高通量单细胞的分离和文化的微流体平台

该协议的总体目标是演示微流控芯片的制造和作，从而实现高效的单细胞分离和培养。该方法为任何受益于单细胞分离和培养的区域都提供了有用的工具。该技术的主要优点是它可以高效地将单个细胞加载到大型微孔阵列中。

此外，仅使用温和的流动和重力来作该设备，从而最大限度地减少了细胞损伤。这项技术的含义转向了癌症等人类疾病的最终诊断，其中细胞异质性影响细胞的反应，因此我们在建立微孔细胞系时提出了开发这种方法的想法，因为极限稀释法非常耗时且效率低下。现在，这种方法可以提供对单个细胞分析的见解。

它还可以应用于其他应用，例如单个细胞过程和行为的建立和观察时间。首先，使用随附文本协议中描述的标准光刻技术为单细胞分离层和微孔培养层制造硅烷化母模。对于每个母模，将 16 克 PDMS 基料与 1.6 克固化剂混合在一个一次性杯子中，搅拌混合物直至混合。

然后，将母模放入 150 毫米培养皿中，并将 PDMS 倒在模具顶部。将培养皿放入干燥器中，真空 1 小时以去除 PDMS 中的气泡。一小时后，从干燥器中取出盘子，将它们放入 65 摄氏度的传统烤箱中 3 到 6 小时以固化 PDMS。

然后，将盘子从烤箱中取出，让它们冷却至室温。冷却后，从母模中剥离固化的 PDMS 捕获孔阵列和微孔培养阵列，并使用剃须刀片切出设备。接下来，使用 0.75 毫米的冲头在捕获孔阵列层的微通道两端各打一个孔。

使用胶带清洁设备内表面，然后将内表面朝上的各个层放入等离子清洁器中进行短暂的氧气等离子处理。完成后，从等离子体清洁器中取出 PDMS 层，并使用立体显微镜对齐和连接设备的顶层和底层。将对齐的器件放入 65 摄氏度的烘箱中 24 小时，以在 PDMS 层之间形成永久粘合。

接下来，将粘合的 PDMS 设备放入去离子水中，并将容器放入干燥器中真空 15 分钟，以去除设备微通道中的空气。去除设备中的所有空气后，将 PDMS 设备放入组织培养罩中，并使用紫外线对设备表面消毒 30 分钟。接下来，用 PBS 中的 5% 牛血清白蛋白替换设备中的去离子水，并在 37 摄氏度下孵育设备 30 分钟。

这将阻塞表面并提高分离细胞从捕获孔到培养孔的转移效率。30 分钟后，用无菌 PBS 更换装置中的封闭溶液。制备每毫升 250 万个细胞的单细胞悬液，并将 50 微升悬浮液加载到移液管中。

然后，通过设备的出口孔将细胞转移到设备中。再加载 50 微升细胞悬液，并通过入口孔将其转移到设备中，以用细胞均匀地填充整个微通道。加载后，使用由一根直径为一毫米的尼龙钓鱼线制成的无菌塞子密封设备的出口孔。

然后，用培养基填充 1 毫升无菌注射器，喷射任何残留的气泡，并将其放入注射泵中。将 23 号钝针连接到注射器，并使用聚四氟乙烯管将针头连接到设备的入口。连接试管后，从出口孔中取出塞子，等待 2 分钟，让细胞在重力作用下沉降到单个细胞捕获孔中。

接下来，将注射泵设置为每分钟 600 微升。取下出口塞，冲洗掉未捕获的细胞 30 秒。等待 2 分钟，让压力稳定下来。

然后从装置的入口处取出试管，并用塞子密封入口和出口孔，以形成一个封闭的培养系统。现在用手翻转设备，将捕获的单细胞转移到设备另一侧的培养微孔中。然后，将设备放入 100 毫米的组织培养皿中，在设备周围添加 10 毫升无菌 PBS，并将培养皿放入培养箱中。

要更换培养基，首先将两滴培养基放在 PDMS 装置顶部靠近入口和出口的位置，以避免将气泡引入微通道。然后，使用 0.75 毫米活检打孔器从 PDMS 设备顶部靠近微通道末端的地方打两个孔。确保只穿过设备的顶层。

接下来，装满装有新鲜预热培养基的 1 毫升塑料注射器，并使用 23 号钝针和 PTFE 管将其连接到新创建的入口。在 5 分钟内将大约 120 μL 的新鲜培养基缓慢流入设备中，以更换旧培养基。完成后，使用两个塞子密封入口和出口，然后将设备放回细胞培养箱中。

最终进入捕获孔的细胞数量范围约为 68% 至 85%，具体取决于细胞类型。此外，对于所有三种细胞类型，大多数捕获孔仅包含一个细胞。将捕获的 KT98 细胞转移到培养孔后，大约 77% 的孔只有一个细胞，16% 没有细胞，6% 有两个细胞，不到 1% 的孔有三个或更多细胞。

在 7 天的过程中，分离的单细胞表现出异质性生长模式。虽然一些细胞繁殖，但其他细胞没有。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约 20 分钟内完成。

观看此视频后，您应该对如何使用这种高通量单细胞分离内分泌培养平台来提高单细胞实验的生产率有很好的了解。在尝试此过程时，重要的是要记住避免气泡进入微通道，并防止细胞随着时间的推移聚集在一起。