凝胶电泳迁移分析（EMSA）为RNA，蛋白质相互作用的研究：IRE / IRP示例

以下实验的总体目标是使用电泳迁移率变化测定法分析细胞提取物中的 RNA 蛋白相互作用。这是通过首先在单独的步骤中从细胞或组织中制备蛋白质提取物来实现的，合成并纯化基因特异性放射性标记的 RNA 探针。然后将蛋白质提取物与标记的 RNA 探针混合，以形成特异性 RNA 蛋白复合物。

最后，将反应产物加载到非变性聚丙烯酰胺凝胶上并通过电泳分析，无需 RNA 探针即可凭借其更快的迁移率从 RNA 蛋白复合物中分离出来。电泳迁移率变化测定法广泛用于分析 RNA 蛋白相互作用。我们可以分析铁调节蛋白 IRP 1 和 IRP 2 与其靶 RNA 元件的结合。

但该方法也可以应用于其他 RNA 结合蛋白的研究，证明该程序将由我实验室的 Kain Philippine 研究助理博士和博士后研究员 Nicole Wilkinson 博士完成，用于在培养皿中生长的粘附细胞。用冰冷的 PBS 洗涤细胞两次，然后加入 1 毫升冰冷的 PBS，并用塑料细胞刮刀收获细胞。将松散的细胞悬液转移到新鲜的 1.5 mL 离心管中。

将试管放入预冷的 4 摄氏度微量离心机中。以低速离心 5 分钟并吸出 sup natant。细胞将在试管底部显示为白色颗粒。

每收获 1000 万个细胞，添加 100 μL 冰冷的细胞质裂解缓冲液。上下吹打数次以松开细胞沉淀，然后将悬浮液在冰上孵育 20 分钟。这将溶解细胞膜并将所有胞质内容物释放到缓冲液中。

为了分离溶解的胞质组分，将试管在 4 摄氏度的离心机中全速旋转 10 分钟，将澄清的 snat 转移到冰上的 1.5 毫升新试管中，然后丢弃沉淀。接下来，使用 Bradford 测定法测定所得细胞质提取物的总蛋白浓度。将所得细胞质提取物分装到更小的试管中，并在零下 80 摄氏度下储存，直到用于从新鲜组织中生产细胞质提取物。

通过将安乐死的动物放在解剖板上的干净垫子上来开始收获过程。用剪刀打开腹部。用剪刀和镊子切除肝脏和脾脏。

用大约 50 毫升冰冷的 PBS 冲洗每个组织，以防止组织降解。立即用手术刀将组织切成大约 1 到 2 立方毫米的小块，不要立即。将组织放入新鲜的冷冻管中并卡住。

在液氮中冷冻样品。将冷冻组织储存在零下 80 摄氏度，直到需要为止。通过将先前冷冻的组织样品转移到含有 250 至 500 μL 冰冷裂解缓冲液的 2 mL 平底试管中，开始制备细胞质提取物。

将组织匀浆器尖端放入试管中，然后以中等功率打开设备。匀浆 10 秒后，立即将试管置于冰上 20 分钟，以防止蛋白质变性。为了分离胞质组分，将试管在 4 摄氏度离心机中全速旋转 10 分钟，将澄清的上清液转移到冰上的 1.5 毫升新试管中，然后丢弃沉淀。

使用 Bradford 测定法测定所得细胞质提取物的总蛋白浓度。将所得的细胞质提取物浸入较小的试管中，并在零下 80 摄氏度下储存，直到需要为止。在继续协议之前，设置一个辐射安全工作台，并配有有机玻璃屏蔽盖革计数器。

做 细胞术监测实验室外套上的标签和适当的辐射特异性锐器和非 sharpp 废物容器。从含有克隆铁反应元件的去线性化 DNA 质粒开始。作为模板，通过在室温下用移液管混合模板反应缓冲液、部分放射性核苷酸和 RNA 聚合酶来设置 20 微升体外 RNA 转录反应。

要开始 RNA 合成，请将样品在 40 摄氏度下孵育 1 小时。通过添加 1 微升 0.5 摩尔 EDTA pH 8.0 终止体外转录反应。通过上下移液混入 EDTA。

现在使用标准醇沉淀方案纯化 RNA 产物。首先，在 pH 值为 5.2 的条件下，向合成后混合物中加入 10 微升 TRNA 和 82.5 微升三摩尔乙酸钠并涡旋。混合 TRNA 将充当沉淀载体，并增加沉淀 RNA 的最终 RNA 产量。

加入 273 微升 95 至 100% 乙醇，涡旋混合。将试管在室温下放在工作台上 10 分钟以分离 RNA，然后在室温离心机中全速旋转试管 10 分钟，以便进行沉淀反应。用移液管小心丢弃上清液，不要干扰沉淀。

沉淀的 RNA 可能以白色小颗粒的形式存在于试管底部附近，也可能是肉眼不可见的。加入 100 至 500 微升 70% 乙醇洗涤沉淀。在室温下全速离心样品 10 分钟，然后盖上盖子倒出 snat。

将试管在工作台上打开 10 至 15 分钟，使 RNA 沉淀物打开干燥。通过添加 100 μL 不含核酸酶的水来重构固体放射性标记的 RNA。通过将 RNA 溶液置于液体 Counter Eloqua 中来量化放射性核苷酸掺入的程度。

放射性标记的 RNA 探针放入较小的试管中，并在零下 80 摄氏度下储存，直到需要为止。冷冻等分试样可在开始电泳迁移率变化测定前使用长达三周，制备至少 16 x 16 厘米大小的标准 6% 非变性丙烯酰胺凝胶，以促进每个泳道的样品量增加。并增强这种大小的凝胶的机械稳定性。

使用至少 1 毫米厚的玻璃垫片和梳子。要开始电泳迁移率变化测定，请在眼睛上解冻先前冷冻的细胞质裂解物和放射性标记的 RNA 探针，以获取实验的蛋白质成分。用细胞质裂解缓冲液稀释 25 μg 细胞质提取物，最终总体积为 10 μL。

需要时，向混合物中加入 1 微升 2 me 储备液，并将蛋白质样品置于冰上。对于 RNA 组分，将放射性标记的 RNA 探针在无核酸酶的水中稀释至每分钟 200， 000 个计数/微升热量，以在 95 摄氏度下使 RNA 自然化 1 分钟，并在室温下冷却溶液至少 5 分钟。为了引发蛋白质 RNA 结合反应，向蛋白质提取物中加入 1 微升放射性标记的 RNA 探针，使其在室温下结合 20 分钟。

为了提高电泳迁移率变化测定的特异性，向反应中加入 1 μL 肝素原液。如果放射性标记的 RNA 探针长度超过 60 个核苷酸，则额外添加 1 微升 RNA T 1。在室温下让结合反应再持续 10 分钟，以进一步增强特异性并更好地分离 RNA 蛋白复合物。

加入 3 微升上样缓冲液，上下移液混合。然后将整个反应物上样到 6% 丙烯酰胺凝胶上，并以每厘米 5 伏特的电压运行凝胶 60 分钟。请务必用适当的辐射屏蔽罩覆盖设备。

拆卸凝胶装置，将凝胶转移到大滤纸上。在暗室中使用凝胶干燥真空装置干燥凝胶。将凝胶和滤纸组合放在一块的顶部。

曝光后的胶片，显影并风干胶片。最佳曝光时间可以从一小时到一夜不等。可以评估 I RRP 1 和 I RRP 2 与铁含量可变的组织培养细胞中放射性 IRE 探针的铁依赖性结合能力。

因此，在先前用 K later deferoxamine 处理的耗铁细胞中诱导 IRE 结合活性。相反，在先前用 heman 处理的载铁细胞中，IRE 结合活性受到抑制。I RRP one 的 IRE 结合活性在铁硫簇组装后丢失，而 I RRP 2 则经历铁依赖性降解。

IRP one 的铁细胞簇可以通过用 2%2 me 处理细胞提取物来破坏，这允许监测其休眠的 IRE 结合活性。I RRP 2 的活性没有被 two me 恢复。在下一个实验中，在野生型 I 型 RRP 1 敲除小鼠和 I RRP 2 敲除小鼠的新鲜肝组织背景下评估 I RRP 1 和 IRP 2 的 IRE 结合活性作为细胞铁浓度的函数。

这里的数据显示，用已知会增加肝脏铁负荷的高铁饮食喂养小鼠会促进野生型小鼠肝脏提取物中 I RRP 1 和 IRP 2 的 IRE 结合活性降低。I rrp 两个 IRE 复合物因 I RRP 1 的存在而偏斜。它们很容易在 I RRP 一基因敲除小鼠的肝脏提取物中显现出来。

在这里，高铁饮食导致 IRP 2 完全失活。观看本视频后，您应该对如何通过电泳迁移率变化分析分析 RNA 蛋白相互作用有了很好的了解。请记住，RNA 探针的质量对于成功至关重要。