用于精确小体积样品处理的微流控平台及其在声学微装置中按尺寸分离生物颗粒的应用

本实验的总体目标是利用微流控光控装置实现小体积颗粒的自动化分离。该方法可推动生物医学工程领域中的关键操作，包括为生物检测和临床研究应用提供高效可靠的样品处理与分离。该技术的主要优势在于其模块化、精确性、稳定性和自动化特性，不仅适用于网状结构分离，还可灵活适配多种流通式微流控分离装置。

我们首先意识到，需要具备一种能力，能够常规且可靠地对亚毫米级生物样品体积进行分离，同时避免分析物的显著稀释或损失。将样品计量、从源头到收集管路的自动分流与标准的注射泵操作集成在一起，对于在此尺度下成功开展实验至关重要。请开始设计声学网状装置以及随附文本方案第一部分中所述的两幅光刻掩模的布局。

然后将背面流体端口图形化至双面抛光的1 0 0硅片上。采用标准正性光刻胶光刻技术，通过深反应离子刻蚀将该结构刻蚀至350至400微米深度。接着，将硅片翻转，对正面流体通道结构进行图形化。

再次采用标准的正性光刻胶光刻技术，然后将已图形化的晶圆贴合到另一块未加工的硅载体晶圆上。利用光刻胶，对暴露的通道进行刻蚀，深度达200微米。通过深反应离子刻蚀后，将器件晶圆浸泡在光刻胶剥离液中，以使其从空白硅晶圆上脱离。

接下来，使用食人鱼溶液清洗器件晶圆和一片无特征的厚度为0.5毫米的硼硅酸盐玻璃晶圆。清洗干净后，通过离子键合将玻璃与硅晶圆在所示条件下密封，形成流体通道。最后，使用划片机上的金刚石刀片，结合双组分低黏度环氧树脂套件，将各个芯片切割分离。

称量推荐比例的两种组分并充分混合。然后将锆钛酸铅或PCT压电陶瓷置于合适的夹具中，用移液枪吸取约10微升环氧混合物，均匀涂布于其表面，形成一层薄而均匀的涂层。接着，将芯片放入夹具中，使压电陶瓷的涂胶面与微流控芯片对齐。

在对齐时，可能需要用胶带将芯片固定到位以保持其位置。将组件夹在台钳中，注意不要损坏任何部件，并按照环氧树脂制造商推荐的温度和时间进行固化。环氧树脂固化后，使用细头烙铁将细径导线焊接到压电陶瓷的每一侧。

如有必要，使用适当的助焊剂处理压电表面。操作时应尽量减少与压电材料的接触时间，以避免其受热去极化。使用夹具将芯片固定至流体实验平台。

此外，在面包板上安装一个散热风扇，以在声学实验期间调节温度。接着，将芯片与外部连接器拧紧固定。将面包板安装到显微镜载物台上，并将外部连接器与入口和出口处的额外管路连接。

使用标准的1/4英寸28牙螺纹接头。对于1/16英寸管路，将微流控芯片连接至注射泵、计算机控制的多通道选择阀、与计算机连接的流量计以及管路，具体连接方式如图所示，并参见随附文本方案中的图四。在运行分离之前，填充清洗试剂储液器，并对相应的流体管路进行预灌注。

同时将芯片出口处的第三和第四阀门设置为初始流向废液储液池。接下来，打开冷却风扇。将压电陶瓷的引线连接至功率放大器，并将函数发生器设置为所用声学芯片的共振频率。

根据所需的分离效果，调节函数发生器上的电压设定点，使射频放大器输出的峰峰值电压在12至25伏之间。然后将相应的收集管和缓冲液输入管连接到系统。使用适合待分离细胞或颗粒的样品缓冲液，或根据分离后所用分析检测方法的要求选择合适的缓冲液。

接下来，加载控制软件，并使用该软件控制阀门、流量传感器和泵，以执行全自动的润洗与分离程序。在开始分离程序之前，立即将样品管短暂涡旋振荡，以重新悬浮可能已沉降的颗粒。或者，对于因涡旋处理更易受损或发生聚集的生物样品，可通过移液器上下吹打10次进行混匀。

然后立即将样品瓶连接到进样管路，并立即启动灌注和分离程序。首先使用软件对阀一和阀二的进气口进行灌注，以确保管路内无液体残留。同时，对连接缓冲液进样瓶与阀二以及样品进样瓶与阀一的管路进行灌注。

让注射泵从两个小瓶中各吸取约15微升液体，以完全充满连接至阀门的管路。最后，将阀门一和阀门二切换至废液端，以排出进入加样环中的任何过量液体或空气。接下来，设置程序以加载样品环：首先以每分钟50微升的速度吸取25微升空气。

然后以每分钟 200 微升的速度加载 250 微升样品，接着以每分钟 200 微升的速度加入 35 微升前导缓冲液，最后以每分钟 50 微升的速度再加入 25 微升空气。随后将注射泵设置为以每分钟 100 微升的速度注入已加载的流体段塞，并使用流量传感器监测小颗粒和大颗粒出口处的流速。合适的流速比可按照随附文本方案中所述方法确定。

当流量传感器检测到流速突然升高，表明第一个气隙通过时，将相应的输出阀从废液瓶切换至样品收集瓶。在样品流经芯片并被分离的过程中，通过观察流量传感器读数，确保流速稳定。当样品流过芯片时，分离后的组分在出口阀处被分别收集。

在样品塞末端，观察流速传感器，检测第二个气隙。此时，将输出阀切换回废液端。待全部体积完全排出后，停止注射泵输注，并终止自动化程序。

分离实验完成后，取下小颗粒和大颗粒样品收集管，并将其妥善保存以备后续分析。将样品吸管固定在空管中，用于收集即将流经管路的过量清洗液。随后，按照随附文本方案中所述步骤启动自动系统清洗程序。

在此过程中，程序将控制阀门和注射泵，依次向持留线圈中加载清洗试剂，并将其冲洗通过系统。自动化清洗和去污过程完成后，应按照处理生物或化学废弃物的适当规程，弃去多余的冲洗液以及收集这些液体的样品瓶。此处展示的是一个耦合良好的压电元件与微流控装置的代表性频率扫描结果。

当压电元件与微流控装置耦合良好时，颗粒会在共振频率下紧密聚焦，从而在荧光强度上形成明显的峰值，并迁移至预期的聚焦位置。相反，若耦合效果较差，颗粒则无法有效聚焦，该装置在需要高质量聚焦或快速流体的应用中将不适用。该图中的每条曲线代表使用不同尺寸的聚苯乙烯颗粒和不同的压电驱动电压所获得的分离结果。

通常，提取较小颗粒需要更高的电压。然而，由于散热增加以及声流效应逐渐增强，干燥电压不能无限提高。为了验证该平台在生物颗粒分离中的实用性，将平均直径为8至10微米的人类Raji细胞与直径约为50纳米的登革热病毒混合，然后利用声学微流控装置进行分离。

一旦组装并编程完成此类系统，即可在约五分钟内常规完成分离操作。每小时可处理约三个样本，并在样本之间进行彻底的清洗和去污。按照此步骤操作后，可进一步开展其他方法，如细胞计数、蛋白质印迹（western blotting）或高通量测序，以确认分离的纯度并阐明其生物学意义。

观看本视频后，您应能充分理解如何制备一种典型的微流控分离装置。利用芯片与外部系统的连接，与硬件设备对接，并以精确且可靠的方式运行自动化的分离程序。请务必注意，操作具有感染性的材料可能极为危险，必须由经过适当培训的人员使用机构规定的适当设备和生物安全操作规程来进行。