Name: 凝胶电泳迁移分析（EMSA）为RNA，蛋白质相互作用的研究：IRE / IRP示例 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 学习凝胶电泳迁移分析（EMSA）技术用于研究RNA与蛋白质相互作用，以铁调节蛋白（IRP）与铁反应元件（IRE）的结合为示例。该方法通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA-蛋白质复合物与游离RNA，实现可视化检测。

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本工作得到了加拿大卫生研究院（MOP-86514）资助项目的资助。

小鼠实验程序已获得麦吉尔大学动物护理委员会（协议编号 4966）的批准。
1. 培养细胞中蛋白质提取物的制备
<ol>
	<li>用 10&#160;ml 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养细胞两次。</li>
	<li>用橡胶刮棒或塑料细胞刮刀在 1&#160;ml 冰冷 PBS 中刮下贴壁细胞，将悬液转移至 1.5&#160;ml 微量离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 下，以 700&#160;x&#160;g 离心 5&#160;min，吸除 PBS。</li>
	<li>每 107 个细胞加入 100 μl 冰冷的细胞质裂解缓冲液（表 1），用移液器吹打混匀。</li>
	<li>冰上孵育 20&#160;min。</li>
	<li>在 4 °C 下，于微量离心机中以最大速度离心 10&#160;min。</li>
	<li>弃去沉淀，将上清液转移至新的 1.5&#160;ml 微量离心管中，置于冰上保存。</li>
	<li>使用 Bradford 法测定蛋白浓度（通常为 1 - 10 μg/μl）23。</li>
	<li>分装后于 -80 °C 保存细胞提取物，直至使用。</li>
</ol>
2. 小鼠肝脏和脾脏蛋白质提取物的制备
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 处死小鼠。</li>
	<li>将已处死的动物置于解剖板上的洁净垫上，用剪刀打开腹腔。</li>
	<li>使用剪刀和镊子分离肝脏和脾脏，并用约 50&#160;ml 冰冷的 PBS 冲洗每种组织。</li>
	<li>立即用解剖刀将组织切成小块（例如：约 1 - 2&#160;mm3）。</li>
	<li>立即将组织块放入新的冻存管中，随后在液氮中速冻。将速冻的组织分装样品储存在 -80 °C 直至使用。</li>
	<li>使用组织匀浆器，在 0.25 - 0.5&#160;ml 冰冷的细胞质裂解缓冲液（表 1）中，对一块冷冻组织（约 1 - 2&#160;mm3）进行匀浆，持续 10&#160;秒。</li>
	<li>将匀浆液转移至 1.5&#160;ml 微量离心管中，在冰上冷却 20&#160;分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下，以最大速度在微量离心机中离心 10&#160;分钟。</li>
	<li>弃去沉淀，将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，保持在冰上。</li>
	<li>使用 Bradford 法测定蛋白质浓度（通常为 1 - 10 μg/μl）23。</li>
	<li>分装细胞提取物，并在 -80 °C 下保存直至使用。</li>
</ol>
3. 放射性标记IRE探针的制备
<ol>
	<li>线性化含 IRE 的质粒 I-12.CAT22 37 °C 下孵育 1 小时&#160;hr 用限制性内切酶 XbaI (1&#160;U/μg 质粒），该酶在 IRE 序列下游进行切割。线性化的质粒将用作后续反应的模板 体外 转录</li>
	<li>设置一个 体外 20 μl 总体积的转录反应。使用下表所示的储存液 表2 加入：1 μl 线性化质粒模板，4 μl 转录缓冲液；1 μl ATP/CTP/GTP 混合物，10 μl [α-32P]-UTP，2 μl 二硫苏糖醇，1 μl RNase抑制剂和1 μl T7 RNA聚合酶。用移液器吹打混匀。</li>
	<li>在 40 °C 下孵育 1 小时&#160;小时24.</li>
</ol>
4. 放射性标记IRE探针的纯化
<ol>
	<li>终止 体外 通过加入1 μl的0.5，进行转录反应&#160;M EDTA，pH&#160;8. 用移液器上下吹打混匀。</li>
	<li>加入10 μl的10&#160;mg/ml tRNA（作为载体以促进沉淀）。用移液器吹打混匀。</li>
	<li>加入82.5 μl的3&#160;M 醋酸铵。涡旋振荡混匀。</li>
	<li>加入 273 μl 乙醇，涡旋混匀。</li>
	<li>室温下静置5分钟&#160;最小</li>
	<li>离心10分钟&#160;室温下用微量离心机以最大速度离心1分钟。弃上清液。</li>
	<li>用100 μl 70%乙醇洗涤沉淀。</li>
	<li>离心10分钟&#160;室温下，使用微量离心机以最大速度离心1分钟。弃上清液。</li>
	<li>空气干燥沉淀物10分钟&#160;最小</li>
	<li>将沉淀重悬于100 μl双蒸、预先高压灭菌的H2O.</li>
	<li>使用液体闪烁计数器测定放射活性，分装放射性标记的 IRE 探针，并于 -80 °C 保存备用。冻存的分装样品可使用长达 3 个月。&#160;周</li>
</ol>
5. EMSA 实验用天然聚丙烯酰胺凝胶的制备
<ol>
	<li>组装凝胶（16 x 16&#160;cm）时使用 1.5&#160;毫米间隔器和梳子</li>
	<li>要制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，使用如下所示的贮存液 表3. 混合 7.5&#160;40% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液 5 ml&#160;5x TBE 溶液 ml 和 37.5&#160;毫升双蒸水2O.</li>
	<li>加入0.5&#160;10% 新鲜配制的过硫酸铵（APS）溶液 1 ml 和四甲基乙二胺（TEMED）25 μl。</li>
	<li>立即倒入丙烯酰胺溶液至凝胶中，使其聚合。等待约30分钟&#160;最小</li>
	<li>组装电泳装置并放入凝胶，向槽内加入0.5x TBE缓冲液，连接电源。</li>
</ol>
6. 电泳迁移率变动分析
<ol>
	<li>用细胞质裂解缓冲液稀释25 μg来自细胞或组织的蛋白提取物（表1) 总体积为10 μl（也可使用较低的蛋白浓度）。保持在冰上。如有需要，加入1 μl 1:4稀释的2-巯基乙醇（2-ME）以激活失活的IRP1（终浓度：2%）25.</li>
	<li>将放射性标记的 IRE 探针用双蒸水稀释20 到 200,000&#160;cpm/μl，95 °C 加热变性 1 分钟&#160;分钟，并在室温下冷却至少5分钟&#160;最小</li>
	<li>通过将1 μl放射性标记的IRE探针加入蛋白提取物中，建立EMSA反应。</li>
	<li>孵育 20 分钟&#160;室温下孵育最小时间。</li>
	<li>加入 1 μl 的 50&#160;加入终浓度为 mg/ml 的肝素以抑制探针与非特异性蛋白的结合9）并继续孵育10分钟&#160;min。将肝素储备液（50&#160;mg/ml）并置于 -80 °C 保存。</li>
	<li>使用长片段放射性标记探针时（&#62;60 个核苷酸），加入 1 μl RNase T1（1&#160;U/μl）并孵育10分钟&#160;室温下孵育数分钟，以减少非特异性蛋白与探针的结合，并有助于电泳过程中RNA/蛋白复合物的更好分离。</li>
	<li>加入3 μl上样缓冲液（80%甘油 + 溴酚蓝），混匀后上样至6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中。</li>
	<li>运行凝胶电泳60分钟&#160;min at 130&#160;V (5&#160;V/cm</li>
	<li>将凝胶转移至一张大滤纸上并干燥。</li>
	<li>曝光于胶片并进行放射自显影显影。曝光时间可从1开始&#160;小时（或更短时间）至过夜。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了一种用于研究IRP1和IRP2的IRE结合活性的实验方案，并展示了代表性数据。通过使用不同的探针，该方案也可调整用于其他RNA结合蛋白的研究。其中关键步骤之一是探针的长度。当结合位点未知时，常使用较长的探针对目标进行检测，但这可能导致RNA/蛋白复合物与游离RNA在迁移率上无明显差异。在此情况下，建议使用RNA酶T1处理以去除未结合的RNA。步骤 6.6）。探针的质量也非常重要。使用新近制备的放射性标记RNA可获得最佳结果。凝胶纯化10 不是必需的，但如果能改善EMSA的外观，则可以采用 体外 用于探针制备的转录反应会产生提前终止产物（若未包含RNA酶T1消化步骤）。原生凝胶电泳运行过快可能导致过热，从而引起RNA/蛋白质复合物解离，产生模糊条带。
通过磷屏成像分析滞留条带的强度，可以获得定量结果。只有当RNA探针过量且不成为RNA结合反应的限制因素时，定量结果才有效。RNA/蛋白质相互作用的亲和力可用解离常数Kd表示，该常数与自由能ΔGo相关，可通过逐步...

EMSA 最初被开发用于研究DNA结合蛋白与靶DNA序列的相互作用1,2。其原理同样适用于RNA/蛋白质相互作用3，这也是本文的重点。简而言之，RNA带负电荷，在非变性聚丙烯酰胺（或琼脂糖）凝胶电泳中会向阳极迁移。RNA在凝胶中的迁移速率取决于其大小，且与其电荷成正比。蛋白质与RNA特异性结合后会改变其迁移速率，导致复合物的迁移速度比游离RNA更慢。这主要归因于分子质量的增加，也可能与电荷和构象的变化有关。使用标记的RNA作为探针，可方便地监测“凝胶阻滞”或“条带迁移”现象。采用32P标记的RNA探针非常普遍，具有高灵敏度。RNA/蛋白质复合物和游离RNA的迁移可通过放射自显影进行检测。但该方法的缺点包括32P的半衰期较短（14.29天）、探针因辐射分解而逐渐降解、需要放射性操作许可及相关基础设施，以及潜在的生物安全问题。因此，已发展出多种非同位素标记RNA探针的方法，例如使用荧光染料或生物素标记，可通过荧光或化学发光成像进行检测4,5。这些方法的局限性在于成本较高，且通常灵敏度低于同位素标记，此外非同位素标记可能干扰RNA/蛋白质相互作用。非变性聚丙烯酰胺凝胶适用于大多数EMSA应用，是常用选择。在某些情况下，琼脂糖凝胶也可用于分析较大的复合物。
EMSA 的主要优势在于其兼具简便性、高灵敏度和稳健性4。该检测可在数小时内完成，且无需复杂的仪器设备。EMSA 能在低至 0.1 nM 或更低的浓度下检测 RNA/蛋白质相互作用，并可在较宽范围的结合条件下进行（pH&#160;4.0 - 9.5，一价盐浓度 1 - 300&#160;mM，温度 0 - 60 °C）。
RNA/蛋白质复合物的形成也可通过滤膜结合实验进行研究。该方法是一种简单、快速且经济的实验技术，其原理基于RNA/蛋白质复合物会被硝酸纤维素滤膜截留，而游离的RNA探针则能通过滤膜6。与凝胶迁移阻滞实验（EMSA）相比，当RNA探针包含多个结合位点，或粗提物中含有多种可结合于同一探针位点的RNA结合蛋白时，滤膜结合实验的应用受到限制。多种RNA/蛋白质相互作用在滤膜结合实验中难以被检测，但可通过EMSA轻松观察到。在某些情况下，即使两种RNA/蛋白质复合物在凝胶中共同迁移（例如人IRP1/IRE和IRP2/IRE复合物），也可通过在EMSA反应中加入针对其中一种RNA结合蛋白的抗体，使复合物在凝胶中的迁移进一步减缓（“超迁移”现象），从而实现区分和可视化7。
电泳迁移率变动分析（EMSA）已被广泛用于研究铁代谢的转录后调控因子IRP1和IRP28-10。它们通过结合到某些mRNA非翻译区（UTR）中进化上保守的发夹结构——即铁响应元件（IRE）发挥作用11。IRE最初在编码铁蛋白12和转铁蛋白受体1（TfR1）13的mRNA中被发现，这两种蛋白分别参与铁的储存与摄取。随后，IRE也在红细胞特异性氨基乙酰丙酸合酶（ALAS2）14、线粒体顺乌头酸酶15、铁转运蛋白16、二价金属转运蛋白1（DMT1）17、缺氧诱导因子2α（HIF2α）18以及其他mRNA中被发现19-21。典型的H链和L链铁蛋白mRNA在其5’ UTR中含有一个IRE，而TfR1 mRNA则在其3’ UTR中含有多个IRE。IRE与IRP的相互作用通过空间位阻阻止43S核糖体亚基与mRNA结合，从而特异性抑制铁蛋白mRNA的翻译；此外，该相互作用还能稳定TfR1 mRNA，防止其被核酸内切酶降解。IRP1和IRP2具有高度的序列相似性，在缺铁细胞中均表现出强烈的IRE结合活性。在富铁细胞中，IRP1会组装一个立方八面体形的Fe-S簇，使其转化为胞质顺乌头酸酶，同时丧失IRE结合能力；而IRP2则通过蛋白酶体途径被降解。因此，IRE/IRP相互作用依赖于细胞内的铁状态，但也受到其他信号分子的调控，如H2O2、一氧化氮（NO）或缺氧。本文描述了利用粗制细胞和组织提取物通过EMSA检测IRE结合活性的实验方案。我们使用了一个通过体外转录从质粒DNA模板（I-12.CAT）生成的32P标记的H链铁蛋白IRE探针，该模板中的IRE序列最初是通过退火合成寡核苷酸的克隆，以正向插入至T7 RNA聚合酶位点下游而构建的22。

<table><tbody><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>SIGMA</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>BioRad 蛋白定量试剂盒</td><td>BIORAD</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>Thermoscientific</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>Invitrogen</td><td>15518-012</td><td></td></tr><tr><td>UTP [alpha-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG507H</td><td></td></tr><tr><td>闪烁液</td><td>Beckman Coulter</td><td>141349</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>SIGMA</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>Thermoscientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>仪器名称</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor</td><td>Qiagen</td><td>9001271</td><td></td></tr><tr><td>闪烁计数器</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi 电泳槽</td><td>BIORAD</td><td>165-1834</td><td></td></tr><tr><td>20 孔梳子</td><td>BIORAD</td><td>165-1868</td><td>1.5 mm 厚</td></tr><tr><td>1.5 mm 间隔器</td><td>BIORAD</td><td>165-1849</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>BIORAD</td><td>164-5070</td><td></td></tr></tbody></table>

研究rna-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动分析（emsa）：以ire/irp为例

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/蛋白质相互作用对于转录后调控通路至关重要。在已知的细胞质RNA结合蛋白中，研究最为清楚的是铁调节蛋白（IRP1和IRP2）。它们可结合到多个靶mRNA非翻译区（UTRs）中的铁反应元件（IREs），从而调控这些mRNA的翻译或稳定性。IRE/IRP相互作用通常通过凝胶迁移阻滞实验（EMSA）进行广泛研究。本文描述了用于分析IRP1和IRP2结合IRE活性的EMSA实验方案，该方法也可推广用于评估其他RNA结合蛋白的活性。将含有RNA结合蛋白的粗制蛋白裂解液或该蛋白的纯化样品，与过量的32 P标记RNA探针共同孵育，以形成复合物。加入肝素以阻止非特异性蛋白与探针的结合。随后，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应混合物。游离探针迁移较快，而RNA/蛋白复合物迁移受阻，因此该方法也被称为“凝胶阻滞”或“条带迁移”实验。电泳完成后，将凝胶干燥，通过放射自显影检测RNA/蛋白复合物及游离探针。本实验方案的总体目标是检测并量化IRE/IRP以及其他RNA/蛋白相互作用。此外，EMSA还可用于确定所研究RNA/蛋白相互作用的特异性、结合亲和力以及化学计量比。

按照方案第3和第4节所述，制备了放射性标记的IRE探针。探针序列为5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGCUUCAAC AGUGCUUGGA CGGAUCCU-3'；其中加粗的核苷酸代表一个未配对的C残基和环状结构，是IRE的关键特征。该探针的比放射性为4.5 × 109 cpm/μg RNA。
为了评估铁水平变化对IRE结合活性的影响，将小鼠RAW264.7巨噬细胞分别置于未处理状态，或用血红素（铁来源）或去铁胺（铁螯合剂）处理。制备细胞裂解液，并使用IRE探针（8,000 cpm/μg蛋白）进行EMSA分析。代表性数据如图1所示，左侧和右侧图分别显示放射自显影的短时间与长时间曝光结果。小鼠IRE/IRP1和IRE/IRP2复合物具有不同的迁移率，在第1泳道中可见两条不同的条带，对应于未处理细胞。铁螯合显著增强了IRP1和IRP2的IRE结合活性（第2泳道），而铁补充则使其减弱（第3泳道）。用2% 2-ME预处理可完全...

本文介绍了一种分析RNA/蛋白质相互作用的实验方案。电泳迁移率变动分析（EMSA）基于RNA/蛋白质复合物与游离RNA在非变性凝胶电泳中迁移速率的差异。通过使用放射性标记的RNA探针，可利用放射自显影技术对RNA/蛋白质复合物进行可视化检测。

研究RNA-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动分析（EMSA）：以IRE/IRP为例

RNA/蛋白质相互作用对转录后调控通路至关重要。在已得到充分表征的细胞质RNA结合蛋白中，铁……

以下实验的总体目标是利用电泳迁移率变动分析法，从细胞提取物中分析RNA与蛋白质的相互作用。该过程首先通过独立步骤制备来自细胞或组织的蛋白质提取物，同时合成并纯化基因特异性的放射性标记RNA探针。随后将蛋白质提取物与标记的RNA探针混合，以促使特异性RNA-蛋白质复合物的形成。最后，将反应产物上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶，通过电泳进行分析，游离RNA探针因其迁移速度较快而与RNA-蛋白质复合物分离。电泳迁移率变动分析（EMSA）被广泛用于研究RNA与蛋白质的相互作用。我们可以利用该方法分析铁调节蛋白IRP1和IRP2与其靶RNA元件的结合情况。但该方法也可用于研究其他RNA结合蛋白。本操作流程将由我实验室的研究助理Dr. Kain Philippine和博士后研究员Dr. Nicole Wilkinson共同演示。对于在培养皿中生长的贴壁细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后加入1毫升预冷的PBS，用塑料细胞刮刀收集细胞。将细胞悬液转移至新的1.5毫升离心管中。将离心管放入预冷的4°C微量离心机中，在低速条件下离心5分钟，然后吸除上清液。细胞将形成位于离心管底部的白色沉淀。每收获 1000 万个细胞，加入 100 微升预冷的细胞质裂解缓冲液。通过反复吹打使细胞沉淀充分悬浮，然后将悬液置于冰上孵育 20 分钟。此步骤可溶解细胞膜，使所有胞质成分释放至缓冲液中。为了分离可溶性胞质组分，将离心管在4°C的离心机中以最大转速离心10分钟，将澄清的上清液转移至冰上预冷的新1.5毫升离心管中，并弃去沉淀。接下来，使用Bradford法测定所得胞质提取物的总蛋白浓度。将胞质提取物分装至较小的离心管中，于-80°C保存备用，用于从新鲜组织制备胞质提取物。将已处死的动物置于解剖板上的洁净垫上，开始收获过程。用剪刀切开腹部，使用剪刀和镊子取出肝脏和脾脏。用约 50 毫升冰冷的 PBS 冲洗每份组织，以防止组织降解。立即用解剖刀将组织切成约 1 至 2 立方毫米的小块，不得延迟。将组织放入新的冻存管中，迅速冷冻。将样品在液氮中速冻。将冻存的组织保存在零下80摄氏度，直至需要时使用。开始制备胞质提取物时，将先前冻存的组织样品转移至含有250至500微升预冷裂解缓冲液的2毫升平底离心管中。将组织匀浆器的探头放入离心管中，并以中等功率开启仪器。匀浆10秒后，立即将离心管置于冰上放置20分钟，以防止蛋白质变性。为分离胞质组分，在4°C离心机中以最大转速离心10分钟，随后将澄清的上清液转移至预冷的1.5毫升离心管中，弃去沉淀。使用 Bradford 法测定所得细胞质提取物的总蛋白浓度。将所得细胞质提取物分装至较小的离心管中，并于负80摄氏度保存，直至使用。在继续本实验方案之前，设置一个配备有机玻璃屏蔽装置和盖革计数器的放射安全工作台。使用细胞计数仪监测实验服上的标签，并配备适当的放射性专用锐器和非锐器废弃物容器。以含有克隆铁反应元件的去线性化质粒DNA作为模板，在室温下用移液器混合模板、反应缓冲液、部分放射性核苷酸和RNA聚合酶，设置20 µL的体外RNA转录反应体系。为启动RNA合成，将样品在40摄氏度孵育一小时。加入一微升0.5摩尔EDTA（pH 8.0）以终止体外转录反应。通过上下吹打混匀EDTA。现在使用标准的醇沉淀方法纯化RNA产物。首先，向合成后的混合物中加入10微升TRNA和82.5微升pH为5.2的3摩尔醋酸钠溶液，然后涡旋混匀。其中TRNA将作为沉淀载体，有助于提高最终RNA的沉淀得率。加入273微升95%至100%的乙醇，通过涡旋振荡混匀。将离心管置于室温下静置10分钟，使沉淀反应进行，从而分离RNA；随后在室温下以最高速度离心10分钟。使用移液器小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀物。沉淀的RNA可能以靠近管底的小白色沉淀块形式存在，也可能肉眼不可见。加入100至500微升70%乙醇洗涤沉淀。在室温下以最高速度离心10分钟，然后打开管盖倾倒弃去上清液。将RNA沉淀在室温下敞口放置10至15分钟以充分干燥。加入100 µL无核酸酶的水重新溶解固态的放射性标记RNA。将RNA溶液置于液体闪烁计数器Eloqua中，以测定放射性核苷酸的掺入程度。将放射性标记的RNA探针分装至小管中，并在负80摄氏度下保存，直至需要时使用。冷冻的分装样品可在三周内使用。在开始电泳迁移率变动分析前，制备一块标准的6%非变性丙烯酰胺凝胶，尺寸至少为16厘米×16厘米，以方便每泳道加载较大的样品体积，并增强该尺寸凝胶的机械稳定性。使用厚度至少为一毫米的玻璃垫片和梳子。开始电泳迁移率变动分析时，将先前冷冻的细胞质裂解液和用于实验蛋白质部分的放射性标记RNA探针在冰上解冻。用细胞质裂解缓冲液将25微克细胞质提取物稀释至终体积为10微升。必要时，向混合物中加入一微升浓度为两摩尔的储备溶液，并将蛋白质样品置于冰上。对于RNA组分，用无核酸酶的水将放射性标记的RNA探针稀释至每微升200,000计数，于95°C加热变性1分钟，然后在室温下冷却至少5分钟。为启动蛋白质与RNA的结合反应，向蛋白质提取物中加入一微升放射性标记的RNA探针，在室温下孵育20分钟以允许结合反应进行。为了提高电泳迁移率偏移实验的特异性，向反应体系中加入一微升肝素储存液。如果放射性标记的 RNA 探针长度超过 60 个核苷酸，则额外加入一微升 RNAs T1。在室温下继续孵育结合反应 10 分钟，以进一步增强特异性，并促进 RNA-蛋白质复合物的更好分离。加入3 µL上样缓冲液，用移液器吹打混匀。然后将整个反应产物上样至6%丙烯酰胺凝胶中，在5 V/cm电压下电泳60分钟。务必使用适当的放射性屏蔽装置覆盖仪器。拆卸凝胶电泳装置，将凝胶转移至一张大的滤纸上。在暗室中使用凝胶干燥真空装置干燥凝胶。将凝胶与滤纸的组合放置在一片之上。曝光后，将胶片显影并晾干。最佳曝光时间可能从一小时到过夜不等。可通过铁含量不同的组织培养细胞，评估IRRP1和IRRP2对放射性IRE探针的铁依赖性结合能力。因此，在先前用去铁胺处理的缺铁细胞中，IRE 结合活性被诱导。相反，在先前用血红素处理的富铁细胞中，IRE 结合活性受到抑制。IRP1 的 IRE 结合活性在铁硫簇组装后丧失，而 IRP2 则发生依赖于铁的降解。IRP1的铁硫簇可被2%的巯基乙醇（2-ME）处理破坏，从而使其失活的IRE结合活性得以检测。IRP2的活性则不能通过2-ME恢复。在接下来的实验中，通过野生型、IRP1基因敲除和IRP2基因敲除小鼠的新鲜肝组织，评估了IRP1和IRP2的IRE结合活性随细胞内铁浓度变化的情况。此处数据显示，给小鼠喂食已知可增加肝脏铁负荷的高铁饮食，会促进野生型小鼠肝脏提取物中IRP1和IRP2的IRE结合活性降低。IRP2与IRE形成的复合物会受到IRP1存在的干扰，但在IRP1基因敲除小鼠的肝脏提取物中，这些复合物可被清晰观察到。此处高铁饮食导致 IRP2 完全失活。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用电泳迁移率变动分析来研究 RNA-蛋白质相互作用。请记住，RNA 探针的质量对实验成功至关重要。

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