一种优化的协议电泳迁移分析使用红外荧光染料标记的寡核苷酸

该检测的总体目标是使用非放射性探针检测蛋白质-DNA 相互作用。这种方法可以帮助回答分子生物学和生物化学领域的关键问题，例如确定蛋白质的 DNA 靶序列。这种技术的主要优点是它是使用放射性探针的一种简单、安全且省时的替代方案。

要开始此程序，请使用微型蛋白质凝胶系统制备含有 0.5x 三硼酸盐 EDTA 或 TBE 和 2.5% 甘油的 5% 天然聚丙烯酰胺凝胶。要制备 4 块凝胶的 30 毫升凝胶溶液，请将蒸馏水、TBE、过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺双和甘油混合。立即通过凝胶溶液。

聚合后，将凝胶包裹在预先用 0.5x TBE 润湿的透明保鲜膜中，并储存在 4 摄氏度。接下来，设计一个大约 51 mer 的长寡核苷酸。设计大约 14 个聚体的互补短寡核苷酸，并在 5 个主要末端进行红外荧光染料修饰。

制备寡核苷酸后，将它们重悬于 1x Tris-EDTA 缓冲液中至终浓度为 100 微摩尔。对于退火，在 1.5 mL 试管中混合 0.6 μL 五重染料短寡核苷酸、1.2 μL 长寡核苷酸和 28.2 μL 氯化钠 Tris-EDTA 缓冲液。将试管放入沸水中 5 分钟，然后关闭热源，让带有退火寡核苷酸的水在黑暗中冷却过夜。

为了制备双链 DNA 探针，将 30 微升退火的寡核苷酸与 DNTP、Klenow 缓冲液、Klenow 五引物染料标签和双蒸水在 0.2 毫升 PCR 管中混合。将混合物在 37 摄氏度下在 PCR 机器中孵育 60 分钟。然后，加入 3.4 微升 0.5 摩尔 EDTA 以终止反应，并在 PCR 机器中以 75 摄氏度加热灭活 20 分钟。

然后，用氯化钠 Tris-EDTA 缓冲液将填充的探针稀释至终浓度为 0.1 微摩尔。将寡核苷酸在零下 20 摄氏度的温度下避光储存，直到准备使用。要制备未标记的探针，请在 1.5 mL 试管中混合 20 μL 长寡核苷酸、20 μL 长 R 寡核苷酸和 60 μL 氯化钠 Tris-EDTA 缓冲液。

将试管放入沸水中 5 分钟，然后关闭热源，让带有退火寡核苷酸的水冷却过夜。通过混合 Tris HCl、氯化钠、氯化钾、氯化镁、EDTA、DTT、BSA 和双蒸水，制备 1 毫升 5x 结合缓冲液。在设置结合反应之前，在 0.5x TBE 和 2.5% 甘油中预泳 5% 天然聚丙烯酰胺凝胶，以在 80 伏电压下去除所有痕量过硫酸铵 30 分钟至 1 小时，或直到电流不再随时间变化。

接下来，混合 4 微升 5x 结合缓冲液、80 至 200 ng 纯化蛋白 A、1 微升 0.1 微摩尔染料偶联探针和双蒸水。将混合物在室温下避光孵育 15 分钟。孵育后，将所有结合反应物上样到凝胶上，并以每厘米 10 伏特的电压将凝胶电泳至所需距离。

用铝盖住凝胶装置，以尽可能使凝胶处于黑暗中。用蒸馏水清洁红外成像系统的扫描仪床。擦干含有凝胶的玻璃板，然后将它们放在扫描仪床上。

打开红外成像软件，然后单击 Acquire 选项卡。对于较厚的印版，请使用 700 的通道、自动的强度、84 微米的分辨率、中等的质量和 3.5 毫米的焦点偏移。选择凝胶在扫描仪上占据的区域。

最后，单击 Start 开始 开始扫描。使用 Orange G 上样染料可以观察电泳的进度，而溴酚蓝是在扫描过程中检测到的，因此会干扰图像分析。在结合反应中加入 dI-dC 消除了纯化的 6xHis-SOX-2 与五种引物染料 DNA 探针的结合。

在 LIM-4 结合位点突变的 LIM-4 突变体和 SOX-2 冷探针在与红外荧光染料标记的探针结合 6xHis-SOX-2 时与野生型冷探针一样有效。然而，在 SOX-2 结合位点突变的 LIM-4 和 SOX-2 突变体冷探针的竞争效率远低于野生型冷探针与 6xHis-SOX-2 结合。使用 6xHis 和 Flag 表位对 SOX-2 DNA 复合物进行超移分析，得到超移的 SOX-2 DNA 条带。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两到四个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住将红外探头置于黑暗中。按照此程序，可以执行其他方法，如 CRISPR cas9 基因组编辑，以回答其他问题，例如特定 DNA 结合序列的重要性。

开发后，这项技术为生物化学领域的研究人员探索各种模式生物中的蛋白质-DNA 相互作用铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用非放射性 DNA 标记确定蛋白质-DNA 相互作用有了很好的了解。不要忘记，使用丙烯酰胺可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如个人防护设备。