利用电泳迁移分析（EMSA）和筛选功能的非编码基因变异DNA的亲和沉淀试验（DAPA）

该实验策略的总体目标是研究与疾病相关的非编码变异的功能。这种方法可以帮助回答基因组学中的关键问题，例如实际上不会改变氨基酸序列的遗传变异如何仍然导致疾病表型。该技术的主要优点是它提供了一个简化的过程来评估功能活性的遗传变异，并提供了对调节蛋白和受影响的途径的见解。

该技术有利于研究任何具有候选因果变异的疾病。因为无论所研究的表型如何，分析这些变异的程序都是通用的。虽然这种方法可以提供对人类疾病的见解，但它也可以应用于任何生物体的突变。

在本实验中，将从 B 淋巴母细胞样细胞制备核裂解物，但该程序可应用于大多数细胞系。使用血细胞计数器计数细胞后，减少所需数量的细胞进行裂解。吸出培养基，加入 10 毫升冰冷的 PBS，然后再次旋转细胞。

用 PBS 第二次洗涤细胞，并在离心后去除 PBS。将细胞上颚重悬于冰冷的 PBS 中，每 10 个细胞使用 1 毫升 PBS 至第七个细胞。将 1 毫升细胞悬液分装到 1.5 毫升微量离心管中，使每管含有 10 至第 7 个 PBS 细胞。

离心 2 分钟，然后吸出 PBS。向 CE 缓冲液的工作储备液中加入 1 毫摩尔二硫苏糖醇 （DTT）、1X 磷酸酶抑制剂和 0.5 毫摩尔苯基甲磺酰氟 （PMSF） 的工作储备液中。用 400 μL 该缓冲液重悬每个细胞调色板，并在冰上孵育 15 分钟。

向每个微量离心管中加入 25 微升 10%Nonidet P-40，并通过移液混合。以 4 摄氏度和最大速度离心 3 分钟。倒出并丢弃上清液。

接下来，添加到 NE 缓冲液的工作储备液中，加入 1 毫摩尔 DTT、1X 磷酸酶抑制剂和 1 毫摩尔 PMSF。用 30 微升此缓冲液重悬每个细胞上颚，并通过涡旋混合。在 4 摄氏度下，在试管旋转器中孵育 10 分钟。

离心 2 分钟。收集澄清的上清液，即核裂解物。在零下 80 摄氏度储存之前，将细胞核裂解物分装，以避免可能降解蛋白质的多次冻融循环。

通过制备 50 纳摩尔的寡核苷酸工作储备液来开始此过程，如方案文本中所述。将寡核苷酸放入 90 摄氏度的加热块中 5 分钟。5 分钟后，关闭加热块，让寡核苷酸缓慢冷却至室温至少 1 小时，然后再使用。

接下来，准备电泳迁移率变化测定或 EMSA 凝胶。从预制的 6% 三硼酸盐-EDTA 或 TBE 凝胶中取出载玻片，并在去离子水下冲洗数次，以去除孔中的任何缓冲液。组装凝胶电泳仪，用 0.5X TBE 缓冲液填充内腔检查是否泄漏。

如果没有缓冲液泄漏到外腔，则填充外腔，大约三分之二。在 100 伏特下预电泳凝胶 60 分钟。预运行完成后，用 200 μL 0.5X TBE 缓冲液冲洗每个孔。

准备结合缓冲液预混液。在微量离心管中，混合所有反应通用的这些试剂。10X 结合缓冲液、DTT 聚山梨酯、Poly（dI-dC） 和鲑鱼精子 DNA。

为了设置 EMSA 反应，向每个微量离心管中加入不含核酸酶的水，使得加入所有试剂后的最终体积为 20 μL。向每个微量离心管中加入适量的预混液。将 8 μg 细胞核裂解物添加到适当的微量离心管中。

包括含有寡核苷酸的试管，不含核提取物，作为阴性对照。将 50 飞摩尔寡核苷酸加入适当的微量离心管中，然后轻弹混合。将内容物短暂旋转到试管底部。

在室温下孵育所有试管 20 分钟。接下来，向每个微量离心管中加入 2 μL 10X 橙子上样染料。上下移液以混合。

通过上下吹打混合，然后将每个样品排放到单独的孔中，将样品加载到运行前 6% 的 TBE 凝胶中。在 80 伏特下运行凝胶约 60 至 75 分钟，直到橙色染料在凝胶中迁移了三分之二到四分之三。电泳完成后，用凝胶刀撬开塑料盒。

从凝胶盒中取出凝胶，并将其放入含有 0.5% TBE 缓冲液的容器中，以防止其变干。将凝胶放在红外和化学发光成像系统的表面上。消除任何会破坏图像的气泡或污染物。

使用扫描系统软件扫描凝胶，如实验方案文本中所述。要开始此程序，请按照方案文本中的说明制备 5 微摩尔寡核苷酸工作储备液。将寡核苷酸放入 95 摄氏度的加热块中 5 分钟。

5 分钟后，关闭加热块，让寡核苷酸缓慢冷却至室温，然后再使用。将以下缓冲液加热至室温：结合缓冲液、低严格性洗涤缓冲液、高严格性洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。为每种变体准备结合混合物。

将 1 体积的细胞核裂解物与 2 体积的结合缓冲液混合。添加 1X 磷酸酶抑制剂、0.5 毫摩尔 PMSF 和 1X 结合增强剂。向每个结合混合物中加入 10 μL 5 μml 生物素化捕获 DNA。

通过轻弹试管数次来混合。将结合混合物在室温下孵育 20 分钟。接下来，向每个结合混合物中加入 100 μL 链霉亲和素 MicroBeads。

在室温下孵育 10 分钟。对于每个正在测试的寡核苷酸探针，在磁性分离器中放置一个结合柱。确保色谱柱上标有结合混合物中使用的变体寡核苷酸。

将微量离心管直接放在每个结合柱下方，并涂抹 100 μL 结合缓冲液冲洗柱。将每种结合混合物的内容物移液到单独的列中。让液体完全流过色谱柱进入微量离心管。

将 100 μL 低严格度洗涤缓冲液涂抹到色谱柱上，并等待色谱柱储液器排空。再次将 100 μL 低严格度洗涤缓冲液涂抹到色谱柱上。向色谱柱上添加 100 μL 高严格度洗涤缓冲液，并等待色谱柱储液槽排空。

再次向色谱柱上添加 100 μL 高严格度洗涤缓冲液。向色谱柱中加入 30 μL 非变性洗脱缓冲液，静置 5 分钟。最后，再添加 50 μL 天然洗脱缓冲液以洗脱结合的转录因子。

为了探索 EMSA 结果的可重复性以及冻融循环的后果，使用含有遗传变异的参考或非参考等位基因的寡核苷酸来探测多次冻融循环后 B 淋巴细胞核提取物的相同制备物。蓝色箭头表示空闲探针。转录因子与寡核苷酸的结合表现为凝胶上半部分的一条带，由红色箭头表示。

这些结果表明，将这种特殊的核提取物冷冻和解冻多达五次似乎对蛋白质的完整性没有影响。优化 EMSA 的信噪比也很重要。使用不同浓度的寡核苷酸来探测核裂解物的单一制备物。

观察到条带强度增加，观察到高达 100 飞摩尔的寡核苷酸。此处显示了狼疮相关风险等位基因研究的代表性结果。转录因子 STAT 1 首先通过 DAPA 鉴定，然后进行蛋白质组学分析。

然后，DAPA 蛋白质印迹证实了 STAT 1 的身份，以及 STAT 1 的磷酸化形式与狼疮风险寡核苷酸的更高结合。在此程序之后，可以执行其他技术，例如质谱和 western blot。这将帮助我们识别显示等位基因依赖性结合的调节蛋白。

荧光素酶等报告基因检测也可用于研究基因表达作为等位基因函数的变化。