一种优化的协议电泳迁移分析使用红外荧光染料标记的寡核苷酸
2016年11月29日
我们在这里描述使用纯化SOX-2蛋白与红外荧光染料标记的DNA探针作为案例研究解决的重要生物学问题一起荧光电泳迁移实验（FEMSA）的优化方案。
该检测的总体目标是使用非放射性探针检测蛋白质-DNA 相互作用。这种方法可以帮助回答分子生物学和生物化学领域的关键问题，例如确定蛋白质的 DNA 靶序列。这种技术的主要优点是它是使用放射性探针的一种简单、安全且省时的替代方案。
要开始此程序，请使用微型蛋白质凝胶系统制备含有 0.5x 三硼酸盐 EDTA 或 TBE 和 2.5% 甘油的 5% 天然聚丙烯酰胺凝胶。要制备 4 块凝胶的 30 毫升凝胶溶液，请将蒸馏水、TBE、过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺双和甘油混合。立即通过凝胶溶液。
聚合后，将凝胶包裹在预先用 0.5x TBE 润湿的透明保鲜膜中，并储存在 4 摄氏度。接下来，设计一个大约 51 mer 的长寡核苷酸。设计大约 14 个聚体的互补短寡核苷酸，并在 5 个主要末端进行红外荧光染料修饰。
制备寡核苷酸后，将它们重悬于 1x Tris-EDTA 缓冲液中至终浓度为 100 微摩尔。对于退火，在 1.5 mL 试管中混合 0.6 μL 五重染料短寡核苷酸、1.2 μL 长寡核苷酸和 28.2 μL 氯化钠 Tris-EDTA 缓冲液。将试管放入沸水中 5 分钟，然后关闭热源，让带有退火寡核苷酸的水在黑暗中冷却过夜。
为了制备双链 DNA 探针，将 30 微升退火的寡核苷酸与 DNTP、Klenow 缓冲液、Klenow 五引物染料标签和双蒸水在 0.2 毫升 PCR 管中混合。将混合物在 37 摄氏度下在 PCR 机器中孵育 60 分钟。然后，加入 3.4 微升 0.5 摩尔 EDTA 以终止反应，并在 PCR 机器中以 75 摄氏度加热灭活 20 分钟。
然后，用氯化钠 Tris-EDTA 缓冲液将填充的探针稀释至终浓度为 0.1 微摩尔。将寡核苷酸在零下 20 摄氏度的温度下避光储存，直到准备使用。要制备未标记的探针，请在 1.5 mL 试管中混合 20 μL 长寡核苷酸、20 μL 长 R 寡核苷酸和 60 μL 氯化钠 Tris-EDTA 缓冲液。
将试管放入沸水中 5 分钟，然后关闭热源，让带有退火寡核苷酸的水冷却过夜。通过混合 Tris HCl、氯化钠、氯化钾、氯化镁、EDTA、DTT、BSA 和双蒸水，制备 1 毫升 5x 结合缓冲液。在设置结合反应之前，在 0.5x TBE 和 2.5% 甘油中预泳 5% 天然聚丙烯酰胺凝胶，以在 80 伏电压下去除所有痕量过硫酸铵 30 分钟至 1 小时，或直到电流不再随时间变化。
接下来，混合 4 微升 5x 结合缓冲液、80 至 200 ng 纯化蛋白 A、1 微升 0.1 微摩尔染料偶联探针和双蒸水。将混合物在室温下避光孵育 15 分钟。孵育后，将所有结合反应物上样到凝胶上，并以每厘米 10 伏特的电压将凝胶电泳至所需距离。
用铝盖住凝胶装置，以尽可能使凝胶处于黑暗中。用蒸馏水清洁红外成像系统的扫描仪床。擦干含有凝胶的玻璃板，然后将它们放在扫描仪床上。
打开红外成像软件，然后单击 Acquire 选项卡。对于较厚的印版，请使用 700 的通道、自动的强度、84 微米的分辨率、中等的质量和 3.5 毫米的焦点偏移。选择凝胶在扫描仪上占据的区域。
最后，单击 Start 开始 开始扫描。使用 Orange G 上样染料可以观察电泳的进度，而溴酚蓝是在扫描过程中检测到的，因此会干扰图像分析。在结合反应中加入 dI-dC 消除了纯化的 6xHis-SOX-2 与五种引物染料 DNA 探针的结合。
在 LIM-4 结合位点突变的 LIM-4 突变体和 SOX-2 冷探针在与红外荧光染料标记的探针结合 6xHis-SOX-2 时与野生型冷探针一样有效。然而，在 SOX-2 结合位点突变的 LIM-4 和 SOX-2 突变体冷探针的竞争效率远低于野生型冷探针与 6xHis-SOX-2 结合。使用 6xHis 和 Flag 表位对 SOX-2 DNA 复合物进行超移分析，得到超移的 SOX-2 DNA 条带。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两到四个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住将红外探头置于黑暗中。按照此程序，可以执行其他方法，如 CRISPR cas9 基因组编辑，以回答其他问题，例如特定 DNA 结合序列的重要性。
开发后，这项技术为生物化学领域的研究人员探索各种模式生物中的蛋白质-DNA 相互作用铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用非放射性 DNA 标记确定蛋白质-DNA 相互作用有了很好的了解。不要忘记，使用丙烯酰胺可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如个人防护设备。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概览
本文介绍了一种优化的荧光电泳迁移率变动分析法（fEMSA）协议，使用纯化的SOX-2蛋白和红外荧光染料标记的DNA探针。该方法旨在检测蛋白-DNA相互作用，而不使用放射性材料，提供了一种更安全和更有效的替代方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 分子生物学
- 生物化学
- 蛋白-DNA相互作用
背景
- 电泳迁移率变动分析法（EMSA）对于研究蛋白-DNA相互作用至关重要。
- 传统的EMSA方法通常依赖于放射性探针，这会带来安全风险。
- 荧光探针为检测这些相互作用提供了一种非放射性的替代方案。
- SOX-2是干细胞生物学中的一个关键蛋白，使其与DNA的相互作用变得尤为重要。
研究目的
- 开发一种更安全、更有效的检测蛋白-DNA相互作用的协议。
- 利用荧光探针以增强可视化和分析。
- 为分子生物学和生物化学研究人员提供详细的方法。
使用的方法
- 准备五百分之一的天然聚丙烯酰胺凝胶。
- 使用0.5x三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸（TBE）缓冲液。
- 在凝胶中加入甘油以增加稳定性。
- 混合特定试剂以创建凝胶溶液。
主要结果
- fEMSA协议成功检测到蛋白-DNA相互作用。
- 荧光探针提供了清晰的可视化，而不会引起安全问题。
- 与传统技术相比，该方法效率高且节省时间。
- 结果表明该协议在各种生物学环境中都适用。
结论
- 优化的fEMSA协议是研究人员的一个宝贵工具。
- 非放射性方法增强了分子研究的安全性和效率。
- 这种方法可以应用于各种蛋白质和DNA序列。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables safe, cost-effective detection of protein-DNA interactions using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides, eliminating radioactivity-related hazards and reducing assay turnaround time. It supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, reproducible binding data for transcription factors like SOX-2. The method enhances predictive confidence in lead identification workflows by delivering clear, analyzable electrophoretic shifts without radioisotope handling constraints.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcription factor-DNA binding specificity to validate therapeutic targets such as SOX-2 in neuronal differentiation pathways.
- Operational Value: Uses infrared fluorescent probes that allow direct visualization and quantification without autoradiography or phosphorimaging.
- Scientific Value: Detects altered binding affinity due to missense mutations (e.g., SOX-2G73E), supporting mechanistic insight into pathogenic variants.
- Operational Value: Eliminates radioactive waste disposal requirements, improving lab safety and reducing regulatory overhead.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-dependent binding curves to assess protein-DNA interaction kinetics and affinity under controlled conditions.
- Operational Value: Utilizes stable, infrared dye-labeled probes storable at −20°C, enabling batch preparation and reuse across multiple experiments.
- Scientific Value: Permits competition assays with unlabeled probes to determine binding specificity and identify effective disruptors.
- Operational Value: Compatible with standard native PAGE systems and infrared imagers, requiring no specialized electrophoresis equipment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro binding data to phenotypic outcomes, such as olfactory neuron identity transformation, supporting translational relevance.
- Operational Value: Requires only purified protein and oligonucleotide inputs, making it adaptable to various disease-relevant systems.
- Scientific Value: Supershift assays using epitope-tagged proteins (e.g., 6xHis, flag) confirm complex identity, increasing data interpretability.
- Operational Value: Total assay time of 2–4 hours allows integration into medium-throughput screening cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The fEMSA method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and informing lead selection through mechanistic de-risking of protein-DNA interactions.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulator binding to cis-regulatory elements to clarify pathway activity and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding readouts that enable comparison of wild-type and mutant protein variants.
- Analytics: Generates electrophoretic shift patterns and competition data suitable for densitometric analysis and KD estimation.
- Translational Research: Connects binding defects to cellular phenotypes, aiding in biomarker-aligned target prioritization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing transcription factor-DNA interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by providing direct, visual evidence of sequence-specific binding.
- Operational Value: Reduces per-assay cost and time by avoiding radioactive probe synthesis, decay correction, and exposure delays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by minimizing false positives from nonspecific binding through rigorous controls.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates with well-characterized mechanism of action at the DNA-binding level.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide annealing, fill-in reactions, and native gel electrophoresis.
- Depends on access to an infrared imaging system capable of 700 nm channel detection.
- Necessitates standardized binding buffer composition and protein purification quality for reproducible results.
- Requires dark handling of IR-labeled probes to prevent photodegradation and signal loss.
- Limited to nucleic acid-binding proteins; not suitable for RNA or protein-protein interaction studies without adaptation.
