一种微流体装置研究多个不同的菌株

以下方法的总体目标是在相同的动态条件下对来自不同酵母菌株的单个细胞的行为进行成像。这是通过制造两层微流体装置来实现的，或者底层将分别包含每个不同的应变，顶层将提供动态流动条件作为第二步。将不同的酵母菌株放置在孔中，并关闭装置，形成一个具有多个分离菌株的单个通道。

接下来，我们对细胞对动态培养基变化的反应进行成像通过控制 Y 通道的两个输入中的流速，结果显示不同的菌株在相同的动态条件下，并且孔之间没有交叉污染。与其他现有系统相比，这种微流体设备具有几个关键优势。它允许在相同的动态条件下对多种不同的应变进行成像。

此外，重要的是，它可以在任何实验室中轻松制造，无需特殊设备。这种方法来自关于如何跟踪不同 Wild East 分离株对饥饿传递的反应的讨论。开始、绘制或打印出所需的微通道布局以进行缩放。

接下来，用透明胶带层覆盖载玻片 为了获得所需的通道高度，请将布局设计放在平坦的表面上，并将载玻片对准设计图案。现在根据布局小心地剪下载玻片上的胶带。撕下载玻片所有区域的透明胶带。

接受那些在微通道的布局中。将玻片放入 65 摄氏度的加热箱中 3 分钟。然后用乙醇轻轻清洁。

按照制造商的建议混合 PDMS 的基础组分和固化组分。将约 30 毫升 PDMS 混合物倒入培养皿中，高度约为 0.5 厘米。如果需要，在真空中对 PDMS 进行脱气。

将载玻片浸入 PDMS 中，带图案的透明胶带朝上。将模型放置在 PDMS 之后可防止在载玻片和培养皿之间形成气泡 底部在 65 摄氏度下固化 48 小时，确保在新的 90 毫米培养皿中使用气泡水平仪保持水平。倒入 3 毫升 PDMS 混合物。

如果可用，可以在 spin coder 上完成此步骤。DGA 和固化，如前所述。现在用活检打孔器轻轻地将微流体装置的流动层切成所需的大小。

为流层中的入口和出口创建孔。还要从第二个培养皿中切出一个类似大小的孔层，并放在厚玻璃杯上。在设计布局上滑动。

然后使用乙醇与布局上的微通道对齐打孔，清洁 PDMS 层和玻璃盖玻片并风干。接下来，使用标准等离子体蚀刻机处理玻璃盖玻片和孔层 PDMS，用于不可逆键合，或用手持式电晕处理机进行可逆键合。小心地将孔层放在盖玻片的顶部，以引起粘附。

轻轻擦去任何气泡。在适当的注射器中准备所需的培养基，并连接到穿过注射泵的 tigon 管。用于细胞成像。

使用优势。进入所需阶段，彻底涡旋培养物，并将 300 微升转移到微量离心管中。将一微升 con canna A 轻轻放入 PDMS 孔层的每个孔中。

在 A 中的 con 干燥时，轻轻移水，从每个孔中洗掉多余的 conna A 两次。用 300 微升缺乏葡萄糖的 SC 培养基洗涤菌株两次。从细胞壁上清洗残留的葡萄糖有助于正确粘附 conval。

在涡旋后，细胞将大约 0.5 μL 的细胞悬液彻底移液到各个孔中。用丰富的培养基轻轻洗去残留的细胞。接下来的两个步骤需要快速执行，以防止细胞干涸。

作为可选的阶梯血浆，处理芯片和孔，注意不要直接撞击孔。然后在立体镜下，小心地将芯片放在孔上，密切注意两者之间的对齐情况。轻轻按压以粘附两层 PDMS。

慢慢地用大约 50 微升的富集培养基完全填充设备，确保通道内没有气泡。现在连接设备，将试管插入适当的入口并开始培养基流动。注意管道中不要形成气泡，因为气泡会卡在设备中并破坏流动。

继续将设备置于显微镜下，并在每个显微镜中找到合适的成像点。将细胞置于富集、中等流速下 1 小时或更长时间（如有必要）。允许恢复。

使用恒定流量设置开始实验。将 A 泵送至每小时 0.8 毫升，泵送 B 至每小时 0.2 毫升。对于流经通道宽度 80% 以上的介质 a。

我们可以通过改变相对流速来动态改变设备中的条件。新条件在几秒钟内沿着整个通道稳定下来 为了证明不同菌株之间的分离。两种可区分的酵母菌株在交替的孔中成像。

请注意，在本实验中，孔之间没有细胞泄漏。两种菌株都有用 YFP 标记的转录因子 MSN 2，以测试动态变化条件的同时效果。改变两个输入通道中的流速，形成一个无葡萄糖培养基的步骤。

这导致 MSN 2 定位到细胞核。重要的是，可以分析单个细胞中核 MSN 两个 YFP 水平的时间轨迹。因此，PDMS 微流体装置可用于将并发动态条件应用于多个井。

在尝试此过程时，请务必记住在设备组装过程中不要让细胞变干。一旦掌握，这项技术就可以轻松完成，无需软光刻。