Name: 窗口上的一个微观世界:简单的微流体系统为研究多孔介质中的微生物运输 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-03T16:11:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: 了解微流控芯片技术如何模拟多孔介质环境，实时观察细菌生长与运输过程。该方法使用绿色荧光蛋白标记的非致病性VIO菌株，帮助研究者系统分析表面化学、流体特性及栖息地结构对微生物运输动态的影响。

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本研究由美国国家科学基金会资助（项目编号 #0649883）、范德堡大学整合生物系统研究与教育研究所（VIIBRE）以及塞尔系统生物学与生物工程本科生研究项目（Searle SyBBURE）资助。

一、微流控装置的制备
 <ol>
 <li>创建微流控装置的第一步是在计算机辅助设计（CAD）软件中绘制装置的二维布局。我们曾使用 AutoCAD，但也可使用其他绘图软件，例如 CleWin 或 CorelDraw。</li>
 <li>下一步是制作光刻掩模。根据装置的尺寸、所需分辨率和预算，这些掩模可采用铬膜制作（分辨率最高，成本较高），也可在照相底片上生成，甚至可通过高分辨率打印机直接打印在透明投影胶片上。本实验中，我们使用了由马萨诸塞州北安多弗市 Advance Reproductions Corp. 制造的 Cr 掩模。</li>
 <li>下一步是将掩模上的图案转移到光敏环氧树脂上，以形成具有凸起浮雕结构的模具。
 <ol>
 <li>首先，将负性 SU8 光刻胶以期望的厚度旋涂在硅晶圆表面，并进行烘焙以挥发多余的溶剂。光刻胶的配方和旋转速度决定了成膜厚度。</li>
 <li>随后，通过掩模将图案暴露于预设剂量的紫外光下。曝光后烘焙可使光刻胶涂层中受光照区域发生交联，从而变得不溶于显影液。</li>
 <li>接下来是显影步骤，使用化学显影液去除未曝光的光刻胶，留下一个正向凸起浮雕结构，称为“母模”（master）。</li>
 <li>可选地进行第三次烘焙，即“硬烤”，以进一步固化结构。</li>
 </ol></li>
 <li>PDMS 模塑
 <ol>
 <li>我们采用硅基弹性体聚二甲基硅氧烷（poly(dimethyl siloxane)）进行微流控装置的复制模塑1。首先，将基础材料与固化剂按 10:1 的质量比混合，倒入浅容器（如培养皿）中的模具上，并在真空下脱气，直至所有可见气泡消失。</li>
 <li>然后将含有未固化 PDMS 的母模置于已精确调平的烘箱中，在 65°C 下至少加热 4 小时，以实现聚合物的交联。</li>
 <li>PDMS 固化后，将成型部分从培养皿中切割下来，并在装置顶部打孔，以便在最终装置中通入微流道。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>与玻璃的键合
 <ol>
 <li>通过氧等离子体处理，可将洁净的 PDMS 与洁净的玻璃进行不可逆键合。首先，将已成型并打孔的 PDMS 和洁净的玻璃载片分别放置于等离子清洗仪中，键合面朝上。我们使用的是 PDC-32G Harrick 等离子清洗仪。</li>
 <li>关闭腔室后，操作者启动真空泵，然后开启射频（rf）源。等离子体将在腔室内自燃，表现为腔内出现微弱的紫色辉光。</li>
 <li>经过 30 秒的等离子体处理后，关闭射频源，随后关闭真空泵。</li>
 <li>迅速将玻璃载片和 PDMS 装置从腔室中取出，并使其直接接触（将成型的 PDMS 面朝下贴合）。这将形成不可逆的键合，同时使表面性质变为亲水性。</li>
 <li>如有需要，可通过表面吸附或共价键合固定蛋白质等方式，在 PDMS 上实现不同的表面化学性质。</li>
 <li>随后，可通过毛细作用力或使用注射器施加轻微压力，使去离子水、培养基或人工地下水等流体填充装置。</li>
 </ol>
</li>
 </ol>
II. 基于重量分析法的微流控装置流量定量
 <ol>
 <li>为校准装置中的压力驱动流，首先将微结构化流动池预充满去离子水。</li>
 <li>将装有液体的储液装置（例如塑料注射器或流动模块，如图1所示）连接至上游入口井，并保持储液装置中的液面高度高于下游井的位置。</li>
 <li>在废液井处定期收集样品，并用分析天平称重。</li>
 <li>绘制总体积与总时间关系曲线的斜率，即可得到平均体积流量（如图2所示）。我们发现，在广泛的压头范围以及不同的压力维持系统下，平均流速均具有良好的可重复性和线性。</li>
 </ol>
III. 流动可视化、速度映射及亲水/疏水相互作用
 <ol>
 <li>用于模型校准的 3 μm 荧光乳胶微球（包括 Carboxy YG 和 Plain YG 表面）购自 Polysciences, Inc.，并用去离子水稀释至 0.01% 固含量。</li>
 <li>通过配备 Mightex BCE-B013-U 单色相机的蔡司 Axiovert 25 荧光显微镜观察微球在生境中的流动情况。</li>
 <li>以 ImageJ 软件包连续快速采集单帧图像，并将其合成为视频（图 3）。</li>
</ol>
IV. 用于模拟细菌生长与运输的微流控装置（EcoChip）
<ol>
 <li>Vibrio sp. GFP Kan，一种非致病性、表达绿色荧光蛋白的微生物，在LB（Luria-Bertani）培养基中培养约14小时，浓度达到约109 个细胞/ml。</li>
 <li>将生长培养基中的细菌接种至EcoChip装置中，使其在装置内定植，并在19小时内过夜形成菌落聚集体和生物膜。</li>
 <li>随后从孔中移除生长培养基，并用人工海水冲洗所有生境（ASW配方详见Wang等人的研究2），使不同生境中保留不同密度的细菌。</li>
 <li>其中一个生境保持密封、无流动状态，其余三个生境则维持缓慢流动条件。</li>
 <li>在数天时间内，每隔15至20小时拍摄一次细菌生长的荧光与白光图像（图4）。</li>
</ol>
V. 代表性结果
流控模块为调节和分配多个生境中的流体流动提供了简单的方法。重量分析法被证明是一种简便直接的方法，可用于确定流经生境结构的流速，该流速取决于生境的水力阻力以及进出口孔之间的压力差。在微珠流动实验中，我们观察到未羧基化的微珠在装置表面的聚集程度明显更高（图2）。此外，直径较大的微珠（6 mm和10 mm）更容易被截留在较小的孔隙开口中，并开始在装置内积聚。较高的流速可减少颗粒的滞留和截留。
在细菌生长实验中，流动条件的影响十分明显。持续的剪切力导致细菌聚集在一起形成絮状物，而不会以单个细胞的形式存在。大型细菌絮状物的迁移是一个重要的环境过程，但在宏观系统中极难研究。
<img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig1.jpg" alt="用于结构化微环境流动和样品储液系统的PDMS微流控装置示意图。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1"> 图1. 流动模块的结构特征与工作原理示意图。
<img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig2.jpg" alt="线性关系比较图：y=1.0397x-0.0587，y=0.7092x+1.3279，时间与高度数据。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图2"> 图2. 通过不同柱高度的重量分析法测定结构化生境中的流速。柱高度比：60 / 40 = 1.5，测得流速比：1.04 / 0.71 = 1.46。当 H = 40 mm 时，所得流速为 V = 0.71 μL/min；当 H = 60 mm 时，V = 1.04 μL/min。对应的估算平均线性流速分别为 3.1 mm/s 和 4.6 mm/s。
<img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig3.jpg" alt="羧化与非羧化乳胶微球分布；光学显微镜；延时比较；3 μm 微球。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 3"> 图 3. 3 μm 乳胶微球在流经结构化生境时，有羧化与无羧化条件下的运输情况。
<img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig4.jpg" alt="不同流动环境中随时间变化的细胞分布分析；0小时、115小时、212小时的显微镜图像。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图4"> 图4. 在缓慢流动条件下，细菌生长和生物膜形成随接种密度变化的情况。

<ol><li>Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+protozoa+through+narrow+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mobility of protozoa through narrow channels.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).</li>
</ol>

EcoChip 系统可根据具体实验需求进行调整。新的母模相对容易制备，一旦母模制作完成，便可按需浇铸出多个完全相同的复制品。流动模块操作简便，无需特殊设备或复杂的连接装置，可被建模为一个简单的落差压力驱动流动系统。本研究的进一步拓展工作正在进行中，包括构建腐殖酸包覆的微通道，以及系统性地改变流体的水相化学性质。通过该方法，可直接观察并系统研究细菌与表面的微观相互作用，以及多孔介质中的微生物生长与迁移现象。

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>道康宁公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-2025</td><td>MicroChem 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Polysciences 公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

微观世界的窗口：用于研究多孔介质中微生物迁移的简单微流控系统

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

微生物在多孔介质中的生长与迁移对地下水和地表水质量、环境中营养物质的循环，以及病原体向饮用水系统的传播具有重要意义。天然多孔介质具有复杂的物理拓扑结构、多样的表面化学性质、动态变化的营养物质与电子受体梯度，以及微生物的斑块状分布。这些特征在微米尺度上存在显著变化，使得宏观尺度下对微生物迁移的研究结果难以解释，也使机理模型的验证变得困难。在此，我们展示了如何利用简单的微流控装置可视化微生物与微结构生境之间的相互作用，识别影响观测现象的关键过程，并系统性地验证预测模型。这些简单易用的流动池由透明、生物相容且透氧的材料聚二甲基硅氧烷（poly(dimethyl siloxane)）制成。采用标准的光刻技术制备微结构母模，并通过复制模塑法将母模用于浇铸微结构流动池。流动池腔室的物理设计可根据实验需求进行调整：微通道可从简单的线性连接到复杂拓扑结构，其特征尺寸最小可达2 μm。我们模块化的EcoChip流动细胞阵列包含数十个相同的腔室，并通过重力驱动的流控模块实现流量调控。我们证明，利用EcoChip装置，可在系统研究表面化学、流体性质或微生物种群特性影响的同时，保持或系统性地调控物理结构和压力水头。通过使用非致病性、表达绿色荧光蛋白的Vibrio细菌菌株，我们阐述了生境结构、流动条件和接种量对基本传质现象的重要性，并通过实时的颗粒尺度观测，证明了微流控技术为观察这一隐秘世界提供了强有力的视角。

微流控装置可用于实时观察复杂自然过程，并在适当的物理尺度上进行可视化。我们开发了一种简单的微流控装置，可模拟天然多孔介质的关键特征，用于研究地下环境中细菌的生长与迁移。

多孔介质中微生物的生长与迁移对地下水和地表水质量、养分循环等具有重要意义，...

我们通过使用生态芯片装置，能够保持或改变物理结构和压力水头。在利用表达绿色荧光蛋白的非致病性VIO细菌菌株进行系统性传输实验，研究表面化学流体性质以及颗粒或微生物特性的基础上，我们阐明了生境结构、流动条件和接种量对基本传输现象的重要性。微流控软件为人们呈现了一个隐藏世界的引人入胜的视角。您好，我是范德堡大学范德堡整合生物系统修复教育研究所的Dimitri Marker。我是David Schafer，是Viro实验室的一名研发工程师。您好，我是康涅狄格大学环境科学与工程中心化学、材料与生物分子工程系的Leslie Sho，我也是来自Zebra的added Dicot。今天，我们将向您展示一种用于基础环境科学与工程研究的模块化微流控生境阵列的构建方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究微米级结构对森林介质中微生物迁移相互作用的影响。现在，让我们开始吧。创建微流控装置的第一步是在计算机辅助设计（CAD）软件中绘制装置的二维布局。我们使用过 AutoCAD，但也可使用其他绘图软件，例如 ClueIn 或 CorelDRAW。该软件使设计者能够在宏观区域内精确复制物理结构，同时以小于五微米的分辨率定义各个特征。根据 CAD 图纸制作出光刻掩模。我们使用由位于马萨诸塞州北部的 Advanced Reproductions Corporation 公司制造的铬版掩模。接下来的多个微流控器件制备步骤将在洁净室中进行，以制备出模具。将干净的硅片固定在匀胶机平台上，然后在硅片中心倒入几克 SU 8 20 25 光刻胶。首先，硅片以 500 RPM 的转速旋转 15 秒进行初步铺展，随后以 4,000 RPM 的转速旋转 35 秒完成薄层涂覆。离心后，将晶圆置于热板上，在 95 摄氏度下加热 10 分钟，以挥发过量溶剂。制备晶圆的最后一步是去除边缘胶边。该步骤通过将晶圆重新放回匀胶机中，并向镀膜晶圆的外边缘持续施加 SUA 边缘去胶液来完成。下一步是通过选择性地暴露于紫外光来对光刻胶进行图形化。首先，将涂覆好的晶圆放置在平坦的表面上，并将铬掩模直接放置在其上方。鲁比莱斯红遮蔽膜可阻止图案在目标区域外转移。接下来，使用点光源系统透过掩膜向涂覆的晶圆照射剂量为300毫焦/平方厘米的紫外光。最后，将晶圆在95摄氏度下烘烤15分钟，使光刻胶的曝光区域发生交联，从而变得不溶。制作模板的最后一步是去除未交联的光刻胶区域，留下凸起的浮雕结构。首先，将晶圆再次放回匀胶机中，并覆盖显影液。显影液在涂覆后的晶圆上保留约五分钟，然后通过旋转甩去，从而在晶圆表面形成清晰可见的图形。残留的任何残余物通过向旋转的晶圆表面喷射异丙醇冲洗去除。此步骤使用 2200 RPM 的转速旋转约五到十秒。最后，将制备好的母模用氮气流吹干，并存放于培养皿中，直至需要用于器件复制时取出。我们采用硅基弹性体聚二甲基硅氧烷（polymethyl alane）制备微流控器件。首先，将基础材料与固化剂按10:1的质量比加入塑料杯中。接着，将混合物使用Thinky AR 100条件混合器进行搅拌除泡。循环完成后，将液态PDMS均匀地倒在模具上。然后将装有模具和未固化PDMS的培养皿放入真空室中脱气。聚合物中的气泡几乎立即出现。脱气持续进行直至所有气泡消失。将培养皿放入65摄氏度的水平烘箱中至少四小时，以充分完成聚合物的交联。随后，将固化的PDMS从可重复使用的新模板上小心剥离。使用手术刀在图案区域外缘精确切割前四条边，然后用镊子将器件从图案化晶圆上剥离。如有需要，可使用剪刀修整器件边缘。也可将器件的一部分从其余模制的PDMS器件上分离出来。接下来，通过在PDMS上打孔来制备通路孔。我们使用 commercially available 的生物组织穿孔器，其具有多种不同尺寸，并安装在小型轴架上。用镊子取出被压出的PDMS芯块。最后，使用异丙醇和聚丙烯泡沫头棉签清洁经过修整和打孔的装置。用氮气吹干装置后，将其放入烘箱中以彻底去除残留溶剂。制作微流控装置的最后一步是将PDMS键合到玻璃载片基底上，然后首先用液体填充。将PDMS装置和玻璃载片放置于等离子清洗机中，使键合表面朝上。本实验中，我们使用PDC 32 G赫里克等离子清洗机。当真空建立且可见蓝紫色等离子体时，设定计时器为30秒。关闭等离子体发生器。重新对腔室加压，将装置和滑块从腔室中取出，并使键合表面相互接触。在将活化后的部件从腔室中取出时，应迅速操作，以确保表面保持活化状态。轻柔施加压力有助于确保良好的结合。用镊子拉扯一角来检查结合质量。亲水内层可轻松填充缓冲液或去离子水等水溶液。将水溶液加入每个源孔，并通过相应的微孔流动池。当所有腔室充满后，在整个装置上方覆盖一层固化的PDMS薄膜，以减缓蒸发并维持无菌状态。为校准装置中的压力驱动流动，需先用去离子水预填充微结构流动池，然后在装置顶部放置一个流动模块，该模块作为液体输送接口并提供无菌密封。该流动模块可单独使用，也可连接至外部液体储存装置（如塑料注射器）。将装有液体的储存装置（如塑料注射器）或流动模块连接至上游入口。应保持储液装置中的液面高度高于下游端的高度。上游储液池与各个下游出口孔之间的高度差决定了驱动压力流的动力，从而用于量化通过装置的流速。使用钝头的25号针头定期从下游孔中采集样品。例如，我们每15至20分钟采集一次样品，并仔细记录样品间实际经过的时间。使用分析天平记录注射器在取样前和取样后的重量。以累计体积对累计时间作图，其斜率即为平均质量流速。入口储液池的横截面积远大于出口孔道，有助于防止流体流经装置时流速发生显著变化。将取样体积作为纵轴（Y轴）变量，取样时间作为横轴（X轴）变量进行绘图。在 Excel 等简单的绘图程序中，通过获取直线的斜率来确定平均体积流量。使用三种表面分别为羧基、YG 和普通 YG 的三微摩尔荧光乳胶微球稀溶液来可视化流动并研究表面相互作用。首先，将微球配制成浓度为 0.01% 固体的去离子水溶液。将溶液加入上游孔中，并将流动模块重新连接至zu。使用配备MITx BCEB 0 1 3 U黑白相机的Zeiss AIOt 25荧光显微镜，每约10分钟记录一次珠子流动情况，持续观察一小时。通过荧光照明和透射光照明，使用Image J等软件程序快速连续捕获单帧图像，并将其合成为视频。磁珠和结构均可见。当透射光被阻断时，仅可见明亮的荧光磁珠。沿底部表面沉积或附着在捕获装置上的静止磁珠在整个装置中均清晰可见。对于使用活细菌的实验，需准备一种培养物，例如弧菌属（Vibrio species），一种非致病性且表达绿色荧光蛋白的细菌。首先，从超低温冷冻保存中取出储备培养物。将该储备培养物接种至含有无菌LB生长培养基的锥形瓶中。使用一次性接种环，将锥形瓶在振荡条件下过夜培养，以获得处于稳定期的菌液，其浓度约为每毫升10的9次方个细胞。根据具体应用，可对细菌的初始浓度进行更精确的定量。准备一个充满无菌缓冲液的微流控装置。然后将上游孔中的无菌液体吸出，并加入20微升细菌培养物。使用移液器，通过在输出孔端连接注射器产生轻柔的负压，将细菌接种到装置中。孵育后，可通过测定各孔定植后的荧光强度来确定孔中细菌的数量。随后，将上游进样孔中的液体按前述方法吸出，更换为含有25‰盐浓度的缓冲液进行冲洗。使用注射器向下游井中施加人工海水的轻柔压力，用20至40微升缓冲液冲洗各个流动池。这一体积约为初次冲洗后流动池中微流控土壤部分孔隙体积的100至200倍。通过多孔介质长期灌注细菌的方法，完全按照此前所示的方式使用流动模块实现。可随时间测量细菌生长与迁移的荧光及白光图像。本实验中，使用Q imaging公司的彩色五号冷却CCD相机，每隔15至20小时拍摄一次图像，持续七天。我们的装置还可用于研究物理生境结构在为细菌提供躲避原生动物捕食的庇护作用方面的效应。此处为微孔流动池中的细菌，以及体积大得多的纤毛原生动物游仆虫正在装置内摄食细菌。在对微流控装置中流体流动的分析中，我们发现当压力水头为40毫米时，平均流速为0.71微升/分钟。当压力水头增加至60毫米时，流速相应地增加至1.04微升/分钟。在使用具有不同表面化学性质的微珠时，我们观察到未羧基化的微珠在装置表面有更明显的聚集。而直径为6至10毫米的微珠则更容易被截留在较小的孔隙开口中。由于更高的静水压力导致更快的流速，从而减少了微珠的滞留和截留，这在分析生态芯片微流控装置中细菌生长时符合预期。我们注意到器件不同区域在图像强度上的定性差异。荧光强度可作为通道内微生物生物量的代理指标进行量化。在正在进行的实验中，我们观察到低流速条件下持续的剪切力似乎会导致细菌聚集和絮状物形成，这在这些图像中表现明显。我们刚刚向您展示了如何制备和使用简单的微流控装置，以测量颗粒尺度、研究颗粒在多孔介质中的迁移与碰撞传输，或探究微生物在微结构生境中的相互作用。在使用流动池进行研究时，需要考虑微珠的浮力以及胶体和收集器的表面化学性质。当缩放到微流控体系时，表面效应可能主导所观察到的现象。实际上，任何物理结构都可以被整合到微流控流动池的设计中。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Biology

生物学

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