其反射率。</li>
	<li>通过C型接口适配器将高速相机安装至显微镜的三目镜筒上，使相机经由分光镜对准显微镜的光路。通过以太网电缆将相机连接至台式计算机。将相机的伽马校正设置为1，使其灰度读数与输入亮度成正比。</li>
	<li>打开光源。为避免产生过多热量，请使用LED（发光二极管）照明。</li>
	<li>使用图像处理软件（例如，MATLAB中的imread函数）获取所采集图像的灰度值。移除刀口边缘，调节照明、光圈和曝光时间，使图像的平均灰度读数比最大值低约10%。此值代表0%遮断时的背景强度，对于8位图像，我们采用230作为参考值。</li>
	<li>插入刀口边缘以完全阻挡入射光。记录图像的平均灰度读数。此值代表100%遮断时的背景强度，对于8位图像，该值约为15。</li>
	<li>调节刀口边缘的位置，使所采集图像的平均灰度读数处于0%和100%遮断值的中间位置。此时遮断程度设定为50%。</li>
	<li>准备两种已知折射率21且彼此完全互溶的透明流体作为组分。为评估混合物折射率对浓度的依赖性，查阅文献21或使用Gladstone-Dale方程22。若在整个浓度范围内曲线呈非线性，则应选择其他流体组分。随后，选择一个特定组成范围，在此范围内溶液的折射率随浓度呈线性变化。例如，使用质量分数为0.05的稀乙醇水溶液和水作为工作流体。</li>
	<li>将T型微通道置于样品台上。调整T型微通道方向，使汇流通道与刀口边缘平行（图1）。</li>
	<li>准备两个相同的注射器：注射器A中装入作为参考流体的工作流体（水），注射器B中装入另一种工作流体（稀乙醇水溶液）。注射器尺寸取决于所需的流速Q和注射泵的规格：Q = πd2V/4，其中d为注射器内径，V为推杆速度。通常可通过选用较小的注射器以提高V来防止流动脉动23。</li>
	<li>用烧杯收集T型微通道的出口流体。确保聚四氟乙烯出口管固定在烧杯壁上，且其末端位于液面以下，以避免液滴断裂引起的振动。</li>
</ol>
3. 校准
<ol>
	<li>获取两种流体混合的图像以及参考图像。
	<ol>
		<li>在给定的雷诺数 Re 下，设定注射泵的流速 Q。Q 的计算公式为 Q = µ(W+D)Re/4ρ，其中 µ 和 ρ 分别为工作流体的黏度和密度，W 和 D 分别为 T 型微通道汇流段的宽度和深度。</li>
		<li>将注射器 A 装入一台泵，注射器 B 装入另一台泵。通过聚四氟乙烯管将 T 型微通道的两个入口分别连接至注射器 A 和注射器 B。启动注射泵，以相同的体积流量将工作流体输送至 T 型微通道中。</li>
		<li>等待直至稳定流动建立。稳定流动状态的判据是出现静止的纹影图样。</li>
		<li>使用相机控制软件以 30 fps 的帧率记录 20 帧流体混合图像。</li>
		<li>停止装载注射器 B 的泵，仅通过一个入口以恒定速率将参考流体（水）泵入 T 型微通道的汇流段。</li>
		<li>等待直至达到稳定流动状态，且未观察到纹影图样。</li>
		<li>当 T 型微通道中无光学不均匀性时，使用相机控制软件采集参考图像。以 30 fps 的帧率记录 20 帧图像。</li>
		<li>在不同的雷诺数（Re = 1、5、10、20 和 50）下重复步骤 3.1.1 至 3.1.7，以确保 T 型微通道汇流区域不出现复杂的流动结构24。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用图像处理软件将所获取的图像 I(i, j) 除以参考图像 I0(i, j)25，其中 i 和 j 为像素索引。</li>
	<li>使用 CFD（计算流体力学）软件包模拟指定流体在 T 型微通道中的混合过程。
	<ol>
		<li>构建 T 型微通道几何结构的三维模型，并将流动域离散为结构化网格。为提高精度，在 T 型微通道的汇流区和中心区域采用更细密的网格。</li>
		<li>设定流体的物理属性，并为流动域建立边界条件。在求解过程中，根据上一次迭代得到的浓度确定浓度依赖的扩散系数，以更新局部浓度26。</li>
		<li>通过进行网格敏感性研究27，检验计算结果的敏感性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 xy 平面上的每个节点 (xi, yi)，使用 CFD 后处理工具通过梯形法则对通道深度方向上的浓度场取平均值：w(xi, yj) = {∑k [w(xi, yj, zk) + w(xi, yj, zk+1)]∙(zk+1 - zk)/2}/D28，其中 D 为通道深度。采用中心差分格式计算浓度在横向方向上的导数：(∂w/∂y)i, j = [w(xi, yj+1) - w(xi, yj-1)]/(yj+1 - yj-1)。</li>
	<li>对于正负梯度，提取指定位置（如 y = 0（中心线，流向方向）或不同给定 x（横向方向））处的灰度值比 I/I0（由步骤 3.2 获得）和质量分数梯度 ∂w/∂y（由步骤 3.4 获得）。</li>
	<li>绘制结果，并通过线性回归确定 I/I0 与 ∂w/∂y 之间的关系：I/I0 = C1∂w/∂y + C2（C1 和 C2 为常数）。</li>
</ol>
4. 定量分析
<ol>
	<li>在目标微流控装置中重复步骤 3.1 至 3.2 进行混合。目标微流控装置的深度应与 T 型微通道的深度相同或相近。如果预期会出现非稳态现象，则在步骤 3.1.4 中改为采集一段视频（图像序列）。帧率应足够高，以清晰分辨瞬态流动的动力学过程，同时曝光时间应与步骤 2.4、2.5、3.1.4 和 3.1.7 中所用值保持一致。</li>
	<li>利用步骤 3.6 中获得的关系，将灰度值比转换为目标微流控装置中质量分数的梯度。</li>
</ol>

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<li>Korczyk, P. M., Cybulski, O., Makulska, S., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unsteadiness+of+the+rates+of+flow+on+the+dynamics+of+formation+of+droplets+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Effects of unsteadiness of the rates of flow on the dynamics of formation of droplets in microfluidic systems.</a> Lab on a Chip. 11 (1), 173-175 (2011).</li>
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<li>Sun, C. -l, Huang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+schlieren+visualization+of+near-bubble+mass+transport+during+boiling+of+2-propanol%2Fwater+mixtures+in+a+square+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">Microscale schlieren visualization of near-bubble mass transport during boiling of 2-propanol/water mixtures in a square capillary.</a> Experiments in Fluids. 55 (7), 1778(2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在微流控装置中进行流体混合时，微尺度纹影技术能够通过量化光强度的变化来测量浓度梯度的大小。由于该技术的原理依赖于检测光传播路径的变化，因此工作流体和微流控装置必须对入射光透明。此外，该方法要求溶液的折射率与其组分之间存在线性关系，因此必须对工作流体进行初步评估。除本文所示的乙醇水溶液外，微尺度纹影技术已成功应用于测量盐度梯度29和溶质毛细对流30。为了获得准确的测量结果，校准过程中所使用的光圈范围、照明强度、曝光时间、物镜和微通道深度必须与定量分析过程中使用的参数完全相同。此外，物镜的关联深度必须足够大，以覆盖微流控装置的整个深度。
T形微通道中混合过程的校准是微尺度纹影技术准确定量的最关键步骤。为成功实施本方法，使用者需要正确对齐管路连接，采用小规格注射器或气动装置输送流体以避免流动振荡23，使用LED光源以减少多余热量，于低雷诺数条件下进行校准程序24，并将微流控装置置于焦平面以消除高阶光学效应31。可测得的最低梯度（亮条纹，∂w/<...

流体混合是许多工业过程和生物系统中的重要问题。随着微流控技术的兴起，由于在质量传递机制中扩散占主导地位所带来的挑战，微尺度下的混合引起了广泛关注。由于高效微混合器的设计需要定量验证，因此已发展出多种测量方法5-7然而，这种三维结构在高效的微混合器中十分常见5，需要对浓度场进行更精确的表征，而常规测量技术难以提供这种精度。由于观测视角受限8 或反应动力学6上述方法可能会产生误导性结果，无法准确反映混合物的均一性。
对于在光学透明微结构中混合的光学透明流体，微尺度纹影技术3,9-14为分析混合不均匀性提供了一种极具吸引力的替代方法。过去，微尺度纹影技术主要用于可视化可压缩流动9-13,15或相位梯度16。该技术不仅光学系统结构简单、灵敏度高，而且不仅能非侵入式地研究引起光学扰动的特定流动特征，也非常适用于混合效果的评估。本文中，我们通过在显微镜物镜的后焦平面插入刀刃构建微尺度纹影系统，描述了一种实现定量分析的校准方法，并在微流控振荡器4中报告了验证性测量结果。为实施测量，需合理选择工作流体，使混合后流体的折射率随组分呈线性变化，且待测微流控器件的厚度与校准时所用器件一致。除物种浓度外，微尺度纹影技术还可拓展用于测量其他与折射率呈线性相关的标量场梯度，例如温度或盐度。

<table><tbody><tr><td>永久性环氧负性光刻胶</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2150</td><td></td></tr><tr><td>单面抛光硅片</td><td>Light Technology</td><td>S4W1PP5SABUP1</td><td>p型，&lt;br /&gt;直径：100&amp;plusmn;0.5 mm，厚度：525&amp;plusmn;25 mm，晶向：(1 0 0)</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>kdScientific</td><td>kds210</td><td></td></tr><tr><td>注射器，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-10L2138</td><td></td></tr><tr><td>霍夫曼调制对比显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>5倍物镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>N PLAN</td><td>NA = 0.12</td></tr><tr><td>刀口</td><td></td><td></td><td>定制部件</td></tr><tr><td>相机，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; 高速</td><td>Integrated Design Tools</td><td>NX7-S1</td><td></td></tr><tr><td>C接口适配器 HC 0.63x</td><td>Leica Microsystems</td><td>541537</td><td></td></tr><tr><td>相机操作软件</td><td>Integrated Design Tools</td><td>MotionPro X Studio 2.02.01</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard-184 硅橡胶弹性体套件</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯管，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; 外径 × 内径 1/16 英寸 × 0.031 英寸</td><td>Supelco</td><td>58700-U</td><td></td></tr><tr><td>显微玻璃载片</td><td>Matsunami Glass</td><td>S2215</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Yeong-Shin</td><td>HP-303DN</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; HPLC级</td><td>Alps Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇，&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; 试剂级</td><td>Nihon Shiyaku Reagent</td><td>EA448652</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>Mathworks</td><td>MATLAB R2009a</td><td></td></tr><tr><td>计算流体动力学软件包</td><td>ESI group</td><td>CFD-ACE+ 2008</td><td></td></tr></tbody></table>

采用微尺度纹影技术分析微流控芯片中的混合不均匀性

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

本文介绍了利用微尺度纹影技术测量微流控器件中混合不均匀性的方法。该微尺度纹影系统由霍夫曼调制对比显微镜构建而成，通过移除狭缝板并将调制器替换为刀口边缘，可方便地接近物镜的后焦平面。微尺度纹影技术的工作原理基于检测由折射率变化引起 的光线偏转1-3。发生偏转的光线要么逸出刀口边缘，要么被其遮挡，分别形成亮带或暗带。如果混合物的折射率随其组分呈线性变化，则像平面上光强的局部变化与垂直于光轴方向的浓度梯度成正比。微纹影图像提供了由三维不均匀性所产生的扰动光线的二维投影。
为实现定量分析，我们描述了一种在T形微通道中混合两种流体的校准方法。通过数值模拟，获得了T形微通道中的浓度梯度，该梯度与相应的显微纹影图像高度相关。通过对比，建立了显微纹影图像的灰度读数与微流控器件中浓度梯度之间的关系。利用该关系，我们能够从相应的显微纹影图像分析混合不均匀性，并在微流控振荡器中验证显微纹影技术的测量能力4。对于光学透明流体，显微纹影技术是一种极具吸引力的诊断工具，可提供瞬时全场信息，保留混合过程的三维特征。

灰度比值 I/I0 在不同雷诺数下，质量分数的正负梯度情况如图所示（图2在T形微通道中间出现一条对称的条带。在低雷诺数下，由于在混合界面处发生弥散， schlieren 条带的尾部扩展并变得模糊。随着雷诺数的增加，扩散长度缩短，导致条带变窄。在不同的下游位置，强度的变化情况 ΔI/I0 沿横向方向的定量描述（图3）。校准过程的结果被表示为（图 4A 和 4B）之间的关系 I/I0 和 ∂w/∂y 呈线性关系，且与雷诺数无关。根据回归分析， I/I0 = -110∂w/∂y +1.03 ...

本文介绍了一种采用微尺度纹影技术测量微流控器件中混合不均匀性的方法。通过校准，可从微纹影图像中推导出浓度梯度的分布情况。

本文介绍了利用微尺度纹影技术测量微流控器件中混合不均匀性的方法。该微尺度纹影技术……

本实验的总体目标是利用微尺度谢林林技术（microscale sch larin technique）非侵入性地测量微流控装置中的浓度梯度。首先，通过霍夫曼调制对比显微镜构建微尺度谢林林系统。移除聚光镜的狭缝板，并用刀刃边缘替换物镜后焦面上的调制器。第二步是安装一个T型微通道并启动校准混合程序。对T型通道进行成像，以获得灰度微流控图像。接下来，将微流控图像与计算流体动力学模拟结果进行比较。为了确定灰度与浓度梯度之间的关系，最后的步骤是加载目标微流控装置。对混合过程进行微尺度谢林成像，并利用校准曲线将灰度值转换为浓度梯度。最终，微尺度谢林技术被用于实时定量显示微流控装置中的混合不均匀性。与现有的荧光成像或阴影法等技术相比，该方法的主要优势在于能够对浓度梯度进行非稳态的完整测量，从而揭示微流控装置中的三维非均一性。演示该实验步骤的将是实验室一位近期获得博士学位的博士。第一步是准备实验中将要使用的微流控装置。该微通道装置通过模塑聚二甲基硅氧烷制备而成。装置示意图显示了其进样通道和汇流通道。每个通道均连接至一个圆形区域，该区域将作为流体连接的位置。进行实验时，将微流控装置固定在玻璃载片上，并插入聚四氟乙烯管。为建立流体连接，请先将装置放置一旁。在准备实验的同时，使用霍夫曼调制对比显微镜构建微尺度 schlein 系统。准备一个刀口，以便将其放入光路中。该刀口为此系统定制，表面经黑化处理以降低反射率。将刀口置于手边，并开始调整显微镜的脉冲光。移除聚光镜焦平面前方的狭缝板。接着，从五倍物镜的后焦平面处移除调制器。取刀口边缘，将其插入调制器位置。为采集视频，将高速相机安装在显微镜的三目镜筒上，并连接至计算机。打开光源，开始向计算机传输灰度视频。随后，采集并处理图像。从视频流中采集一幅图像，并使用图像处理软件获取其灰度值。返回显微镜，通过计算机移除刀口边缘。在调节照明和光圈的同时，监测平均灰度读数。当图像的平均灰度读数比最大值低约10%时停止。此值即为0%截止时的背景强度。现在插入刀口以完全阻挡入射光。在计算机上记录图像的平均灰度读数。此值为100%截断的背景强度。接下来，在监测所捕获图像的平均灰度读数的同时，逐步调整刀口边缘的位置。当图像的平均灰度读数处于0%与100%值的中间位置时，停止调整，此时切割程度即设定为50%。现在返回显微镜处，安装T型微通道装置。将其放置在载物台上，使汇流通道与刀口边缘平行。设备就位后大致调整焦距。为实验准备修复用液体。选择两种透明液体，其折射率完全不会相互干扰。本实验以水作为参考流体，以乙醇水溶液作为另一种流体，测量折射率随浓度变化的s+值。选择乙醇水溶液的质量分数，使其处于线性范围内。本实验采用质量分数为0.05的乙醇水溶液进行流体配制。使用两个相同的注射器，一个装入水，另一个装入稀释的乙醇水溶液，并将注射器连接至T型微通道。用聚四氟乙烯（Teflon）管将T型微通道的两个入口分别与一个注射器相连。准备两台注射泵，用于向微通道入口输送液体。用参考流体的注射器装填一台泵。用稀释乙醇的注射器装填另一台泵，但将出流管末端放入容器中，并固定在容器壁上。通过设定注射泵的流速开始校准，以获得雷诺数。启动注射泵，以相同的体积流量同时输送工作流体。使用相机仔细观察微通道，调节焦距并等待直至流动达到稳定状态，以观察到静止的液-液界面（SL）和稳定图案作为标志。以每秒30帧的帧率记录20帧流体混合图像。这些帧即为获取的图像。完成后，准备泵以获取另一组帧。停止稀释乙醇的注射泵，继续通过一个入口泵入水。观察流动情况，等待直至流动稳定，无液滴和不规则模式出现。以每秒30帧的速度记录20帧图像。这些图像帧作为参考图像。接下来，针对每个感兴趣的雷诺数，依次采集乙醇和水的图像，然后仅采集水的图像。当所有数据采集完成后，转向计算机进行后续的校准工作。使用图像处理软件，将每个雷诺数误差下获取的图像除以参考图像。当水合乙醇从图像顶部通道进入时，获取的样本图像与参考图像相除，可得到沿流动方向给定距离处的灰度比数据。在垂直于流动的方向上选择若干点，并提取每个点处的灰度比值。沿流动方向选择多个点进行测量，并绘制数据以进行比较。对实验进行计算流体动力学模拟，利用该模拟计算质量分数相对于横流方向导数的导数。接下来，利用灰度比与导数之间的预期线性关系，通过线性回归进行分析。校准后，使用微Schlein技术研究目标装置以确定回归直线。首先，将T型微通道装置从样品台断开并取下。更换为深度大致相同的靶向微流控装置。将该装置连接至水和乙醇水溶液，并在计算机上以相等的体积流速记录输入的水和稀乙醇，同时用摄像头进行录制。等待流体流动稳定后，采集图像并记录20帧。接下来，停止向微流控装置输入乙醇水溶液的注射泵，仅输入水。返回计算机以获取参考图像。在较低雷诺数下，正负质量分数梯度在T形微通道中间位置出现一条带状区域，其不同雷诺数下的灰度比可被观察到。由于在混合界面处的分散作用，Schlein 带的尾部被展宽并变得模糊。随着雷诺数的增加，扩散长度缩短，导致带变窄。在本视频中，利用灰度比与质量分数导数之间的线性关系，捕捉到了雷诺数为 250 时微流体振荡器中流动的振荡特性。观看本视频后，您应能充分理解如何在微流控装置中采用微尺度分层技术来定量分析浓度梯度。

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