Name: 发展多深的圆形横截面微内皮化的一个芯片的程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T19:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习使用光刻和软光刻技术构建圆形截面微流控芯片，培养人脐静脉内皮细胞形成单层，实现可控连续灌流和实时成像，为微血管研究提供三维仿生平台。

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本研究部分得到了美国国家科学基金会（NSF 1227359）、由国家科学基金会资助的西弗吉尼亚大学EPSCoR项目（EPS-1003907）、由国家科学基金会资助的西弗吉尼亚大学ADVANCE办公室（1007978）以及西弗吉尼亚大学PSCoR项目的支持。微加工工作在西弗吉尼亚大学共享研究设施（洁净室设施）和芯片微流控集成细胞研究实验室（MICRoChip Lab）完成。共聚焦成像在西弗吉尼亚大学显微镜成像设施完成。

1. 光刻法制备光刻胶原模
以下方案展示了制备直径在30-60 μm之间的微通道的过程。若要获得更小直径（小于30 μm）的微通道，需进行一次光刻胶旋涂。
<ol>
	<li>将回流光刻胶从4 °C冰箱转移至洁净室，使用前24小时使其升至室温。</li>
	<li>清洁硅片并在150 °C下烘烤1小时，使其脱水。脱水有助于光刻胶在硅基底上的附着。</li>
	<li>旋涂第一层&#160;使用以下配方涂布光刻胶层：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>时间（秒）</td>
			<td>转速（rpm）</td>
			<td>加速度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>300</td>
			<td>最高</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>最高</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>60</td>
			<td>600</td>
			<td>最高</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>500</td>
			<td>最高</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>10</td>
			<td>600</td>
			<td>最高</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="4">
	<li>然后，将晶圆置于温度为110 °C的热板上烘烤90秒。软烘后，光刻胶的厚度为20–30 μm。</li>
	<li>旋涂第二层&#160;与第一次相同的光刻胶涂覆工艺后的光刻胶层&#160;层</li>
	<li>将晶圆再次置于温度为110 °C的热板上进行前烘，时间为90秒。此次前烘后，光刻胶的厚度将为40–60 μm。</li>
	<li>通过紫外光照射光刻胶，曝光剂量为 14,500 mJ/cm²，生成正性母版图案2 通过薄膜掩模</li>
	<li>将显影液用去离子水（DI水）稀释（体积比1:2）。将硅片在该溶液中反复冲洗，直至图案完全显影。然后&#160;用去离子水清洗晶圆，并用氮气吹干。</li>
	<li>回流：将晶圆置于温度为120 °C的热板上加热4分钟，并用玻璃培养皿覆盖，以防止溶剂蒸发。从热板上取下晶圆，使其冷却至室温。回流后的光刻胶厚度为50–60 μm。</li>
</ol>
2. PDMS 微通道网络的软光刻制作
<ol>
	<li>按质量比10:1（基料：固化剂）配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液，并使用行星式离心混合器充分混合。</li>
	<li>将PDMS溶液浇注到回流后的光刻胶母模上。将浇注好的PDMS放入真空干燥器中脱气15分钟。如有需要，使用氮气去除残留气泡。</li>
	<li>将PDMS置于60 °C烘箱中加热3小时，使其固化。随后将固化的PDMS层从母模上剥离。</li>
	<li>使用锋利的打孔器在通道网络处打孔，以形成进样口和出样口。用氮气清洁PDMS表面。</li>
	<li>将两层PDMS置于等离子清洗仪中，在4.5 × 10-2 Torr的工作压力和3.5 ft3/min的氧气流速条件下进行30秒的氧气等离子体处理。然后在光学显微镜下手动对齐PDMS表面。如有需要，可滴加一滴水以更好地控制对准。</li>
	<li>将器件在60 °C烘箱中加热30分钟，以实现永久键合。</li>
</ol>
3. 芯片中 HUVEC 的培养与接种
<ol>
	<li>使用含L-谷氨酰胺并补充10%胎牛血清（FBS）的培养基培养HUVECs。实验中使用第2至第5代的细胞。</li>
	<li>当HUVECs达到融合状态时，用HEPES缓冲盐溶液（HEPES-BSS）冲洗细胞，然后用胰蛋白酶/EDTA处理，并在37 °C下孵育2-6分钟以消化细胞。消化完成后，加入胰蛋白酶中和液中和胰蛋白酶/EDTA活性。离心后，将细胞重悬于含8%葡聚糖的培养基中。葡聚糖用于增加培养基黏度，以促进细胞更均匀地接种和贴壁。</li>
	<li>将装置置于4.5 × 10-2 Torr的操作压力和3.5 ft3/min的氧气流速下，用氧等离子体处理5分钟。然后&#160;向装置中加入去离子水，并在层流通风生物安全柜中用紫外光照射8小时以进行灭菌。</li>
	<li>在细胞准备就绪前一天，用1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）清洗装置，然后加入纤连蛋白（100 μg/ml，用1× PBS稀释）进行包被，并在4 °C冰箱中孵育过夜。</li>
	<li>完成纤连蛋白包被后，用1× PBS清洗装置，然后加入培养基。将装置在37 °C下孵育15分钟。</li>
	<li>将HUVEC细胞以3-4 × 106 cells/ml的浓度悬浮于含8%葡聚糖的培养基中，取20 μl细胞悬液滴加至装置的一个入口处，并倾斜装置使细胞进入微流控通道。15-20分钟后，细胞将开始贴附于通道侧壁。每隔15分钟旋转一次装置，以实现更均匀的细胞分布。如有必要，可进行额外的加样操作。</li>
</ol>
4. 长期灌注装置
静置培养5-6小时后，贴壁的HUVECs将开始充分铺展。使用可远程控制的注射泵系统建立灌注，保持10 μl/hr的稳定流速。灌注流速可调至更高，并可持续4天至&#160;2周不等。
5. 细胞染色与显微镜表征
<ol>
	<li>当细胞在装置内达到汇合状态时，首先用1×PBS清洗装置，彻底去除培养基。然后将稀释后的红色染料（4 μl-1 ml）加入装置中，染料的加载方式与细胞加载步骤类似。室温下避光孵育5分钟，随后用培养基清洗装置以终止染色。染料长时间孵育可能导致细胞毒性及细胞脱落。</li>
	<li>将蓝色染料用1×PBS稀释后加入装置（每毫升2滴）。室温下避光孵育5分钟，然后用1×PBS彻底清洗装置。</li>
	<li>在倒置光学显微镜下观察细胞染色情况。若染色效果良好，向微通道中加入固定液（3.5%多聚甲醛用1×PBS稀释），随后将整个装置浸入固定液中，并用铝箔完全包裹。将装置置于4 °C冰箱中保存，以防止装置干燥和荧光漂白。固定后的装置即可用于共聚焦成像，可使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

1. 主模具制备
血管形态计量学设计与指导原则之一是著名的 Murray 定律16，该定律指出，血管网络中血管直径的分布遵循最小能量消耗原则。此外，该定律还表明，在分叉处，母血管直径的立方等于其子代血管直径立方之和（<img alt="多项式方程，公式，代数计算，数学概念，立方表达式分析" fo:content-width="0.9in" fo:src="/files/ftp_upload/50771/50771eq1.jpg" src="/files/ftp_upload/50771/50771eq1.jpg" width="100px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1">）19。此外，Poiseuille 定律已被用于估算大多数血管系统中剪切应力的大小，即 <img alt="剪切应力公式 τs=4μQ/πR³，流体动力学方程，机械工程相关" fo:content-width="0.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50771/50771eq2.j...

微血管作为循环系统的一部分，介导血液与组织之间的相互作用，支持代谢活动，决定组织微环境，并在多种生理和病理条件下发挥关键作用。体外重建功能性微血管可为研究复杂的血管现象提供平台。然而，传统的体外微血管检测方法，如内皮细胞迁移实验、内皮细胞成管实验以及大鼠和小鼠主动脉环实验，无法重现体内微血管的三维（3D）结构和连续流动控制1-8。利用动物模型和体内实验（如角膜血管生成实验、鸡胚尿囊膜血管生成实验和Matrigel栓塞实验）进行微血管研究则更加耗时、成本高昂，在观察和定量分析方面存在挑战，并引发伦理问题1, 9-13。
微加工和微流控芯片技术的进步为生物医学研究提供了多种新见解，同时降低了与动物实验和体内研究相关的高昂实验成本和复杂性14，例如可轻松且精确地控制生物条件和动态流体环境，而这些在传统宏观尺度技术下是无法实现的。
在此，我们介绍一种构建内皮化微通道芯片的方法，该芯片可模拟三维几何结构 体内 微血管在受控的连续灌注流条件下运行，通过结合光刻可再流光刻胶技术、软光刻技术和微流控技术实现。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>回流光刻胶</td><td>AZ电子材料</td><td>AZP4620</td><td></td></tr><tr><td>开发者</td><td>AZ电子材料</td><td>AZ 400K</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>道康宁公司</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>NacBlue 细胞核染色</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>PKH 红色染料</td><td>Sigma</td><td>MINI26 和 PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲盐溶液</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶中和液</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 固化剂</td><td>道康宁公司</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>原代人脐静脉内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>稀释液C</td><td>Sigma</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Invitrogen，Molecular Probes</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>95771</td><td></td></tr><tr><td>3.5% 甲醛</td><td>电子显微镜科学</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转器</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>BelArt 产品</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>注射泵系统</td><td>哈佛仪器</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>层流生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1300 系列 A2</td><td></td></tr><tr><td>行星式离心混合器</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-246-516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Invertoskop 40C</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td><td>SP131635</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr></tbody></table>

多深度圆形截面血管内皮化微通道芯片的制备方法

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

研究重点一直集中在开发 体外 用于微血管研究的检测方法，因为 体内 动物实验耗时更长、成本更高，且观察与定量分析极为困难。然而，传统的 体外 微血管实验在表征方面存在局限性 体内 微血管的三维（3D）结构并实现连续流体流动。结合光刻可再流光刻胶技术、软光刻技术和微流控技术，我们开发出一种具有多深度圆形横截面的内皮化微通道芯片，可模拟微血管的三维（3D）结构 在体 微血管在受控的连续灌注流下运行。采用正性可流动光刻胶制作具有半圆形横截面微通道网络的母模。通过将从母模复制的两条聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道对准并键合，形成圆柱形微通道网络。微通道的直径可得到良好控制。此外，在芯片内接种的原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）显示，在持续可控灌注条件下，细胞可在4天至2周的时间内贴附于微通道内表面。

我们构建多深度微通道网络的方法模仿了复杂的三维几何结构 体内 微血管，其中微通道具有圆形横截面15此外，母代分支通道与子代通道的直径大致遵循 Murray 定律，以维持流体流动在所需水平，从而使整个网络的通道阻力较低，且流速更加均匀16-18. 展示了半圆形光刻胶母模和圆形横截面PDMS微通道网络的制备过程与结果 视频 1, 图2，以及 视频 2，分别。PDMS 微通道网络的几何特征经过表征，结果如图所示 图2我们的结果表明，利用光刻胶回流技术可通过更为便捷的方法构建多深度分支通道网络，并能够设计出近似遵循 Murray 定律的微血管仿生系统。
在许多体外（in vitro）模型中，血管细胞通常培养在平面培养板、滤膜或涂有水凝胶的这些基质上。在这些条件下，微血管通过细胞自组装随机形成。此外，传统检测方法在实现内皮细胞上持续稳定灌注方面存在固有困难。缺乏长期且连续的培养基...

一种微通道芯片平台通过结合光刻可重铸光刻胶技术、软光刻技术和微流控技术而开发。该内皮化微通道平台可模拟三维（3D）几何结构 体内 微血管，可在受控的连续灌注流下运行，支持高质量的实时成像&#160;并可应用于微血管研究。

人们一直致力于开发用于微血管研究的体外实验方法，因为体内动物实验更耗时、成本更高，……

本实验的总体目标是在芯片上构建具有多深度圆形横截面的内皮细胞活性微通道，以模拟体内微血管的三维几何结构，并在受控的连续灌注流条件下运行。该目标通过以下步骤实现：首先，采用正性可回流光刻胶，通过光刻技术制备具有半圆形横截面微通道网络的母模；第二步，利用该母模复制出两条聚二甲基硅氧烷微通道，将其对准并键合，从而形成圆柱形微通道网络。接下来，在可控的连续培养基灌注条件下，将原代人脐静脉内皮细胞接种于微通道网络内部，并培养四天至两周。最终，在微通道网络的内表面形成一层融合的细胞单层，通过显微镜下观察到的细胞膜完整性和细胞核排列即可确认。该结构可作为研究复杂血管现象的功能性微血管平台。然而，传统的单个微血管检测方法，如血管生成细胞迁移实验、管状结构形成实验以及周细胞环形成实验，在模拟微血管的三维几何结构和连续流动控制方面存在局限性。我们技术的主要优势，即现有的微加工方法，在于能够常规地制备出具有多深度的微流控通道网络，该网络可模拟体内微血管复杂的三维几何结构，且具有圆形横截面。该方法还允许设计微血管生物磁系统，使其近似遵循更缓慢的流动规律，并维持流体在所需水平，从而使整个通道的阻力较低，且流体损失在整个网络中更加均匀。演示该操作流程的将是我实验室的一名研究生。该流程首先制备一个由光刻胶构成的主模具，其内微通道直径介于30微米至60微米之间，具体步骤详见文本方案：简要而言，需在使用前24小时将光刻胶从4摄氏度的冰箱转移至洁净室，并使其升温至室温。首先，按照文本方案中的步骤，将正性回流光刻胶旋涂到预先清洗的硅基底上。然后，通过带有图案的掩膜对光刻胶进行紫外光曝光，再显影形成图案化的微通道。最后，经过回流处理，形成具有半圆形截面的微通道网络。一旦主模具准备就绪，按10:1的重量比配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液（基础剂与固化剂的比例），并使用行星式离心搅拌机充分混合。将PDMS溶液浇注到回流后的光刻胶主模具上。将浇注好的PDMS置于真空干燥器中15分钟以脱气。如有必要，使用氮气去除残留气泡。将PDMS置于60摄氏度的烘箱中烘烤3小时，使其固化。随后将固化的PDMS层从主模具上取下。使用锋利的打孔器在通道网络上打孔，以形成进样口和出样口。用氮气清洁PDMS表面。将两层PDMS置于等离子清洗仪中，在45 milat的运行压力和每分钟3.5立方英尺的氧气流速条件下，进行30秒的氧气等离子体处理。然后在光学显微镜下手动对齐PDMS表面。必要时可使用一滴水以更好地控制对齐。最后，将装置置于60摄氏度的烘箱中加热30分钟，以实现永久性键合培养。在添加了L-谷氨酰胺并补充10%胎牛血清的培养基中培养原代人脐静脉内皮细胞或VE。将装置置于45毫托的操作压力和3.5立方英尺/分钟的氧气流速下，用氧气等离子体处理5分钟。然后用去离子水加载该装置，并在层流生物安全柜中用紫外光照射8小时以进行灭

procedure-for-development-multi-depth-circular-cross-sectional

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

发展多深的圆形横截面微内皮化的一个芯片的程序

我们介绍一种基于芯片的平台，用于在微型生物反应器中进行细胞的三维培养。一块芯片可容纳多达1000万个细胞，并可在无菌、封闭的循环系统中，对流体流动、氧张力等条件进行精确控制，从而实现细胞培养。...

基于芯片的灌注式微型生物反应器中的三维细胞培养

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

芯片级三维细胞培养支架的微加工

一种在具有微血管尺寸通道的微流控装置整个内部三维表面培养内皮细胞单层的方法&lt;30 μm）被描述。 这一 体外...

用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。...

芯片上内皮炎症表型分析

本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。...

微加工通道中细胞迁移的研究

本文介绍了一种集成电极的器官芯片装置的制备方法，用于直接定量跨内皮细胞电阻（TEER）。为验证该方法，利用该微流控装置模拟了血脑屏障，并对其屏障功能进行了监测。所提出的电极集成与直接TEER定量方法具有广泛的适用性。...

集成电极以直接量化跨内皮电阻的器官芯片系统的构建与验证

目前已有多种方法可用于在聚二甲基硅氧烷微流控器件中制备具有非矩形截面的通道。大多数方法涉及多步制造过程和复杂的对准操作。本文报道了一种通过聚二甲基硅氧烷顺序湿法刻蚀实现不同几何横截面微流控通道制备的单步方法。...

通过连续湿法刻蚀工艺一步法制备不同几何截面的聚二甲基硅氧烷微流控通道

本文介绍一种用于重现器官水平功能的可拉伸双通道器官芯片微流控细胞培养装置的制备方案 体外.

可扩展的可拉伸双通道微流控器官芯片的制备

在此，我们介绍一种利用微加工微流控平台构建三维简化且未分化的皮肤模型的实验方案。通过平行流动方法，可实现 原位 通过注射泵控制，在真皮层隔室上沉积以供上层接种上皮细胞。...

在微加工微流控平台中构建简化的三维皮肤芯片模型

在本方案中，采用了一种仿生微流控检测方法，该方法能够重现生理相关的微血管环境，并完整再现白细胞黏附/迁移级联过程，用于研究炎症疾病中的白细胞-内皮细胞相互作用。...

一种用于研究炎症过程中白细胞与内皮细胞相互作用的微生理系统

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