窗口上的一个微观世界:简单的微流体系统为研究多孔介质中的微生物运输

我们证明，通过使用生态芯片设备，物理结构和压力头可以保持不变或变化。虽然通过使用表达 VIO 细菌菌株的非致病性绿色荧光蛋白的运输实验系统地研究了表面化学流体特性或颗粒或微生物特性的影响，但我们阐明了栖息地结构、流动条件和接种物大小对基本运输现象的重要性。微流体软件对隐藏世界的引人注目的视图。

嗨，我们来自范德比尔特大学范德比尔特综合生物系统恢复教育研究所的 Dimitri Marker。我是 David Schafer，Viro Laboratories 的一名研发工程师。大家好，我是来自康涅狄格大学环境科学与工程中心化学材料和生物分子工程系的 Leslie Sho，我是来自 Zebra 的 Dicot。

今天，我们将向您展示一种为基础环境科学和工程研究创建模块化微流体栖息地阵列的程序。我们在实验室中使用该程序来研究微米级结构对森林介质中微生物运输相互作用的影响。那么让我们开始吧。

创建微流体设备的第一步是在计算机辅助绘图或 CAD 程序中绘制设备的二维布局。我们使用了 AutoCAD，但也可以使用其他绘图程序，例如 clue in 或 coral draw。该软件使设计人员能够在整个宏观视野中忠实地复制物理结构，同时以小于 5 微米的分辨率定义单个特征。

从 CAD 图纸中，创建一个摄影蒙版。我们使用马萨诸塞州北端 Advanced Reproductions Corporation 制造的铬面罩。微流体器件生产的接下来几个步骤在洁净室中进行，以创建母版。

干净的硅晶片在旋转编码器中涂有光刻胶。首先，将晶圆连接到旋转编码器平台上，并将几克 SU 8 20 25 光刻胶倒入晶圆中心。然后，晶圆以 500 RPM 的速度旋转 15 秒的初始展布周期，然后是 4， 000 RPM 的薄涂层周期，持续 35 秒。

旋转后，将晶圆放在 95 摄氏度的热板上 10 分钟，以挥发多余的溶剂。制备晶圆的最后一步是去除边珠。这是通过将晶圆返回到旋转编码器并将稳定的 SUA 边缘速度去除器流应用于涂层晶圆的外边缘来完成的。

下一步是通过选择性地暴露在紫外线下来对光刻胶进行图案化。首先，将涂布的晶圆放在平坦的表面上，然后将镀铬掩模直接放在上面。红宝石色遮蔽膜可阻止图案转移到所需区域之外。

接下来，使用光斑携带系统通过掩模将每平方厘米 300 毫 JUUL 剂量的紫外线输送到涂层晶圆上。最后，将晶圆在 95 摄氏度下烘烤 15 分钟，以交联光刻胶的曝光区域，使其不溶。创建母版的最后一步是去除光刻胶的非交联区域，留下凸起的浮雕结构。

首先，晶圆再次返回给 spin 编码器，并被开发人员解决方案覆盖。显影剂在涂布的晶圆上放置大约 5 分钟，然后被甩开，从而在晶圆上产生清晰明显的图案。通过将异丙醇喷到旋转晶片上来洗去任何残留物。

我们在此步骤中使用 2200 RPM 的旋转速度大约 5 到 10 秒。最后，使用氮气流对成品母料进行干燥，并储存在培养皿中，直到需要铸造设备为止。我们使用有机硅弹性体聚甲基丙烷制造微流体器件。

首先，基材和固化剂以 10 比 1 的重量比输送到塑料杯中。接下来，将混合物混合。Andy 使用 thinky AR 100 调理混合器进行泡泡。

循环完成后，将液体 PDMS 均匀地倒在母版上。然后将包含母模和未固化 PDMS 的培养皿放入真空室中进行脱气。聚合物气泡几乎立即出现。

脱气会继续进行，直到所有气泡都消失。将培养皿放入 65 摄氏度的水平烤箱中至少 4 小时，以充分使聚合物交联。然后小心地将固化的 PDMS 从可重复使用的主站中取出。

使用手术刀将前四个边缘切在图案区域之外，然后用镊子将设备从图案化的晶圆上剥离。如果需要，可以使用剪刀修剪设备的边缘。该器件的一个子部分可以与模制 PDMS 器件的其余部分分开。

接下来，在 PDMS 上打孔。我们使用市售的几种不同尺寸的活检打孔器安装在一个小心轴上。使用镊子去除压力机 PDMS 芯。

最后，使用异丙醇和泡沫尖端聚丙烯棉签清洁修整和打孔的设备。使用氮气干燥设备，然后将其放入烘箱中以去除所有溶剂痕迹。制造微流控器件的最后一步是将 PDMS 粘合到载玻片基板上，然后首先填充液体。

PDMS 设备和载玻片以粘合表面的间距放入等离子清洗器中。在本实验中，我们使用 PDC 32 G herrick 等离子清洗机。一旦建立真空并且可以看到蓝紫色等离子体，就会设置一个 30 秒的计时器。

等离子发生器已关闭。将腔室重新加压，将装置和滑块从腔室中取出，并与粘接表面接触。在从腔室中取出激活的成分时，重要的是要快速移动，以便表面保持激活状态。

轻柔的压力有助于确保良好的粘合。通过用镊子拉动角来检查粘合的质量。然后，亲水内部可以很容易地填充水溶液，如缓冲介质或去离子溶液。

将水液注入每个源井中，并通过相应的微孔流通池。一旦所有腔室都装满，就会在整个装置上放置一层薄薄的固化 PDMS，以帮助延缓蒸发并保持无菌。要校准装置中的压力驱动流速，请在微结构流通池中预装去离子水，在装置顶部放置一个流动模块，该模块充当流体输送接口和无菌密封。

该流量模块可以单独使用，也可以连接到含有液体的外部储液罐，例如塑料注射器。将含液体储液罐（如塑料注射器或流量模块）连接到上游入口。将储液罐中流体的高度保持在下游高度以上。

嗯，上游储层和每个下游出口井之间的高度差定义了压力驱动流的驱动力，以量化通过设备的流速。钝端 25 号针头用于定期从下游孔中收集样品。例如，我们每 15 到 20 分钟采集一次样本，仔细记录样本之间的实际运行时间。

分析天平上记录进样前后注射器的重量。将聚集体积与聚集时间的关系图表示为斜率等于平均质量流速。入口储液罐与出口孔的横截面较大，有助于防止流体通过设备时流速发生显著变化，在 Y 轴上绘制采样体积与 x 轴上采样时间的关系。

在一个简单的绘图程序（如 Excel）中，为了获得线的斜率，斜率用于平均体积流速。使用具有羧基、YG 和普通 YG 表面的三个微摩尔荧光乳胶珠的稀溶液来可视化流动并研究表面相互作用。首先，在去离子水中制备浓度为 0.01% 固体的珠子溶液。

将溶液添加到上游井中，并将流量模块重新连接到 zu。在一小时内观察流珠流，并在配备 MITx BCEB 0 1 3 U 单色相机的蔡司 AIOt 25 荧光显微镜上大约每 10 分钟记录一次。快速连续捕获单个帧，并使用具有荧光照明和透射光照明的 Image J 等软件程序组装成电影。

珠子和结构都是可见的。当透射光被阻挡时，只有明亮的荧光珠可见。沿底面沉积或附着在收集器上的固定珠子在整个装置中很明显。

对于使用活细菌的实验，制备了一种非致病性绿色荧光蛋白表达细菌的培养物，例如弧菌属。首先，从深度自由储存中取出原种培养物。在装有无菌 LB 生长培养基的培养瓶中接种原液培养物。

使用一次性接种环，将培养瓶在振荡下孵育过夜，得到浓度约为 10 至 9 个细胞/毫升的固定相培养物。根据应用的不同，可以更精确地量化细菌的初始浓度。制备充满无菌缓冲液的微流体装置。

然后清空上游孔中的无菌液体，并用 20 微升细菌培养物代替。使用移液器，用注射器轻轻抽吸将细菌接种到装置中 孵育后，可以通过量化定植后每个孔的荧光强度来确定孔中细菌的数量。像以前一样清空上游入口井，并用千分之 25 的盐冲洗缓冲液代替。

用注射器对上游井施加人工海水温和压力，用 20 至 40 μL 缓冲溶液冲洗单个流通池。这大约是初始冲洗后流通池微流体土壤部分不良体积的 100 到 200 倍。如前所述，通过使用 Flow 模块，可以实现细菌通过多孔介质的长期灌注。

可以测量细菌生长和运输随时间变化的荧光和白光图像。在本实验中，使用 Q 成像墨水的五色冷却 CCD 相机每 15 到 20 小时拍摄一次图像，持续 7 天。我们的设备还可用于研究物理栖息地结构对为细菌提供避难所以躲避原生动物捕食的影响。明显。

这是微孔流动池中的细菌，在设备中可以看到更大的纤毛原生动物 eulo 啃咬细菌。在分析微流体装置中的流体流动时，我们发现 40 毫米压力头的平均流速为 0.71 微升/分钟。通过将压力扬程增加到 60 毫米，流速成比例地增加到每分钟 1.04 微升。

当在设备中使用具有不同表面化学性质的微珠时，我们观察到未羧化的微珠在设备表面积累更多。而直径为 6 到 10 毫米的珠子更有可能夹带在较小的孔隙中。由更大的静水压力引起的更快流速导致珠子滞留和夹带减少，正如分析 eco chipp 微流体装置中的细菌生长所预期的那样。

我们注意到设备不同扇区图像强度的定性差异。荧光强度可以作为通道中微生物生物量的代表进行量化。在正在进行的实验中，我们观察到低流量条件的连续剪切力似乎会导致细菌聚集和羊群形成，如这些图像中所示，我们刚刚向您展示了如何创建和使用简单的微流体设备来测量颗粒规模、通过多孔介质的碰撞传输或研究微结构栖息地中的微生物相互作用。

使用流通池进行研究时，重要的是要考虑磁珠的浮力以及胶体和收集剂的表面化学性质。当缩小到微流体状态时，表面效应可以在观察到的现象中占主导地位。实际上，任何物理结构都可以纳入微流体流通池设计中。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。