微流体平台精密小批量来样加工及它的使用尺寸分离生物颗粒的声微型

该程序的总体目标是使用微流体光装置进行自动小体积颗粒分离。该方法可实现生物医学工程领域的关键程序，包括用于生物检测和临床研究应用的样品的稳健处理和分离。该技术的主要优点是模块化、精度、稳健性和自动化，使其不仅适用于网状分离，而且适用于通过微流体分离装置的各种流动。

我们首先认识到，需要这种能力，以便对亚毫米级生物样品体积进行常规、可靠的分离，而不会显著稀释或损失分析物。样品计量和从源到采集文件的自动路由与标准注射泵作的集成对于在这种规模下成功工作至关重要。首先，设计声学 retic 装置和两个照片掩码的布局，如随附文本协议的第一部分所述。

然后将背面流体端口图案化到双面抛光的 1 0 0 硅晶片上。使用标准的正性光刻胶光刻技术，使用深反应离子蚀刻将此几何形状蚀刻至 350 至 400 微米的深度。接下来，将晶片翻转过来，对正面流体通道几何结构进行建模。

同样，使用标准的正性光刻胶光刻技术，然后将图案化晶圆安装到第二个空白硅载体晶圆上。现在使用光刻胶将曝光的通道蚀刻至 200 微米的深度。使用深反应离子蚀刻，然后将器件晶圆浸泡在光刻胶剥离溶液中，以将其从空白硅片上去除。

接下来，使用 Piranha 溶液清洁器件晶圆和无特征的 0.5 毫米厚的硼硅酸盐玻璃晶圆。清洁后，使用此处所示的条件密封流体通道，以离子方式粘合玻璃和硅晶片。最后，用切割机上的金刚石刀片从双组分低粘度环氧树脂套件中切开单个芯片。

称出两种成分的推荐比例并充分混合。然后将铅 Zirkin 八钛酸盐或 PCT 压电陶瓷放入合适的夹具中，并使用移液管将大约 10 微升的环氧树脂混合物均匀地涂抹在其上，以形成一层薄而均匀的层。接下来，将芯片放入夹具中，并将压电陶瓷的环氧树脂侧与微流体芯片对齐。

可能需要用胶带将芯片固定下来，以便在对齐时将其固定到位。将组件夹在虎钳中，注意不要使任何组件开裂，并按照环氧树脂制造商推荐的温度和持续时间进行固化。环氧树脂固化后，使用细尖烙铁将细规格的导线连接到压电陶瓷的每一侧。

如有必要，使用适当的助焊剂准备压电表面。注意与压电陶瓷进行尽可能短暂的接触，以避免对其进行热去极化。使用夹紧装置将芯片连接到流体试验板上。

此外，在试验板上安装一个冷却风扇，以在声学实验期间调节温度。接下来，拧入 chip to world 连接器。将试验板安装到显微镜载物台上，并将世界连接到入口和出口处的附加管道上。

使用标准的四分之一 28 螺纹接头。对于一根 16 英寸的管道，将微流体芯片连接到注射泵、计算机控制的多端口选择阀、PC 接口流量计和管道，如图所示，如随附文本协议的图 4 所述。在运行分离之前，填充清洁试剂储液槽并灌注相应的流体管路。

此外，在切屑出口处设置阀门 3 和 4，以最初流向废物储液罐。接下来，打开冷却风扇。将压电陶瓷引线连接到功率放大器，并将函数发生器设置为正在使用的声学芯片的谐振频率。

调整函数发生器上的电压设定点，使射频放大器输出 12 到 25 伏特峰峰值，以适应所需的分离。然后将相应的收集瓶和缓冲液起始样品瓶连接到系统。使用适用于待分离细胞或颗粒的样品缓冲液，或根据分离后分析分析的要求使用。

接下来，加载控制软件并使用它来控制阀门、流量传感器和泵，以执行全自动灌注和分离程序。在开始分离程序之前，立即短暂涡旋样品瓶以重悬可能已沉淀的任何颗粒。或者，将样品上下移液 10 次，以混合更容易因涡旋而受损或结块的生物样品。

然后将样品瓶连接到输入管路，并立即启动灌注和分离程序。首先使用软件灌注阀门 1 和 2 的进气口，以确保管道中不含液体。同时灌注将缓冲液进样瓶连接到阀 2 的管路，以及将样品进样瓶连接到阀 1 的管路。

让注射泵从两个样品瓶中取出大约 15 μL 的液体，以完全填充管道，将它们连接到阀门。最后，将阀门 1 和 2 切换到废物，以排出进入装载线圈的任何多余液体或空气。接下来，设置程序以加载样品线圈，首先以每分钟 50 微升的速度抽出 25 微升空气。

然后以每分钟 200 微升的速度加载 250 微升样品，然后以每分钟 200 微升的速度加载 35 微升前导缓冲液，最后以每分钟 50 微升的速度再加载 25 微升空气。然后设置注射泵以每分钟 100 微升的速度注入加载的流体塞，并使用流量传感器监测小颗粒和大颗粒出口处的流速。可以按照随附的文本协议中的说明确定适当的流速比。

当流量传感器检测到流速峰值表明第一个气隙通过时，将相应的输出阀从废液瓶切换到样品收集瓶。确保样品通过芯片时流量稳定，并通过观察流量传感器读数进行分离。当样品通过芯片时，分离的馏分被收集在出口阀处。

在样品塞的末端，观察流量传感器，检测第二个气隙。此时，将输出阀切换回废液。分配满体积后，停止注射泵输注并终止自动化程序。

分离实验完成后，断开小颗粒和大颗粒样品收集瓶的连接，并妥善存放以备后续分析之用。将样品拾取管固定在空样品瓶中，以收集多余的清洁溶液，这些溶液将通过试管冲洗。然后按照随附的文本协议中的说明启动自动系统清洁程序。

在此过程中，程序将控制阀门和注射泵按顺序向保持线圈加载清洗剂，并通过系统冲洗它们。自动清洁和去污过程完成后，按照适当的程序处理生物或化学废物，丢弃多余的冲洗溶液和收集它们的样品瓶。这里显示的是来自良好耦合的压电和微流体器件的代表性频率扫描。

当压电和微流体器件之间的耦合良好时，粒子在共振频率上紧密聚焦，导致荧光强度出现明显的峰值并迁移到预期的聚焦位置。相比之下，在耦合不良的地方，当高质量聚焦或快速流速对于所需应用至关重要时，颗粒将无法很好地聚焦，并且该器件不适用。该图上的每一条线代表使用各种聚苯乙烯粒径和压电驱动电压的分离结果。

通常，需要更高的电压来提取较小的颗粒。然而，干电压不能无限增加，因为散热更大，声流的影响越来越大。为了证明该平台在生物颗粒分离中的实用性，在平均直径为 8 至 10 微米的人 raji 细胞中加入直径约为 50 纳米的登革热病毒，然后使用声波微流控设备进行分离。

一旦组装和编程了这样的系统，就可以在大约 5 分钟内完成常规分离。每小时可处理约 3 个样品，样品之间进行彻底清洁和去污。在此程序之后，可以执行其他方法，例如细胞计数、蛋白质印迹或下一代测序，以确认分离的纯度并阐明生物学意义。

看完这个视频，你应该对如何制造一个典型的微流体分离装置有了很好的了解。使用芯片连接与硬件连接，并以精确和稳健的方式运行自动分离程序。不要忘记，使用传染性材料可能非常危险，只能由经过适当培训的人员使用适当的机构规定的生物安全设备和程序进行。