Name: 高通量单细胞的分离和文化的微流体平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学习微流控芯片的单细胞高效分离与培养技术，利用温和液流和重力实现高通量单细胞捕获。该方法可最小化细胞损伤，适用于癌症诊断和细胞异质性研究。

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本工作由国家卫生研究院资助（项目编号：03-A1 BNMP11-014）。

注意：我们微流控器件制造所用的光掩模设计是通过计算机辅助设计（CAD）软件绘制的。随后，这些设计被用于通过商业服务来制作铬光掩模。PDMS 器件采用软光刻技术制备。11
1. 通过光刻法制作母模
<ol>
	<li>在光刻工艺之前12，使用4英寸硅片作为基底，并将硅片置于常规烘箱中于120 °C下脱水10分钟。</li>
	<li>使用等离子清洗机，在100瓦功率下进行30秒的氧气等离子体处理，以清洁已脱水的硅片。</li>
	<li>分别将两块加热板预热至65 °C和95 °C，用于后续的烘烤过程。</li>
	<li>使用旋涂仪在清洁后的硅片上涂覆5 g负性光刻胶（PR）；以1,200 rpm（SU-8 50）旋涂30秒，形成微通道层。</li>
	<li>将涂有光刻胶的硅片置于预热至65 °C的加热板上保持12分钟，随后转移至另一块预热至95 °C的加热板上保持33分钟（适用于100 µm厚的图案），完成软烘过程。</li>
	<li>烘烤完成后，将涂有光刻胶的硅片放置在半自动掩模对准器的样品台上，并与分辨率为25,400 dpi的透明光掩模进行对准。</li>
	<li>将涂有光刻胶的硅片暴露于紫外光（365 nm）下，剂量为500 mJ/cm2，以在硅片上形成光刻胶图案。</li>
	<li>从对准器中取出硅片，并将其放置在加热板上于95 °C下后烘12分钟。</li>
	<li>将硅片浸入SU-8显影液（丙二醇单甲醚醋酸酯，PGMEA）中12分钟，以洗去未交联的光刻胶，随后用氮气轻轻吹干，暴露出对准标记。</li>
	<li>再次使用旋涂仪在硅片上涂覆5 g负性光刻胶；分别以700 rpm（SU-8 100）旋涂30秒形成300 µm厚的图案，以及以1,200 rpm（SU-8 10）旋涂30秒形成27 µm厚的图案，以制备微孔层。</li>
	<li>将涂有光刻胶的硅片置于加热板上，分别在65 °C下保持4分钟、95 °C下保持8分钟（用于27 µm深的捕获孔层）；或在65 °C下保持40分钟、95 °C下保持110分钟（用于300 µm深的培养孔层）。</li>
	<li>冷却后，将涂有光刻胶的硅片放置在配备紫外光源的掩模对准器上。</li>
	<li>将涂有光刻胶的硅片暴露于紫外光（365 nm）下，剂量分别为250 mJ/cm2（用于27 µm厚的图案）和700 mJ/cm2（用于300 µm厚的图案）。</li>
	<li>分别在95 °C下烘烤5分钟（27 µm厚的图案）和30分钟（300 µm厚的图案）。</li>
	<li>分别使用PGMEA清洗6分钟（27 µm厚的图案）和25分钟（300 µm厚的图案），以去除未交联的光刻胶，然后用氮气吹干。</li>
	<li>将硅片放置在扫描激光轮廓仪的xy载物台上，测量硅片上图案特征的高度。
	<ol>
		<li>在20倍物镜下，使用&#34;相机视图&#34;观察模式调节焦平面，使硅片上的图案特征清晰可见。</li>
		<li>将观察模式从&#34;相机视图&#34;切换至&#34;激光视图&#34;，并设定特征的上下位置。</li>
		<li>设置测量模式、区域、质量及z轴步长分别为透明（顶部）、1线（1,024 x 1）、高精度和0.5 µm，然后按下启动按钮开始测量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单细胞分离用PDMS装置的制备
<ol>
	<li>在浇铸PDMS之前，使用三氯硅烷对母模进行硅烷化处理，以形成疏水表面，从而更易于将PDMS复制品从母模上剥离。
	<ol>
		<li>将母模和装有200 µl三氯硅烷的称量舟放入干燥器中，抽真空（-85 kPa）15分钟。</li>
		<li>停止抽真空，然后将母模留在干燥器中，在室温下静置至少1小时，完成硅烷化处理。</li>
		<li>从干燥器中取出母模，并将每个母模放入一个10 cm的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取总量为17.6 g的PDMS聚合物试剂盒（包含基础剂和固化剂），按10:1的比例混合，然后将PDMS倒入培养皿中的母模上。</li>
	<li>将培养皿放入干燥器中，抽真空（-85 kPa）1小时，以去除PDMS中的气泡。</li>
	<li>从干燥器中取出培养皿，放入65 °C的常规烘箱中加热3–6小时，使PDMS固化。</li>
	<li>将固化的PDMS复制品从母模上取下，并使用内径为0.75 mm的打孔器在捕获微孔阵列PDMS复制品的微通道两端打两个孔，作为流体通道的进样口和出样口（图2A）。</li>
	<li>使用胶带清洁PDMS复制品的表面，然后将其放入等离子清洗机中进行短暂的氧气等离子体处理（100瓦，14秒）。</li>
	<li>将PDMS复制品从氧气等离子体处理设备中取出。</li>
	<li>在体视显微镜下手动对齐顶部PDMS复制品（含捕获微孔）和底部PDMS复制品（含培养微孔），并使其接触贴合。</li>
	<li>将对齐后的PDMS复制品放入65 °C烘箱中加热24小时，使PDMS复制品之间实现永久键合，形成最终装置。</li>
	<li>将PDMS装置浸入盛有去离子水（DI水）的容器中，并将容器置于干燥器中抽真空（-85 kPa）15分钟，以去除PDMS装置微通道中的空气。</li>
	<li>将充满DI水的PDMS装置置于组织培养超净台中，使用波长为254 nm的紫外光照射30分钟，对装置进行灭菌。</li>
	<li>将PDMS装置中的DI水替换为含5%牛血清白蛋白（BSA）的1x PBS溶液，并在37 °C孵育30分钟，以防止细胞黏附于PDMS表面。 
	注意：BSA包被对于提高细胞从捕获微孔向培养微孔转移的效率至关重要。</li>
	<li>将PDMS装置中的5% BSA溶液替换为灭菌的1x PBS溶液。</li>
</ol>
3. 单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>在常规细胞培养箱（37 °C、5% CO2 和 95% 湿度）中的培养皿中培养神经干细胞 KT98 以及人癌细胞 A549 和 MDA-MB-435，以准备用于 PDMS 装置的细胞实验。</li>
	<li>移除并弃去培养皿中已使用过的培养基（含 10% 胎牛血清和 1% 抗生素的 DMEM 基础培养基），细胞生长至 70–80% 汇合度。</li>
	<li>用无菌 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
	<li>移除并弃去 PBS，加入 2 ml 具有蛋白水解、胶原酶解和 DNase 活性的重组酶混合液（详细信息请参见材料列表）。</li>
	<li>将培养皿在室温下孵育 5 分钟，然后轻敲培养皿以促进细胞脱落。</li>
	<li>加入 4 ml 无菌 PBS 以分散细胞，随后将细胞悬液转移至 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>以 300 × g 离心 3 分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用 1 ml 无菌 PBS 轻柔重悬细胞沉淀，并采用标准台盼蓝排斥法计数活细胞数量13。 
	注意：此重悬步骤对于制备充分解离的单细胞悬液、提高单细胞分离效率至关重要。</li>
</ol>
4. 单细胞分离与克隆培养
<ol>
	<li>使用手持移液器通过PDMS装置的出口孔，将50 µl浓度为2.2 - 2.5 × 106 个细胞/ml的细胞悬液加入微通道中。 
	注意：加入细胞悬液时，移液器应停留在第一档位并保持稳定，以避免将气泡引入微通道。</li>
	<li>通过入口孔再加入50 µl细胞悬液，使整个微通道均匀充满细胞。</li>
	<li>使用塞子（一段长3 mm、直径1 mm的尼龙鱼线）密封出口孔，以防止进样孔和出样孔处液滴产生的静水压引起液体流动。 
	注意：使用前，塞子已在组织培养罩内经过紫外灭菌处理。</li>
	<li>用1 ml无菌注射器吸取培养基，排出其中的气泡，并将其安装到注射泵上。</li>
	<li>通过23 G钝头针和聚四氟乙烯（PTFE）管，将装有培养基的注射器连接至PDMS装置的入口孔。</li>
	<li>移除出口孔的塞子，静置2分钟，使细胞在重力作用下沉降至单细胞捕获孔中。</li>
	<li>使用注射泵以600 µl/min的流速，用300 µl培养基洗去未被捕获的细胞。</li>
	<li>等待2分钟以稳定装置，然后用塞子密封进样孔和出样孔，形成封闭的培养系统。</li>
	<li>手动翻转装置，将捕获的单细胞转移至培养微孔中。</li>
	<li>将PDMS装置放入100 mm组织培养皿中，并在装置周围加入10 ml无菌PBS，以防止微通道中培养基蒸发。</li>
	<li>将培养皿转移至常规细胞培养孵育箱（37 °C、5% CO2、95%湿度）中，进行单细胞的克隆培养。</li>
</ol>
5. 培养基补充
<ol>
	<li>培养1天后，用新鲜培养基替换PDMS装置中的培养基，以促进细胞增殖。</li>
	<li>在PDMS装置顶部靠近进样口和出样口区域的位置各滴加一滴培养基，以避免在执行下一步操作时将气泡引入微通道。</li>
	<li>在PDMS装置顶部靠近微通道两端的位置打两个孔，作为微通道的进样口和出样口。 
	注意：打孔时不要穿透PDMS装置的两层结构，仅穿透顶部的PDMS层即可。</li>
	<li>将装有新鲜培养基的1 ml塑料注射器通过23 G钝头针和PTFE管连接至进样口。</li>
	<li>以120 µl新鲜培养基在5分钟内流入装置，以替换旧培养基。</li>
	<li>插入两个密封塞封住进样口和出样口，然后将装置放回细胞培养孵育箱。</li>
	<li>在培养期间每2天更换一次培养基，方法是移除密封塞，然后重复步骤5.4至5.5。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

基于微孔的装置系统6,14已被用于单细胞操作与分析，例如大规模单细胞捕获6以及单个造血干细胞增殖15。尽管微孔的尺寸、数量和形状可根据特定应用进行调整，但当微孔尺寸增大时，单细胞分离效率总会受到影响9,15。
为克服这一局限性，Park 等 报道了一种带有三角形微孔的微流控芯片，该芯片具有较高的单细胞捕获率（58.34%），同时扩大了微孔尺寸，以允许细胞铺展和生长。然而，这些微孔（边长约50 µm）仅能支持细胞增殖达2天16。我们的双孔策略使得在大尺寸微孔中进行单细胞加载不再受限于极限稀释法和开放孔系统中所遇到的泊松分布概率问题3，如在尺寸足以支持细胞增殖至少7天的大微孔中实现了高单细胞分离效率（超过75%）所示（图4A）。由于该微流控平台能够通过简单的装置和操作流程高效地完成单细胞分离与克隆培养，我们预计其可成为多种应用中的有力工具，包括通过克隆形成实验筛选肿瘤干细胞17以及药...

目前，将单个细胞单独放置在培养空间中的方法通常采用有限稀释法或荧光激活细胞分选（FACS）。对于许多实验室而言，有限稀释法是一种便捷的方法，因为它仅需要移液器和组织培养板，而这些设备容易获得。在此方法中，细胞悬液被连续稀释至适当的细胞密度，然后使用手动移液器将其加入培养孔中。这些分隔的单细胞随后可用于细胞分析，例如遗传异质性筛选1和克隆形成分析2。然而，该方法通量较低且劳动强度大，若无机械臂辅助则难以提高效率，因为有限稀释法的泊松分布特性限制了单细胞事件的最大概率仅为37%3。配备集成机械臂的FACS仪器可通过精确地逐次将一个单细胞放入培养孔中来克服泊松分布的限制4。然而，较高的机械剪切应力（从而导致细胞活力降低）5以及仪器购置和运行成本，限制了其在许多实验室中的应用。
为克服上述局限性，已开发出微尺度装置，可高效地将单个细胞装载到微孔中6。然而，由于需要将每个微孔的尺寸设计得接近单个细胞的大小，以最大化单细胞装载概率，因此微孔无法为已装载的细胞提供足够的增殖空间。在许多基于细胞的应用中（例如，克隆形成实验7）需要进行培养检测，因此也已采用尺寸更大的微孔（直径或边长为 90 - 650 µm）以支持长期细胞培养。然而，与极限稀释法类似，这些大微孔的单细胞装载效率仍然较低，仅为 10 - 30%8,9。
此前，我们开发了一种高通量微流控平台，可用于将单个细胞分离至独立的微孔中，并已证明该平台在分离细胞的克隆形成实验中的应用价值10。该装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，包含两组具有不同微孔尺寸的微孔阵列，可显著提高将单个细胞加载至远大于细胞尺寸的微孔中的效率。值得注意的是，这种&#34;双孔&#34;设计概念使得培养区域的尺寸能够灵活调节，同时不影响单细胞捕获效率，从而可简便地调整装置设计以适应不同类型的细胞及应用需求。这种高效率方法适用于长期细胞培养实验，有助于细胞异质性研究及单克隆细胞系的建立。

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 软件</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>部件号 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>硅晶圆&amp;nbsp;</td><td>Eltech 公司</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>普通烘箱</td><td>YEONG-SHIN 公司</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>台式等离子处理系统</td></tr><tr><td>SU-8 50 负性光刻胶</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 负性光刻胶</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2&quot; ~ 6&quot;</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>YOTEC 公司</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>掩模对准器</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>丙二醇单甲醚醋酸酯</td></tr><tr><td>扫描激光轮廓仪</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>三氯硅烷</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>十三氟-1,1,2,2-四氢辛基。危险品。对呼吸道具有腐蚀性，遇水剧烈反应。</td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>节省空间型真空干燥器，190&amp;nbsp;mm 白色底座</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 套件</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 打孔器</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>内径 0.75 mm</td></tr><tr><td>可移除胶带</td><td>3M 公司</td><td>Scotch Removable Tape 811</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 基础培养基</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>谷氨酰胺-青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>重组酶混合物</td><td>Innovative cell technology</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) 细胞膜染料</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>用作细胞示踪剂</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>塑料注射器 (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23 号钝头针</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯 (PTFE) 管</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>内径 0.51&amp;nbsp;mm；外径 0.82&amp;nbsp;mm</td></tr></tbody></table>

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

研究单个细胞的异质性对许多生物学问题至关重要，但在技术上具有挑战性。因此，亟需一种简单且高通量的方法来开展单细胞培养实验。本文报道了一种基于微流控芯片的策略，可实现高效的单细胞分离（约77%），并展示了其在长期单细胞培养（长达7天）以及通过克隆形成实验进行细胞异质性分析方面的能力。该方法已在KT98小鼠神经干细胞以及A549和MDA-MB-435人癌细胞中得到验证。通过在微流控通道的顶部和底部使用不同尺寸的微孔阵列，实现了高单细胞分离效率和长期培养能力。其中，小型微孔阵列用于精确分离单个细胞，而大型微孔阵列则用于在微流控芯片内进行单细胞克隆培养。该微流控平台因其可在不降低分离效率的前提下灵活调节细胞培养空间以适应不同的培养策略，成为单细胞培养应用中一种极具吸引力的技术方案。

用于单细胞分离与培养的微流控平台包含一个微通道（高度为 200 µm），该通道内设有两组微孔阵列（图 2A）。这两组微孔阵列分别称为捕获孔（直径 25 µm，深度 27 µm）和培养孔（直径 285 µm，深度 300 µm），分别用于单细胞的分离与培养；从顶视图观察时，每个捕获孔位于对应培养孔的中心位置（图 2B）。该装置的操作流程示意图见图 1，所需设备（注射泵、组织培养孵育箱和显微镜）及耗材（注射器、移液器和管路）均为生物实验室常见配置。此外，该平台具有便携性和透明性，使得在细胞培养实验过程中，可使用常规显微镜对装置内的细胞进行便捷的观察与分析。
洗涤步骤后，捕获孔中细胞的捕获效率范围为 67.80 ± 11.38% 至 85.16 ± 1.91%（取决于细胞类型）（图 3A）。此外，三种细胞类型中大多数捕获孔仅...

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。

研究单个细胞的异质性对许多生物学问题至关重要，但在技术上具有挑战性。因此，亟需一种简单而有效的方法……

本方案的总体目标是展示一种微流控芯片的制备与操作方法，该芯片可实现高效的单细胞分离与培养。该方法为任何需要单细胞分离与培养的领域提供了有用的工具。该技术的主要优势在于，能够高效地将单个细胞加载至大型微孔阵列中。此外，该装置仅利用轻微的流体流动和重力作用进行操作，从而最大限度地减少细胞损伤。该技术的应用前景主要面向癌症等人类疾病的终末期诊断，因为在这些疾病中，细胞异质性会影响细胞的响应。我们在建立微孔细胞系时提出了开发此方法的想法，原因是有限稀释法耗时且效率低下。目前，该方法可为单细胞分析提供新的研究视角。它还可应用于其他领域，例如单个细胞过程与行为的建立及观察时机的确定。首先，采用标准光刻法，按照随附文本方案中所述，制备用于单细胞分离层和微孔培养层的硅烷化母模。对于每个母模，将16克PDMS基质与1.6克固化剂加入一次性杯子中混合，并搅拌至均匀。然后，将主模具放入150毫米的培养皿中，并在模具上方倒入PDMS。将培养皿放入真空干燥器中，抽真空一小时以去除PDMS中的气泡。一小时后，从干燥器中取出培养皿，置于65摄氏度的常规烘箱中加热三至六小时，使PDMS固化。然后，将培养皿从烤箱中取出，使其冷却至室温。冷却后，从母模上剥离固化的PDMS捕获孔阵列和微孔培养阵列，并用刀片切割出器件。接着，在捕获孔阵列层的微通道两端各使用0.75毫米打孔器打一个孔。使用胶带清洁将作为装置内表面的区域，然后将各层内表面朝上放入等离子清洗仪中，进行短暂的氧气等离子体处理。处理完成后，从等离子清洗仪中取出PDMS层，并使用体视显微镜对准并连接装置的顶层与底层。将对齐后的装置置于65摄氏度的烘箱中24小时，使PDMS层之间形成永久性键合。接下来，将键合好的PDMS装置置于去离子水中，并将容器放入真空干燥器中抽真空15分钟，以去除装置微通道中的空气。待装置内空气完全排出后，将PDMS装置转移至组织培养操作台中，用紫外光照射30分钟以对装置表面进行灭菌。随后，将装置中的去离子水替换为含5%牛血清白蛋白的PBS溶液，并在37摄氏度下孵育30分钟。这将封闭表面，并提高捕获孔中分离细胞向培养孔转移的效率。30分钟后，用无菌PBS替换装置中的封闭液。制备浓度为每毫升250万个细胞的单细胞悬液，并用50微升该悬液上样至移液器中。然后，通过装置的出口孔将细胞转移至装置内。再加入50微升细胞悬液，通过入口孔注入装置，使细胞均匀填充整个微通道。加载完成后，使用由直径1毫米的尼龙钓鱼线制成的无菌塞子封闭装置的出口孔。然后，用1毫升无菌注射器吸取培养基，排出任何残留的气泡，并将注射器放入注射泵中。将一个23号钝头针头连接到注射器上，并使用聚四氟乙烯管将针头与装置的入口连接。连接管路后，移除出口孔的塞子，静置两分钟，使细胞在重力作用下沉降至单细胞捕获孔中。接下来，将注射泵设定为 600 微升每分钟。移除出口塞，冲洗未捕获的细胞 30 秒。等待两分钟，使压力稳定。然后将管子从装置的入口处取下，并用塞子封闭入口和出口孔，形成一个封闭的培养系统。接着用手翻转装置，将捕获的单细胞转移至装置另一侧的培养微孔中。随后，将装置放入一个100毫米的组织培养皿中，在装置周围加入10毫升无菌PBS，并将培养皿放入培养箱中。更换培养基时，首先在靠近微通道入口和出口的 PDMS 装置顶部上方各放置两滴培养基，以避免将气泡引入微通道。然后，使用 0.75 毫米活检打孔器从微通道两端附近的 PDMS 装置顶部打两个孔。注意仅穿透装置的顶层即可。接下来，用1毫升塑料注射器吸取新鲜的预热培养基，并使用23号钝头针和聚四氟乙烯（PTFE）管将其连接到新创建的进样口。在五分钟内缓慢注入约120微升新鲜培养基，以替换旧培养基。操作完成后，用两个堵头密封进样口和出样口，并将装置放回细胞培养孵箱中。最终进入捕获孔的细胞数量占总数的68%至85%，具体比例取决于细胞类型。此外，三种细胞类型的大多数捕获孔中仅含有单个细胞。在将捕获的KT98细胞转移至培养孔后，约77%的孔中只有单个细胞，16%的孔中无细胞，6%的孔中有两个细胞，少于1%的孔中含有三个或更多细胞。在为期七天的过程中，分离的单个细胞表现出异质性的生长模式。部分细胞发生增殖，而另一些则未增殖。一旦掌握，若操作得当，该技术可在约20分钟内完成。观看本视频后，您应能够充分了解如何利用这种高通量单细胞分离内分泌培养平台，以提高单细胞实验的工作效率。在操作该流程时，需特别注意避免气泡进入微通道，并防止细胞随时间推移发生聚集。

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