发展多深的圆形横截面微内皮化的一个芯片的程序

该程序的总体目标是在芯片上开发一个多深度圆形横截面内皮生命微通道，它模拟体内微血管的 3D 几何形状，并在受控的连续融合流下运行。这是通过首先使用正性可回流光刻胶光刻制造具有半圆形横截面微通道网络的母模来实现的。第二步是使用母模复制两个聚二甲基大豆微通道，将它们对齐并粘合以创建一个圆柱形微通道网络。

接下来，将原代人脐静脉内皮细胞置于微通道网络内，然后在受控的连续培养基灌注条件下培养细胞 4 天至 2 周。最终，沿着微通道网络的内表面发育出由膜站立和细胞核在显微镜下站立表示的汇合细胞单层功能微血管的计算，其中可以为研究复杂的血管现象提供平台。然而，传统的单个微血管测定，如anso细胞迁移测定，以及两个形成测定，以及右和mos tic环测定仅限于在三维几何形状和连续流量控制方面重建单个微血管。

我们的技术，即我们现有的微纳加工方法的主要优势在于，它可以传统地制造一个多深度微流体通道网络，该网络模拟具有圆形横截面的体内微血管的复杂 3D 几何形状。它还允许设计微血管生物磁性系统，该系统大约服从更慢的速度并将流体流动保持在所需的水平，以便整体通道阻力较低，并且我们损失的流动在整个网络中更加均匀，证明该程序将是我实验室的研究生。该程序从制造光刻胶母模开始，该模具由直径在 30 微米和 60 微米之间的微通道组成，如文本协议中所述，在使用前 24 小时将回流光刻胶从 4 摄氏度的冰箱短暂转移到洁净室中，并使其升温至室温。

首先按照文本协议中的程序将正性回流光刻胶层旋涂到预清洁的硅衬底上。然后通过图案掩模将光刻胶暴露在紫外线下，然后再显影图案化的微通道。最后，在回流焊后，创建一个半圆形横截面微通道网络。

母模准备好后，以 10 比 1 碱与固化剂的重量比制备聚甲基索烷或 PDMS 溶液，并使用行星离心混合器充分混合。将 PDMS 溶液浇注到回流光刻胶母模上。将铸造的 PDMS 置于干燥物中 15 分钟以浸泡给 Degas。

如有必要，使用氮气去除任何残留的气泡。将 PDMS 放入 60 摄氏度的烤箱中烘烤 3 小时，使其固化。然后从母模中取出固化的 PDMS 层。

使用锋利的冲孔器通过在通道网络中冲孔来创建入口和出口孔。使用氮气清洁 PDMS 表面。在等离子清洗机中，以 45 milato 的工作压力和 3.5 立方英尺/分钟的氧气流速，用氧气等离子体处理两层 PDMS 层 30 秒。

然后在光学显微镜下手动对齐 PDMS 的表面。如有必要，使用一滴水以更好地控制对齐。最后，将设备在 60 摄氏度的烘箱中烘烤 30 分钟，以实现永久粘合培养。

原代人脐静脉内皮细胞或培养基中的 VE，其中含有补充有 10% 胎牛血清的 L-谷氨酰胺。用氧气等离子体处理设备 5 分钟，工作压力为 45 milit，氧气流速为每分钟 3.5 立方英尺。然后用去离子水加载设备，并在层流生物安全罩中用紫外线处理 8 小时以进行灭菌。

在细胞准备好前一天，用 1 x 磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤设备，然后涂上纤连蛋白。在 4 摄氏度的冰箱中孵育过夜。一旦细胞汇合，首先用堆缓冲盐水溶液冲洗细胞，然后在添加胰蛋白酶后用胰蛋白酶 EDTA 处理细胞，以收获它们。

将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 到 6 分钟。胰蛋白酶完成后，用 tripsin 中和溶液中和 tripsin EDTA。对细胞进行计数，然后在复苏前离心它们。

悬浮在含有 8% 糊精的培养基中糊精用于增加培养基粘度，以帮助在 FI enc ENC 涂层后更好地定位和附着细胞。用一个 XPBS 清洗设备，然后用培养基加载设备，然后在 37 摄氏度的温度下孵育 15 分钟。接下来，将浓度为每毫升 3 至 400 万个细胞的 8% 糊精培养基中的细胞加载到装置中。

将 20 μL 细胞液滴放在设备的一个入口处，并倾斜它以将细胞引入微流体通道。15 至 20 分钟后，细胞将开始附着在通道的侧壁上。每 15 分钟旋转一次设备，以创建更均匀的细胞分布。

如有必要，可以执行额外的加载。静态培养 5 到 6 小时后，贴壁细胞将开始完全扩散。使用每小时 10 微升稳定流量的遥控注射泵系统设置长期灌注，灌注可以调整为更高的流速，并且可以持续 4 天到 2 周。

当细胞在设备内汇合时，首先，用一个 XPBS 清洗设备以彻底去除培养基。然后将设备在室温下避光孵育 5 分钟后，用稀释的红色染料加载设备。用培养基洗涤以停止染色。

染料长时间孵育可引起细胞毒性和 dis 粘附。然后用一种 XPBS 稀释的蓝色染料装入设备，在室温下避光孵育 5 分钟，然后用 1 个 XPBS 彻底清洗设备。在倒置光学显微镜下检查细胞染色。

如果染色良好，用固定介质加载微通道，然后将设备浸入固定介质中并用铝箔完全覆盖。将设备存放在 4 摄氏度的冰箱中，以防止设备变干和漂白，固定的设备现在可以进行共聚焦成像，这可以通过激光扫描共聚焦显微镜、扫描电子显微镜和光学显微镜来完成。用于表征回流焊之前和之后的回流光刻胶和复制的 PDMS 通道。

本文对 PDMS 微通道网络的几何特征进行了表征和演示。PDMS 模具的圆形横截面显示每个分支级别的槽钢尺寸。结果表明，光刻胶回流技术可以通过光刻胶回流技术以更方便的方式创建多深度分支通道网络，并允许设计微血管仿生系统，这近似服从默里定律，这里显示的是荧光细胞膜染料的显微镜图像红色和细胞核染料蓝色。

圆形横截面图显示，VE 在不同分支区域的圆柱形微通道网络的内表面排列。由于体内微脉管系统的几何形状复杂，因此很难实时监测这些小血管。开发的基于 P DM S 的芯片具有良好的光学特性，并允许对内皮微通道进行高质量和实时成像，如这部沿圆形通道网络的细胞衬里共聚焦电影所示。

看完这个视频后，你应该对如何为这种质量模式制造回流焊有很好的了解。创建圆形横截面 PDMS 微通道网络，将内膜细胞加载到设备中，并设置长期培养基充集。总之，开发的芯片上 endo 序列化微通道提供了一种快速且可重复的方法来创建圆形横截面多深度微通道网络，它模拟了 InVivo 微血管的几何形状。

该程序说明了利用先进微制造和微食品技术中的独特能力来创建具有长期连续灌注控制的微血管模型，以及高质量和实时成像能力，以及微食品通道在细胞生物学、组织工程和生物工程应用中的日益实用性。芯片上的 endo 序列化微通道是微血管研究的潜在论文。