סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה כללית לסינתזה של 1, 2-אזבורינים ואת היישום הפוטנציאלי שלה במחקר ביו-רפואי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציגה סינתזה בטוחה של תרכובות 1, 2-אזבורין, שהן בורון מתמזג המכיל איזוסטרים של מוטיב הבנזן הנפוץ בכל מקום. הפרקורסור המתואר יכול להיות פונקציונלי עוד יותר למולקולות מורכבות יותר.

הכנת קומפלקסים של חלבונים עם 1, 2-אזבורין תיתן תובנה מסוימת לגבי יישום עתידי במחקר ביו-רפואי. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את המוצר הסגור בטבעת כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 14 גרם פלדיום על פחמן למוצר מוכן זה בטולואן.

לאחר מכן, הסר את הבקבוק מהקופסה. התקן את הבקבוק עם מעבה ריפלוקס מיובש בתנור 24/40 שטוהר בחנקן ומצויד במים צוננים. מניחים את הבקבוק באמבט שמן, ומחממים את התגובה לריפלוקס נמרץ ב -135 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב.

שמור על התגובה בריפלוקס למשך 16 שעות. לאחר מכן, הסר את הבקבוק מאמבט השמן כדי לקרר את התגובה לטמפרטורת החדר. לאחר שהתקרר, החלף את מעבה הריפלוקס במחיצה על בקבוק התגובה.

בעזרת מזרק המצויד במחט Luer Lock מיובשת בתנור, משוך אליקוט של 5 מיליליטר. העבר את האליקוט לצינור NMR מוברג. נתח את הדגימה באמצעות בורון-11 NMR.

אם התגובה אינה שלמה, העבירו את בקבוק התגובה לתא כפפות. לאחר מכן, הוסיפו שלושה גרם פלדיום נוספים על פחמן. לאחר מכן, הסר את הבקבוק מתא הכפפות.

התקן את הבקבוק עם מעבה ריפלוקס 24/40 שטוהר בחנקן ומצויד במים צוננים. בעזרת אמבט שמן, מחממים את התגובה לריפלוקס נמרץ בחום של 135 מעלות צלזיוס תוך ערבוב במשך 24 שעות. באמצעות בורון-11 NMR, נתח מנה נוספת כדי לוודא שהתגובה הושלמה.

לאחר מכן, העבירו את בקבוק התגובה בחזרה לתא הכפפות. העבירו את תערובת התגובה דרך עמודת כרומטוגרפיה פלאש עמוסה במגבוני נייר. לאחר מכן, אוספים את המסנן לבקבוק תחתון עגול של ליטר אחד המצויד במוט ערבוב.

שוטפים את העמוד עם 50 מיליליטר טולואן. הסר את כלי הסינון מתא הכפפות וחבר אותו לסעפת גז ואקום המצוידת בקו חנקן. הניחו אמבט מים מתחת לבקבוק, ודיואר המכיל חנקן נוזלי כדי ללכוד ממס.

פתח את שסתום הוואקום הגבוה כדי להתחיל בהסרת כל החומרים הנדיפים מהפילטר. לאחר מכן, החזירו את תערובת התגובה לתא הכפפות. מעבירים את התערובת לבקבוק מיובש בתנור 24/40 250 מיליליטר עם מוט ערבוב

שוטפים את תערובת התגובה השיורית עם דיכלורומתאן, ומעבירים אותה לבקבוק. מכסים את הבקבוק במחיצה. העבירו את הבקבוק מתא הכפפות לסעפת הוואקום וחברו אותו.

פתח את שסתום הוואקום הגבוה כדי להסיר את שאריות הממס. לאחר מכן, הסר במהירות את המחיצה והוסף סידן הידריד בעזרת סקופה. חבר את הבקבוק התחתון העגול למנגנון הזיקוק המפורט בפרוטוקול הטקסט, והגדר את טמפרטורת אמבט השמן ל-100 מעלות צלזיוס.

לאחר השלמת הזיקוק, הסר את מקור החום וקרר את המכשיר לטמפרטורת החדר. לחץ מחדש על המנגנון המקורר בחנקן, וסגור היטב את שסתום התקע על בקבוק האחסון נטול האוויר. לאחר העברת המוצר המבודד מהבקבוק לבקבוקון בתא כפפות, אחסן את הבקבוקון במקפיא תא הכפפות.

לאחר טיהור החלבון, העבירו את התמיסה המטוהרת לצינורות קרום דיאליזה. הנח את צינור הדיאליזה בפח המכיל תמיסה של ארבעה ליטר של 100 מילי-מולרי נתרן פוספט, 550 מילי-מולרי נתרן כלורי ו-02% נתרן אזיד. מערבבים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, הוסף 2-מרקפטואתנול לדגימה שעברה דיאליזה, כך שהריכוז הסופי הוא חמישה מילימולר. לאחר מכן, השתמש ברכז צנטריפוגלי כדי לרכז את התמיסה ל-40 מיליגרם למיליליטר. סובב את הדגימה ב-5,000 סל"ד ושש מעלות צלזיוס, והסר את כל המשקעים לאחר הריכוז.

לאחר מכן, בצלחת של 24 בארות, הגדר תנאים שונים עם תמיסת המאגר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש בשומן לאיטום הדוק על ידי מריחתו על קצה כל באר. מערבבים חמישה מיקרוליטר מתמיסת החלבון המרוכזת עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסת מאגר על שקופית כיסוי זכוכית סיליקון.

הנח את מגלשת הכיסוי הפוכה מעל הבארות המכילות תמיסת מאגר. אחסן את הצלחת בחום של 4 מעלות צלזיוס לצמיחת גבישים. בעזרת לולאה של צינורות קריוגניים, בחרו את הגבישים הגדלים והניחו אותם בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 6 מיליליטר.

הוסף 50 מיקרוליטר של משקאות חריפים. לאחר מכן, העבירו את הצינור לתא כפפות. העבירו חמישה מיקרוליטרים של ליגנד האזבורין המוכן לחלק הפנימי של מכסה ההצמדה של הצינור.

מכסים את הצינור ושומרים במקרר בתוך תא הכפפות למשך יומיים עד שבעה ימים לשיווי משקל על ידי דיפוזיה של אדים. לאחר מכן, הפקידו טיפה של N Paratone על מגלשת זכוכית. בעזרת מיקרו פיפטה, העבירו גביש לשקופית.

לאחר מכן, השתמש בלולאה של צינורות קריוגניים כדי לאסוף את הגביש ולהעביר אותו מהתמיסה המימית ל-N Paratone. צללו את הגביש המוגן עם N Paratone לתוך דיואר המכיל חנקן נוזלי. בעזרת מלקחיים קריוגניים, הרכיב את הגביש הקפוא על הלולאה.

לאחר מכן, נתח את נתוני הגביש שנאספו כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, מוצגת סינתזה שונה של 1, 2-אזבורינים על סמך שיטות שדווחו בעבר. בורין תלת-אלל משמש להכנת N-allele NTBSB-allele chloride adduct

רצף דו-שלבי אחד משמש לסינתזה של NTBS BCl 1, 2-azaborine, מה שמביא לתשואה מבודדת גבוהה יותר משיטות קודמות. הסינתזה של N-H-B-ethyl-1, 2-azaborine מתבצעת בשני שלבים, תוך שימוש באתיליתיום במקום קומפלקס כרום ששימש בשיטות שדווחו בעבר. החלבון מטוהר באמצעות מערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך.

כרומטוגרמה של 280 ננומטר מראה שיא התואם את המוטציה T4 Lysozyme, L99am102q. לאחר מכן החלבון מתגבש ומורכב עם ליגנדים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שסינתזת האזבורין דורשת שימושים בתנאים נטולי אוויר, כגון תא כפפות וסעפת גז ואקום, כדי למנוע פירוק של תרכובות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחקור את התכונות הכימיות והפיזיקליות הייחודיות של אזבורינים בהשוואה לארומטיות פחמנית בכיסי שיקום ביולוגיים קלאסיים.