大鼠电癫痫发作与海马的分离检测突触后密度蛋白的变化

电对流癫痫发作诱导和随后的海马小规模分割的总体目标是在大鼠大脑中诱导整体癫痫发作活动，并检查癫痫发作活动诱导的海马突触后密度蛋白质的改变。这种方法可以帮助回答电影神经过程中的关键问题，例如癫痫发作时特定大脑区域调节哪些 snaptic 蛋白，以及这种调节是否有助于神经可塑性。这种电休克癫痫发作诱导方案的主要优点是我们可以活泼地诱导 law-dons 大脑活动的 lo-bal 升高，而不会发生神经元死亡。

演示该程序的是我和 Hee Jung Chung 博士实验室的 Han Gil Jeong。要开始此过程，请将雄性大鼠放入带盖的干净、空笼中。让大鼠适应 30 分钟，然后设置脉冲发生器以进行 ECS 诱导。

按下重置按钮准备脉冲发生器，并确保准备按钮亮起。确保耳夹未连接到脉冲发生器。接下来，按住电击按钮几秒钟，然后将耳夹插入脉冲发生器。

在此步骤中，用无菌生理盐水润湿耳夹并确保它们已饱和。接下来，用浸泡盐水的纱布包裹无菌盐水弄湿大鼠的耳朵。一旦它们弄湿了，就取下纱布。

将夹子以每只耳朵一个夹子的形式连接到耳朵上，并将它们放置在主软骨带之外。按住电击按钮几秒钟并观察癫痫发作。对于假手术，没有癫痫发作控制，对大鼠进行相同的治疗，但不要输送电流。

阵挛开始时，断开耳夹并根据修订后的 1 到 5 的拉辛量表记录癫痫发作行为。这包括在第四阶段用四肢阵挛饲养，以及在第五阶段用四肢阵挛饲养和跌倒。癫痫发作应持续约 10 秒。

使用计时器记录癫痫发作持续时间。癫痫发作终止后，将大鼠放回其家笼中。再监测大鼠五分钟，以确保它从癫痫发作中恢复过来。

将其单独存放在笼子里，然后将笼子放回恢复室。在此过程中，将一只大鼠的两个海马体放在 30 毫米的组织培养皿上，然后用剪刀将它们切成小块。之后，将切碎的海马体转移到手动玻璃匀浆器中，并加入 1 毫升冰冷均质缓冲液。

接下来，将圆果胶插入玻璃均质器中。当玻璃匀浆器在冰上时，轻轻而稳定地在小块上下划动，持续 1 分钟 10 至 15 次，直到小块海马组织消失。然后，使用 1 mile 移液管将匀浆转移到 1.7 milometer 微量离心管中，并在 4 摄氏度下以 800 倍 G 离心匀浆 10 分钟，以将核后上清液与含有不溶性组织和细胞核的沉淀分离。

然后，将 50 μL 和 950 μL 的 S1 馏分转移到两个单独的新 1.7 mL 微量离心管中，并将这些管储存在冰上。另外，将 P1 馏分沉淀保存在冰上。随后，将 950 μL S1 组分在 13、800 倍 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，以分离富含胞质可溶质蛋白的上清液和富含膜结合蛋白（包括突触体蛋白）的沉淀。

将 S2 级分转移到新的 1.7 ml 微量离心机中并储存在冰上。之后，将 P2 馏分沉淀重悬于 498 微升冰冷的纯净水中。加入 2 微升 1 摩尔 heeps 以达到 4 毫摩尔 heeps 的最终浓度。

将悬浮液在 4 摄氏度下搅拌孵育 30 分钟。30 分钟后，将重悬的 P2 馏分储存在冰上。在该步骤中，将 P2 组分以 25， 000 倍 G 和 4 摄氏度离心 20 分钟，以分离裂解的上清液和裂解的沉淀。

将 LS2 级分转移到新的 1.7 毫升微量离心管中并储存在冰上。然后，以 50 毫摩尔的 heeps 将 LP1 沉淀重悬于 250 μL 中，与 250 μL 的 1% 去污剂和 1 X PBS 混合。将悬浮液在 4 摄氏度下孵育，轻轻搅拌 15 分钟。

然后，将重悬的 LP1 沉淀在 25， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 3 小时，以分离非 PSD 馏分上清液和 PSD 馏分沉淀。将上清液去除到 1.7 毫升微量离心管中，并将 PSD 沉淀重悬于 100 微升 50 毫摩尔的 heeps 中。在该图中，代表性蛋白质印迹显示了 NMDA 受体亚基 GluN2B 、 ampa 受体、GluA2 和 STEP 61 在假大鼠、无癫痫发作大鼠和接受急性 ECS 的大鼠海马体的 S2、P2 和 PSD 组分中的蛋白表达。

细胞质可溶性蛋白 α-微管蛋白富含 S2 组分。突触素是一种突触前囊泡蛋白，在粗膜 P2 组分中富集，但不在 PSD 组分中富集，而 PSD-95 在 P2 和 PSD 组分中富集。此处显示的是急性 ECS 后 3 小时和 24 小时P2 和 PSD 组分中 GluN2B 和 GluA2 的定量。

P2 级分中的 GluN2B 和 GluA2 表达被归一化为 S2 级分中的 α-微管蛋白。在 PSD 级分中的 GluN2B 和 GluA2 表达中，在 PSD 级分中被归一化为 PSD 95。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 5 到 6 小时内完成。

按照此程序，可以执行基于蛋白质混合物的自动质量器（如质量、光谱测定）以回答其他问题，即 ECS 改变了哪些其他突触蛋白。开发后，这项技术为神经系统疾病领域的研究人员探索突触功能障碍的潜在机制铺平了道路，以便进行神经系统疾病的 law-dons 行为，即转换电机。观看此视频后，您应该对如何在 law-dons 中诱导 ECS、从海马进行均质化和 PSD 分离以及检查 ECS 后突触蛋白的改变有一个很好的了解。