Name: 一种微流体装置研究多个不同的菌株 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 了解如何使用双层微流体装置在相同动态条件下对多个不同酵母菌株进行单细胞成像。该方法可有效防止交叉污染，为研究酵母细胞对环境变化的响应提供简便可靠的实验平台。

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YG 获得伊斯兰开发银行（IDB）奖学金资助。IN 是阿隆学者及埃德蒙·J 教员研究员&#x202D;. &#x202C;特拉维夫大学萨夫拉生物信息学中心&#x202D;.&#x202C; 本研究由ISF基金1499/10资助。

1. 制作透明胶带母版5
<ol>
	<li>在纸上按比例绘制或打印出所需的微通道布局。在本例中，设计包含两条Y形通道，每条宽3 mm（图2）。</li>
	<li>在玻璃载片上贴上多层透明胶带。胶带层数将决定通道的高度（每层约60 μm）。我们使用了3层透明胶带。</li>
	<li>将设计布局放置在平坦的表面上。将载片对准设计图案，然后用手术刀沿布局小心地切割载片上的胶带。</li>
	<li>除去玻璃载片上除微通道布局区域以外的所有透明胶带。</li>
	<li>将载片置于65 °C的加热烘箱中2-3分钟，然后用乙醇轻轻清洁。</li>
</ol>
2. 制备PDMS微流控装置
<ol>
	<li>按照制造商的建议混合PDMS的基底和固化组分。我们使用10:1的基底与固化剂比例。将约30 ml的PDMS混合物倒入培养皿中，使其高度约为0.5 cm。如有需要，在真空环境中对PDMS进行脱气处理。将玻璃片浸入PDMS中，使带有图案的透明胶带面朝上。在倒入PDMS之后再放置玻璃片，可防止玻璃片与培养皿底部之间产生气泡。在65 °C下固化48小时，并使用水平气泡仪确保培养皿处于水平状态。</li>
	<li>在另一个90 mm的培养皿中倒入3 ml PDMS混合物，形成约0.5 mm厚的薄层。（如果有旋涂仪，可用于此步骤）。</li>
	<li>如同步骤2.1所述进行脱气和固化处理。</li>
	<li>使用解剖刀小心地将微流控装置按所需尺寸切割出来。该层称为“流体层”。</li>
	<li>从第二个培养皿中切下一块尺寸相似的薄层PDMS。该层称为“储液层”。</li>
	<li>使用合适尺寸的活检打孔器（我们使用内径1.2 mm的打孔器）在流体层上打出进样口和出样口的孔。</li>
	<li>将储液层放置在厚玻璃片上的设计图样位置，并使用内径2 mm的活检打孔器沿图样中的微通道对齐位置打出储液孔。</li>
	<li>使用乙醇清洁两层PDMS以及一块24 mm × 60 mm的玻璃盖片。自然风干并保持清洁。</li>
	<li>使用标准等离子刻蚀仪（用于不可逆键合）或手持式电晕处理仪6（用于可逆键合），对玻璃盖片和储液层PDMS进行等离子处理。小心地将储液层放置在盖片上以实现粘附（图3）。如有需要，轻轻碾压以排除任何气泡。</li>
</ol>
3. 细胞成像实验
<ol>
	<li>确保所需的培养基已准备好，并装入连接有内径为 0.02 英寸（Tygon）柔性塑料管的适当注射器中，且已安装在注射泵上。</li>
	<li>在液体 YPD 培养基中将 S. cerevisiae 菌株培养至所需生长期。充分涡旋混匀后，取每种菌株 300 μl 转移至微量离心管中。</li>
	<li>向每个孔中轻轻加入 1 μl 浓度为 2 mg/ml 的刀豆蛋白 A（Concanavalin A，sigma）。用去离子水轻轻吹打洗涤两次，以去除各孔中多余的刀豆蛋白 A。</li>
	<li>在刀豆蛋白 A 干燥的同时，用不含葡萄糖的 SC 培养基将菌株洗涤两次，每次 300 μl。去除细胞壁上残留的葡萄糖有助于细胞更好地黏附于刀豆蛋白 A 表面。</li>
	<li>充分涡旋混匀细胞。将每种细胞悬液取 0.75 μl 或更少加入各自对应的孔中（图 3）。用富含营养的培养基轻轻冲洗去除残留的游离细胞。接下来的两个步骤需迅速完成，以防止细胞干燥。</li>
	<li>使用手持式电晕处理仪对芯片及各孔进行充分等离子体处理，注意避免直接接触各孔。小心地将芯片对准并贴合到各孔上（此步骤可在体视显微镜下操作）。轻压使两层 PDMS 紧密贴合。缓慢地向装置内注入约 50 μl 富营养培养基，确保通道内无气泡残留。</li>
	<li>连接装置，将管道插入相应的入口，并启动培养基流动。注意避免将气泡引入装置内，因为气泡较难清除；若出现气泡，可通过断开某一入口或出口，并轻轻敲击装置中气泡所在位置来排除，操作时需小心以免损坏玻璃盖玻片。</li>
	<li>将装置置于显微镜下，找到每个孔中合适的成像位置。</li>
	<li>根据需要，让细胞在富营养培养基流动条件下维持 1 小时或更长时间，以促进细胞恢复。</li>
	<li>开始实验：我们通过两个注射泵持续供液，以防止培养基倒流，并可根据需要调节相对流速。将泵 A 设为 0.8 ml/hr，泵 B 设为 0.2 ml/hr，可使培养基 A 流经通道宽度的 80%（图 4）。通过调整两个泵的流速可动态改变此条件，新的流场条件可在数秒内在整个通道长度方向上达到稳定2。</li>
</ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了一种简单的台式方法，用于构建一种微流控装置，可在动态条件下同时监测多种酵母菌株。在同一个通道中同时监测多个菌株，为比较不同菌株单细胞响应的动力学提供了可靠的工具。本方法的一个优势在于，仅需使用简单技术即可完成装置的制备，无需洁净室环境。事实上，我们还尝试在实验步骤中省略等离子体处理操作（步骤 2.9 和 3.6），仍获得了良好结果，因此即使没有等离子体设备的实验室也可成功实施该实验方案。
通过将不同菌株分别接种于各自的孔中，我们可以在避免细胞混合的同时，在实验过程中仍允许培养基流动至细胞。本方案中的一个关键步骤是在重新注入培养基之前，切勿让细胞干燥（步骤 3.4 - 3.6）。细胞干燥会严重影响其存活率，而若在每个孔中残留过多培养基时尝试封闭装置，则会导致两层 PDMS 之间出现粘附问题。这些限制条件要求我们必须将打孔层保留在装置中，而不是在细胞沉降后将其剥离。因此，打孔层必须足够深，以容纳接种时的初始细胞液滴，但又应尽可能薄，使孔的高径比允许培养基流动至孔底，从而使细胞能够通过直接流动获得外界信号。
本文所述装...

细胞会通过改变其代谢、转录谱和细胞功能，持续响应动态变化的环境。为了研究这些现象，需要能够量化此类变化的方法。其中一种响应的读数是在营养胁迫条件下，应激相关转录因子定位位置的变化。
微流控装置1已被用于动态调控细胞的环境条件2-4。这类装置在活细胞成像方面具有多项优势：可精确控制并动态改变细胞所处环境；可在包括外界条件变化在内的所有时间点对细胞进行实时成像；且所需试剂体积极小。一种非常简单的微流控装置设计是Y形结构装置2，可实现两种条件之间的交替切换。我们常规使用Y形微流控装置，以对通道中的细胞施加动态变化的环境条件。我们利用该装置追踪酵母细胞中荧光标记的应激相关转录因子的定位变化，并在营养条件变化的情况下观察这些变化。例如，我们可以在无葡萄糖培养基环境中，以非常精细的时间分辨率施加含葡萄糖培养基的脉冲（或一系列脉冲）。在这类实验中，研究者通常希望比较不同细胞菌株（例如不同的突变株或不同的野生分离株）的响应差异。然而，Y形通道每次仅能容纳一种菌株；若使用多种菌株，则无法简单地区分不同菌株。为克服这一限制，可采用多个独立通道。如果我们希望对多个菌株施加相同的动态条件，则需要将Y形通道的设计理念与多通道结构相结合。但实现这一方案存在两个挑战：一是难以在同一时间将完全相同的条件施加到所有通道；二是单个装置中可集成的Y形通道数量受到几何空间的限制。因此，我们希望寻找一种能够在动态条件下于同一通道内同时观察多个菌株的方法。
本文介绍一种双层微流控装置，可用于在相同动态条件下，于同一通道内对多种菌株进行成像。底层由带有单排微孔的薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）构成，该层与玻璃盖玻片连接，形成若干微孔腔室，用于放置不同菌株，并通过刀豆蛋白A将菌株固定于玻璃表面。第二层采用“透明胶带法”5制备的Y形微流控结构。在将菌株置入微孔腔室后，迅速将第二层对准并贴合至第一层，从而形成一个包含多个菌株腔室的连续通道。该最终装置可在同一通道内同步监测多种菌株，确保所有菌株在完全相同的时间点经历完全相同的环境条件。整个装置的设计与制备过程均可在实验台上完成，仅需常规实验工具，无需软光刻技术。

<table><tbody><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）- SYLGARD 184</td><td>Dow Corning USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Nalgene</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm)</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Chemyx</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>电晕处理仪</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 软管</td><td>Tygon</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白A（Concanavalin-A）</td><td>Sigma</td><td>C7275</td><td></td></tr><tr><td>透明胶带</td><td>3M Scotch</td><td>Transparent Tape 1/2&quot;</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

研究细胞对环境变化的响应面临诸多实验挑战：通常需要在变化的条件下以比较的方式对细胞进行成像。多孔板常规用于比较多种不同菌株或细胞系，但对环境动态的控制有限。另一方面，微流控装置能够精确调控周围环境的动态变化，但在其中成像并区分多个菌株却具有挑战性。本文描述了一种简便快速制造微流控装置的方法，该装置可在同一通道内对多个不同的酵母菌株施加动态变化的环境条件。该装置通过简单方法设计和制造，无需软光刻技术。装置由一个Y形流动通道与第二层含有微孔阵列的结构相连组成。不同菌株被分别放置于独立的微孔中，可在完全相同的动态条件下进行成像。我们展示了该装置用于检测不同酵母菌株在营养变化脉冲刺激下蛋白质定位响应的应用。

为了展示不同菌株之间的分离效果，我们在相邻的微孔中分别接种了两种可区分的酵母菌株。对整个微孔进行成像显示，微孔之间无细胞泄漏（图5a,b）。两种菌株的转录因子 MSN2 均标记有 YFP。为了测试动态变化条件下的同时作用，我们切换了两个进样通道的流速，引入无葡萄糖培养基的阶跃变化，导致 Msn2-YFP 定位于细胞核内（图5c,d）。在所有微孔中测得的响应同时发生，表明该装置可用于向多个微孔同时施加动态条件。
<img alt="微流控装置示意图；入口、出口、流体控制层、微井层、玻璃盖玻片；流体控制。" src="/files/ftp_upload/4257/4257fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 装置设计。 该装置由盖玻片、一层较薄的“微井层”和一个连接管路的“流体层”组成。
<p cla...

我们介绍一种简单的方法，用于制备微流控装置，可在无需洁净室或软光刻技术的情况下，对多种不同菌株施加类似的动态条件。

研究细胞对环境变化的反应面临诸多实验挑战：通常需要在不断变化的条件下对细胞进行成像，且常常在……

以下方法的总体目标是在相同的动态条件下，对不同酵母菌株的单个细胞行为进行成像。该目标通过构建一个双层微流控装置来实现：底层将分别容纳不同的菌株，而顶层则在第二步中提供动态流动条件。将不同的酵母菌株置入各孔中，然后关闭装置，从而形成一个包含多个分离菌株的单一通道。接下来，我们通过控制 Y 型通道两个入口的流速，对细胞在动态培养基变化下的响应进行成像。结果显示，不同菌株在相同动态条件下无交叉污染，且可被独立观察。该微流控装置相较于其他现有系统具有多项关键优势，能够在相同的动态条件下对多种不同菌株进行同步成像。此外，重要的是，该方法可在任何实验室中轻松制造，无需特殊设备。该方法的提出源于关于如何追踪不同野生东部分离株对饥饿传代响应的讨论。首先，按比例绘制或打印出所需的微通道布局。接下来，用多层透明胶带覆盖载玻片，以达到微通道所需的高度。将设计好的布局图案放在平坦的表面上，并将载玻片对准图案放置。然后根据布局小心地在载玻片的胶带上进行裁切。最后去除载玻片上所有区域的透明胶带。接受微通道的布局。将载玻片置于65°C的加热烘箱中三分钟。然后用乙醇轻轻清洗。按照制造商的建议混合PDMS的基底剂和固化剂组分。将约30毫升PDMS混合物倒入培养皿中，厚度约为0.5厘米。如有需要，在真空环境中对PDMS进行脱气处理。将玻璃载玻片浸入PDMS中，使带有图案的透明胶带面朝上。在PDMS中放置图案可防止载玻片与培养皿底部之间产生气泡。在65摄氏度下固化48小时，使用水平仪确保培养皿处于水平状态。在一个新的90毫米培养皿中倒入3毫升PDMS混合液。如果有旋转编码器，可使用该设备完成此步骤。DGAs 及固化过程如前所述。现在用活检打孔器小心地将微流控装置的流动层切割至所需尺寸。在流体层上为入口和出口打孔。同时从第二个培养皿中切割出尺寸相似的储液层，并将其放置在厚玻璃片上。将设计布局滑动覆盖其上。然后使用乙醇沿布局中的微通道对齐打孔形成孔洞，清洗PDMS两层和玻璃盖玻片，并用空气干燥。接着，对玻璃盖玻片和带孔PDMS层使用标准等离子体刻蚀仪进行不可逆键合处理，或使用手持式电晕处理仪进行可逆键合处理。小心地将带孔PDMS层放置在盖玻片上方，使其粘附。轻轻去除任何气泡。将所需培养基装入合适的注射器中，并连接到穿过注射泵的泰贡管（tigon tubing）上。用于细胞成像。利用优势。进入所需阶段，充分涡旋混匀培养物，并将300微升转移至微量离心管中。轻轻将一微升con canna A加入PDMS微孔层的每个孔中。在cona A干燥的同时，通过轻轻吹打水，将每个孔中过量的cona A清洗两次。用300微升不含葡萄糖的SC培养基将菌株清洗两次。从细胞壁上洗去残留的葡萄糖有助于菌株正确黏附到conval上。涡旋振荡后，用移液器将约0.5微升的细胞悬液充分混匀后加入各个孔中。用富含营养的培养基轻轻冲洗，

a-microfluidic-device-for-studying-multiple-distinct-strains

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种微流体装置研究多个不同的菌株

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。...

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

本方案描述了一种用于在化学效应物的稳定浓度梯度中研究细菌趋化性的微流控装置的开发。...

一种用于在稳定浓度梯度下定量细菌趋化性的微流控装置

来源： Cabeen, M. T., 等单细胞微流控分析 芽孢杆菌属 subtilis. J. Vis. Exp.

在微流控系统中以单细胞分辨率追踪细菌生长

本方案介绍了用于原核微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器（PLBR）的制备、装置搭建及基本操作。作为原理验证，对具有工业相关性的微生物进行了分析，从而获得了在特定时间段内的生长速率、形态特征及表型异质性等方面的深入信息，而这些信息采用传统方法极难实现。...

用于微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器：制备、系统搭建与操作

本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片。该芯片可通过荧光检测或免疫检测方法，对细胞内蛋白质、酶、辅因子和第二信使进行定量分析。...

一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

单细胞微流控分析 Bacillus subtilis

本报告介绍了一种基于微流控芯片的方法，用于建立单细胞培养实验，可实现多个单细胞的高效配对及显微分析。...

以微流控芯片确定性建立基于单细胞的共培养体系

我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。...

利用高通量微流控装置产生动态环境条件

由于土壤不透明，其内部微生物组分之间的相互作用难以在细胞分辨率下直接观察。本文介绍了两种微流控工具，为研究真菌-微生物相互作用提供了新的机会。这些装置用途广泛且操作简便，能够实现高时空控制，并在细胞水平上进行高分辨率成像。...

用于在细胞水平上探究真菌-微生物相互作用的微流控工具

我们介绍一种用于毫流体连续培养装置（MCCD）的实验方案，该装置可在恒定的低营养条件下（低至数百纳摩尔浓度）或在分钟时间尺度上的动态营养波动条件下培养细菌群体。...

用于研究的连续培养毫流体装置 大肠杆菌 在低且波动的营养条件下

了解如何使用双层微流体装置在相同动态条件下对多个不同酵母菌株进行单细胞成像。该方法可有效防止交叉污染，为研究酵母细胞对环境变化的响应提供简便可靠的实验平台。

一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

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